L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare la preparazione, la cultura, il trattamento e l'immunostaining di esplosivi cochleari murine neonatali. La tecnica può essere utilizzata come uno strumento di screening in vitro nella ricerca uditiva.
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Articolo metodologico
Neonatal Murine Cochlear Explant Technique come un
In questo articolo
Sommario
Abstract
Mentre negli ultimi decenni sono stati notevoli progressi nella ricerca uditiva, non esiste ancora cura per la perdita di udito sensoriale (SNHL), una condizione che tipicamente comporta danni o perdite delle delicate strutture meccanosensoriali dell'orecchio interno. Nel corso degli ultimi anni sono emersi sofisticati esami in vitro e ex vivo, che hanno permesso lo screening di un numero crescente di composti potenzialmente terapeutici, minimizzando le risorse e accelerando gli sforzi per sviluppare cure per SNHL. Sebbene colture omogenee di alcuni tipi di cellule continuino a svolgere un ruolo importante nella ricerca attuale, molti scienziati ora si affidano a culture organotipiche più complesse di orecchie interne murine, noti anche come esplorazioni cochleari. La conservazione delle strutture cellulari organizzate all'interno dell'orecchio interno facilita la valutazione in situ di vari componenti dell'infrastruttura coclea, comprese le cellule dei capelli interni ed esterni, i neuroni dei gangli spirali, i neurE supportare le cellule. Qui presentiamo la preparazione, la cultura, il trattamento e l'immunostaining di esplosioni cochleari murine neonatali. L'attenta preparazione di questi esplosivi facilita l'individuazione di meccanismi che contribuiscono alla SNHL e costituisce uno strumento prezioso per la comunità di ricerca uditiva.
Introduzione
Perdita uditiva sensoriale (SNHL) riflette danni all'orecchio interno o al percorso uditivo ascendente. Mentre la perdita dell'udito è il disordine sensoriale più comune nell'uomo 1 , non esistono ancora terapie curative 2 . Sebbene gli impianti cerebrali cocleari o uditivi possono ristabilire un certo grado di udito ai pazienti con SNHL grave o profonda, l'udienza fornita da questi dispositivi è ancora molto diversa da quella uditiva "naturale", specialmente durante i tentativi di comprendere il rumore del suono o di ascoltare la musica.
Mentre la degenerazione delle cellule....
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Protocollo
Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Istituzionale di Assistenza e Assistenza Civile (IACUC) di Massachusetts Eye and Ear. Gli esperimenti sono stati condotti secondo il Codice Etico dell'Associazione Medica Mondiale.
1. Preparazione della dissezione
- Preparazione del tavolo chirurgico
- Usa il 70% di etanolo per disinfettare il tavolo chirurgico.
- Posizionare due pasticci nonsterili accanto al microscopio.
- Preparare il vassoio strumenti, forbici operative a caldo sterilizzato, una maniglia per bisturi, un micro coltello e una pinza (due ciascuno di # 4 & # 55). Po....
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Risultati
Mentre molti protocolli si concentrano sull'organo di Corti explants, questa tecnica tenta di preservare l'anatomia dell'intero turno cochleare, inclusi gli SGN. Questo dà ai ricercatori l'opportunità di analizzare gli effetti di un dato trattamento sulle neuriti e sulla somata di SGN oltre all'organo di Corti. Effettuare una dissezione che conserva parte del modiolus, come descritto qui, è più tecnicamente impegnativo che esplodere l'organo di Corti da solo. Tutt.......
