Assemblea e monitoraggio dello sviluppo microbico della comunità all'interno di una piattaforma di array Microwell

Summary

Lo sviluppo delle comunità microbiche dipende da una combinazione di fattori, tra cui l'architettura ambientale, l'abbondanza dei membri, i tratti e le interazioni. Questo protocollo descrive un ambiente sintetico e microfabbricato per il monitoraggio simultaneo di migliaia di comunità contenute nei pozzetti di femtoliter, in cui si possono approssimare fattori chiave come la dimensione e il confinamento di nicchia.

Abstract

Lo sviluppo delle comunità microbiche dipende da una combinazione di fattori deterministici e stochastici complessi che possono alterare drasticamente la distribuzione spaziale e le attività dei membri della comunità. Abbiamo sviluppato una piattaforma di array microwell che può essere utilizzata per assemblare e monitorare rapidamente migliaia di comunità batteriche in parallelo. Questo protocollo evidenzia l'utilità della piattaforma e descrive il suo utilizzo per monitorare ottimamente lo sviluppo di semplici comunità a due componenti all'interno di un insieme di array all'interno della piattaforma. Questa dimostrazione utilizza due mutanti di Pseudomonas aeruginosa , parte di una serie di mutanti sviluppati per studiare la patogenicità della secrezione di tipo VI. Gli inserti cromosomici di geni mCherry o GFP facilitano l'espressione costitutiva di proteine ​​fluorescenti con distinte lunghezze d'onda di emissione che possono essere utilizzate per monitorare l'abbondanza e la posizione del membro della comunità all'interno di ciascuna microssacca. Questo protocollo descrive un metodo dettagliatoD per l'assemblaggio di miscele di batteri nei pozzetti dell'array e utilizzando l'imaging di fluorescenza a tempo intervallo e l'analisi quantitativa delle immagini per misurare la crescita relativa di ciascuna popolazione membro nel tempo. La semina e l'assemblaggio della piattaforma microwell, le procedure di imaging necessarie per l'analisi quantitativa delle comunità microbiche all'interno dell'array e i metodi che possono essere utilizzati per rivelare le interazioni tra le specie di specie microbiche tutte discusse.

Introduction

Le comunità microbiche sono formate da fattori deterministici come la struttura dell'ambiente e processi stocastici associati a morte cellulare, divisione, concentrazione proteica, numero di organelli e mutazione ¹ . All'interno dell'ambiente naturale, può essere quasi impossibile analizzare l'impatto individuale di tali influenze sulla composizione e l'attività della comunità. Oscurati da strutture naturali e sepolte in un ambiente chimico e biologico, identificare i membri della comunità e risolvere ulteriormente la loro distribuzione spaziale nell'ambiente naturale è estremamente impegnativo. Tuttavia, gli sforzi rec....

Protocol

1. Fabbricazione Silicon Microwell-array

1. Rivestimento di Parylene
   1. Depurare tra 1-1,5 μm di parilene N su piastre di silicio usando un sistema di rivestimento di parilene disponibile in commercio secondo le specifiche e le istruzioni del produttore (impostazioni: set point vaporizzatore = 160 ° C; punto di forno = 650 ° C).
      NOTA: Circa 6 g di parilene N caricato in una camera porta i rivestimenti di spessore di 1-1,5 μm.
2. fotolitografia
   1. Spin-coat le polveri N-rivestite di parilene con promotore di adesione, 20% di esametildisilazano (HMDS) e 80% di acetato di monometil etere di prop....

Results

La piattaforma sperimentale qui presentata è progettata per studi di alta percentuale e ad alto contenuto di comunità batteriche. Il progetto consente di analizzare contemporaneamente migliaia di comunità, che crescono nei pozzi di varie dimensioni. Con questo disegno di array microwell, è possibile determinare la dipendenza della composizione finale della comunità sulle densità iniziali di semina, dimensione e ambiente chimico. Questo lavoro dimostra la crescita di una comunità a due me.......

Discussion

In questo articolo è stato presentato un dispositivo a matrice microwell e protocolli sperimentali progettati per consentire l'analisi basata su immagini basate su immagini viventi ad alta percentuale e ad alto contenuto di sviluppo della comunità batterica. Mentre il fuoco della dimostrazione è stato quello di studiare gli effetti della secrezione di tipo VI mediata dal contatto sullo sviluppo della comunità, gli array sono stati progettati per essere flessibili e ospitare lo studio di un'ampia gamma di comunit.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistemi di rivestimento speciali	Parylene N	CAS NO.: 1633-22-3
di rivestimento speciali	rivestimento in parylene	Labcoter 2 Unità di deposizione PDS2010
wafer di silicio	WRS Materiali	diametro 100 mm, 500-550 &; m di spessore, Prime, resistività 10-20, N/Phos< 100>,
promotore di adesione	Shin-Etsu Microsci	MicroPrime P20 promotore
tono positivo fotoresist	Rohm and Haas Electronics Materials LLC (di proprietà di Dow)	Microposit S1818 Positive Photoresist (codice 10018357)
Quintel Contact Aligner	Neutronix Quintel Corp	NXQ 7500 Mask Aligner
Reactive Ion Etching Tool	Oxford Strumenti	Plasmalab System 100 Incisore
R2A Brodo	TEKnova	R0005
Albumina sierica bovina	Sigma	A9647
Lettore di piastre multimodale	Perkin Elmer	Enspire, 2300-0000
Microscopio fluorescente	Nikon	Eclipse Ti-U
Tavolino automatizzato	Prior	ProScan III
Telecamera CCD	Nikon	DS-QiMc
Camera di controllo ambientale Stage-top	In Vivo Scientific	STEV ECU-HOC
Soluzione salina tamponata con fosfato	ThermoFisher Scientific	14190144
Agarosio ultrapuro	ThermoFisher Scientific	16500500
25 x 75 mm N. 1.5 vetrino coprioggetti	Nexterion	Alte prestazioni #1.5H vetrini coprioggetti
Vetrini di riferimento a fluorescenza	Ted Pella	2273
Stilo fisico Profilometro	KLA Tencor	P-6
salviette da laboratorio	Kimberly Clark	Kimipe KIMTECH SCIENCE Marca, 34155
software commerciale	Nikon	NIS Elements
Zeiss 710 Microscopio confocale	Zeiss
cubetti filtranti	Nikon	Nikon FITC (96311), Nikon Texas Red(96313)