Qui viene dimostrato come può essere utilizzato il test di Ligation Proximity (PLA) in situ per rilevare e visualizzare le interazioni proteiche-proteiche dirette tra ATM e p53 nelle colture di cellule di sospensione esposte a stress genotossico.
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Articolo metodologico
Rilevamento e visualizzazione di complessi proteici indotti da danni a DNA nelle cellule di cellule di sospensione utilizzando il test di legatura di prossimità
In questo articolo
Sommario
Abstract
La risposta al danno del DNA orchestra la riparazione delle lesioni del DNA che si verificano spontaneamente, sono causate da stress genotossico o appaiono nel contesto di interruzioni del DNA programmate nei linfociti. Tra le prime che sono attivate dopo l'induzione del danno del DNA, sono state individuate le chinasi mutanti (ATM) di Ataxia-Telangiectasia mutata (ATM), kinasi ATM- e Rad3-correlata (ATR) e la subunità catalitica della proteina-chinasi dipendente dal DNA (DNA-PKcs) Regolatori centrali di una rete che controlla la riparazione del DNA, l'apoptosi e la sopravvivenza cellulare. Come parte di un percorso che sopprime il tumore, ATM e ATR attivano la p53 attraverso la fosforilazione, regolando così l'attività trascrizionale della p53. Il danno del DNA provoca anche la formazione di cosiddetti foci indotti da radiazioni ionizzanti (IRIF) che rappresentano complessi di sensori di danni del DNA e proteine di riparazione che si accumulano nei siti di danni del DNA, visualizzati mediante microscopia a fluorescenza. La co-localizzazione delle proteine in IRIF, tuttavia, non implica necessariamente dLe interazioni proteiche proteiche, in quanto la risoluzione della microscopia a fluorescenza è limitata.
In locazione Proximity Ligation Assay (PLA) è una tecnica innovativa che consente la visualizzazione diretta delle interazioni proteico-proteiche in cellule e tessuti con specificità e sensibilità senza precedenti. Questa tecnica si basa sulla prossimità spaziale di anticorpi specifici legati alle proteine di interesse. Quando le proteine interrogate sono all'interno di ~ 40 nm una reazione di amplificazione viene innescato da oligonucleotidi che sono coniugati agli anticorpi e il prodotto di amplificazione è visualizzato mediante etichettatura fluorescente, dando un segnale che corrisponde alla localizzazione subcellulare delle proteine interagenti. Utilizzando l'interazione funzionale stabilita tra ATM e p53, è qui dimostrato come il PLA possa essere utilizzato nelle colture di cellule di sospensione per studiare le interazioni dirette tra le proteine che costituiscono parte integrante della risposta del danno del DNA.
Introduzione
Il danno del DNA innesca una serie altamente regolamentata di eventi che coinvolgono le interazioni proteico-proteiche e le modificazioni post-traslazionali che garantiscono una riparazione efficiente e rapida del DNA, salvaguardando così l'integrità genomica 1 . In genere, la riparazione del DNA viene studiata in cellule esposte a radiazioni ionizzanti monitorando la formazione di cosiddetti foci indotti da radiazioni ionizzanti (IRIF) mediante microscopia a fluorescenza (confocale). Molte protezioni del DNA e proteine che danno i danni del DNA formano IRIFs, che rappresentano complessi proteici che nucleate nei siti di cromatin che sos....
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Protocollo
1. Trattamento delle cellule e dell'induzione del danno del DNA
- Coltivare la linfoblastica acuta linfoblastica BV173 o SUP-B15 umana in IMDM integrata con 20% FCS, 50 μM β-mercaptoetanolo, 2 mM L-glutamina, 100 U / mL penicillina e 100 μg / mL streptomicina a 37 ° C in atmosfera di 5% CO 2 . Contare le cellule e la piastra a 2 x 10 6 cellule / mL in piatti a 6 pozzetti, a 5 mL / pozzetto.
NOTA: Opzionalmente, le linee cellulari di sospensione di diversa origine possono essere utilizzate. - Per arrestare le cellule BCR-ABL + B-ALL nella fase G1 del ciclo cellulare, aggiungere 5 μM di metanesolfonato imatinib ....
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Risultati
La fosforilazione del p53 al residuo Ser15 è risultata dipendente dall'attività di ATM kinasi 16 . Per dimostrare e confermare la specificità della tecnica PLA sulle preparazioni citospiniche di colture di cellule di sospensione, si è dimostrato che l'induzione del danno del DNA mediante trattamento a 2 ore di NCS di cellule BCR-ABL + B-ALL arrestate nella fase G1 del ciclo cellulare Ha determinato l'interazione specifica tra ATM e fosfo-Ser15-p53,.......
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Discussione
In questa relazione, è dimostrato che PLA può essere utilizzato per determinare e visualizzare l'interazione specifica tra le proteine nelle colture di cellule di sospensione. Da notare, il protocollo descritto qui non è limitato allo studio dei complessi di riparazione del DNA ma si applica anche per visualizzare e quantificare altre interazioni proteine-proteine nelle colture cellulari di sospensione. Si è dimostrato che l'ATM kinasi interagisce con p53 fosforilato nelle cellule BCR-ABL + B-ALL.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
La ricerca nel laboratorio di Guikema è finanziata dal programma Innovative Research Incentives dell'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (convalida VIDI 016126355) e dal progetto "Stichting Kinderen Kankervrij 'KiKA (progetto 252).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BV173 cell line | DSMZ | AC-20 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| SUP-B15 cell line | DSMZ | ACC-389 | BCR-ABL+ B-ALL cell line |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco (Life Technologies) | 21980-032 | |
| Fetal Calf Serum | Sigma Aldrich | F7524 | lot #: 064M3396 |
| L-glutamine | Gibco (Life Technologies) | 25030-024 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 15140-122 | |
| imatinib methanesulfonate | LC Laboratories | I-5508 | Dissolve in DMSO, prepare 10 mM stock solution |
| neocarzinostatin | Sigma Aldrich | N9162 | Mutagenic/teratogenic, handle with care |
| KU55933 | Selleckchem | S1092 | Dissolve in DMSO, prepare 5 mM stock solution |
| Starfrost Microscopy Slides | Waldemar Knittel | VA11200 003FKB | |
| PAP pen liquid blocker | Sigma Aldrich | Z377821-1EA | |
| Cytospin funnel | Q Path Labonord SAS | 003411324 | |
| Duolink In Situ Red Starter Kit Goat/Rabbit | Sigma Aldrich | DUO92105 | Available for different species/combinations, also available in FarRED, Orange and Green |
| goat-anti-ATM | Bethyl Laboratories | A300-136A | PLA-grade; we succesfully used lot#A300-136A-1 in our studies |
| rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 | Cell Signaling Technology | 9284 | We succesfully used lot #9284-4 in our studies |
| Vectashield antifading mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Vectashield antifading mounting medium | Vector Labs | H-1000 | |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Also available from various other vendors |
Riferimenti
- Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716 (2013).
- Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites.
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Ristampe e permessi