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Discussione
I ricercatori devono perfezionare la tecnica di dissezione prima di effettuare esperimenti che implicano esplosioni cochleari. Le cellule dei capelli sono comunemente danneggiate durante le dissezione eseguite presto nella curva di apprendimento e un momento particolarmente problematico per la loro integrità è la rimozione della membrana tectoria, che richiede mani costanti, strumenti e esperienze adeguate. Per risparmiare tempo e risorse, è necessario eseguire un controllo visivo sotto il microscopio di dissezione e si.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto Nazionale di Sordità e altri Disturbi della Comunicazione con sovvenzioni R01DC015824 (KMS) e T32DC00038 (supporto SD), il Dipartimento della Difesa concede la W81XWH-15-1-0472 (KMS), la Fondazione Bertarelli (KMS) La Fondazione di Nancy Sayles Day (KMS) e il Centro di ricerca di tinnito di Lauer (KMS). Ringraziamo Jessica E. Sagers, BA per commenti insightful sul manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ampicillina, sale sodico | Invitrogen | 11593-027 | |
| anticorpo anti-CtBP2, anticorpo di topo (IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anticorpo anti-Myo7A, coniglio | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anticorpo anti-NF-H, pollo | EMD Millipore | AB5539 | |
| anticorpo anti-PSD95, topo (IgG2a) | Anticorpi Inc. | Anticorpo anti-TuJ1 75-028 | |
| BioLegend | 801202 | ||
| Cell-Tak, 5 mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR da 15 mL, fondo conico, graduazione, piatto sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR, 100 x 20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| Piatto per colture cellulari CELLSTAR, 35 x 10 mm, 4 anelli interni | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Piatto per colture cellulari CELLSTAR, 60 x 15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Provette per centrifuga CELLSTAR 50 mL, fondo conico, graduazione, sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| smalto per unghie trasparente | Microscopia elettronica | Sciences 72180 | |
| Piatti con fondo in vetro da parete trasparente (vetro 40 mm), PELCO®, manicotto/20, 50 x 7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Vetrini, Rotondo, Vetro, Diametro 10 mm, Spessore #1, 0,13 - 0,16 mm | Ted Pella Inc. | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Acqua distillata, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), alto glucosio, piruvato, senza glutammina, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 Forcipe | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Forcipe (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Alcool etilico (EtOH), puro, 200 proof, anidro, ≥ 99,5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Siero fetale bovino (FBS), qualificato, regioni approvate dall'USDA, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquotare in provette da 50 mL e conservare a -20° C congelatore |
| capra anti-pollo-647 anticorpo secondario | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| capra anti-topo (IgG)-568 anticorpo secondario | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| capra anti-topo (IgG1) -568 anticorpo secondario | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| capra anti-topo (IgG2a) -488 anticorpo secondario | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| capra anti-coniglio-488 anticorpo secondario | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcio, magnesio, senza fenolo, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Vassoio strumenti con coperchio Coltello | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| - angolato di 30 gradi | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Vetrini per microscopio, VistaVision, codice colore, 75 x 25 mm (3 x 1"), spessore 1 mm, bianco, confezione da 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Supplement (100X), 5 mL | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, Bicarbonato di sodio soluzione al 7,5%, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, soluzione di idrossido di sodio, 1 L Thermo | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Siero normale per cavalli (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Forbici operatorie | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldeide (PFA), grado di reagente, cristallino | Sigma-Aldrich | P6148 | Prima dell'uso: Stabilire procedure operative standard basate sui protocolli disponibili online |
| PBS, pH 7,4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prima dell'uso |
| Falloidina, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Tampone di preparazione, non sterile | Medline | 05136CS | |
| Provette per microcentrifuga Safe-Lock, polipropilene, 0,5 mL | Autoclave Eppendorf | 022363719 | prima dell'uso |
| Provette per microcentrifuga Safe-Lock, polipropilene, 1,5 mL | Autoclave Eppendorf | 022363204 | prima dell'uso |
| Lame per bisturi - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Manico per bisturi - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stereomicroscopio Stemi 2000-C | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Microscopio confocale TCS SP5 | Leica | N/A | |
| Triton-X (tensioattivo non ionico) | Integra | T756.30.30 | |
| Mezzo di montaggio antisbiadimento VectaShield per fluorescenza | Vector Laboratories, Inc. | con cerniera H-1000 | |
| , richiudibile, 4 x 6'' - 2 mm di spessore | Zipline | 0609132541599 |
Riferimenti
- Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
- Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062(2014).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C.
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Ristampe e permessi
