Articolo metodologico

Isolamento della popolazione Side di Myc-indotta delle cellule T leucemia linfoblastica acuta in Zebrafish

DOI:

10.3791/55711

⸱

4 maggio 2017

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Section of Hematology-Oncology, The University of Chicago, 2Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

In questo articolo

Sommario

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Qui, descriviamo una tecnica per isolare le cellule popolazione lato da un modello zebrafish di cellule T myc indotta da leucemia linfoblastica acuta (T-ALL). Questo saggio popolazione lato è altamente sensibile ed è descritta per zebrafish T-ALL, ma può essere applicabile ad altri tipi di cellule zebrafish maligne e non maligne.

Abstract

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popolazioni cellulari eterogenee, da entrambi i tessuti sani o maligni, possono contenere una popolazione di cellule caratterizzati da una diversa capacità di efflusso del colorante DNA-binding Hoechst 33342. Questa "side population" di cellule possono essere identificate usando i metodi di citometria a flusso dopo la Hoechst 33342 colorante viene eccitato da un (UV) laser ultravioletto. La popolazione collaterale di molti tipi di cellule contiene cellule progenitrici stem- o simile. Tuttavia, non tutti i tipi di cellule hanno una popolazione lato identificabile. Danio rerio, zebrafish, hanno un robusto modello in vivo di cellule T leucemia linfoblastica acuta (T-ALL), ma se questi zebrafish T-alls hanno una popolazione lato è sconosciuto. Il metodo descritto qui delinea come isolare le cellule popolazione lato in zebrafish T-ALL. Per cominciare, il T-ALL in zebrafish viene generato tramite la microiniezione di plasmidi tol2 in embrioni stadio di una cellula. Una volta che i tumori sono cresciuti ad uno stadio in cui si espandono in più della metà del aniIl corpo di Mal, le cellule T-ALL può essere raccolto. Le cellule vengono poi colorate con Hoechst 33342 ed esaminati mediante citometria di flusso per celle popolazione lato. Questo metodo ha vaste applicazioni in zebrafish T-ALL ricerca. Mentre non ci sono noti marcatori di superficie delle cellule in zebrafish che confermano se queste cellule popolazione lato sono cellule simil-staminali del cancro, in vivo test di trapianto funzionali sono possibili. Inoltre, trascrittomica monocellulari potrebbero essere applicati per identificare le caratteristiche genetiche di queste cellule popolazione lato.

Introduzione

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Il test di popolazione laterale capitalizza sulla capacità aumentata di alcune cellule all'interno di un tessuto per scaricare il colorante vincolante del DNA Hoechst 33342 a causa di elevati livelli di proteine ​​transporter di cassetta (ATP) leganti per le membrane cellulari. Le cellule che effluxano il colorante Hoechst 33342 possono essere identificate usando doppia analisi citometrica a flusso di lunghezza d'onda dopo che il colorante viene eccitato da un laser UV. Questo saggio è stato usato per identificare le cellule staminali ematopoietiche murine (HSCs) 1 , ma da allora è stato utilizzato per identificare le popolazioni di cellule staminali / progenitori in molti tessuti e tumori (esaminati nel riferimento 2). Tuttavia, non tutte le popolazioni di cellule hanno una popolazione laterale e non tutte le popolazioni laterali sono arricchite per le cellule staminali / progenitori.

Il pesce zebra è un potente sistema di modelli genetici vertebrati per studiare il cancro umano 3 , 4 , con un certo numero di vantaggi rispetto al tradizionale models di cancro. Zebrafish embrioni sono fecondati esternamente e sono otticamente trasparente, facilitando transgenesi e l'osservazione in vivo dei processi patologici, tra iniziazione e progressione del cancro. Fino ad oggi, il saggio della popolazione lato per rilevare potenziali cellule staminali o progenitrici è stata applicata soltanto fino al midollo rene in zebrafish per identificare HSC, e non a qualsiasi modelli di cancro zebrafish 5, 6.

Il modello zebrafish di T-cell leucemia linfoblastica acuta (T-ALL) è morfologicamente e geneticamente simile a umano T-ALL 7, 8, 11. T-ALL è un tumore maligno aggressivo che, negli esseri umani, rappresenta il 10-15% dei pediatrica e il 25% di tutti i casi di adulti 9. Mentre il trattamento di T-ALL è migliorata, la ricaduta è ancora comune ed è associata ad una prognosi sfavorevole. T-TUTTI I tumori sono hétérogèneE contengono molte diverse sottopopolazioni di cellule tumorali, incluse le cellule di innesco delle leucemie (LICs). I LICs sono definiti dalla loro capacità di ricreare l'intero tumore da una singola cellula e la frequenza dei LIC all'interno di una popolazione di cellule tumorali può essere calcolata trapiantando dosi cellulari variabili nei destinatari tramite un limite di trapianto di diluizione (LDA). Mentre gli esperimenti LDA sono stati eseguiti in zebrafish per calcolare la frequenza dei LICs 8 , 10 , 11 , questa determinazione viene effettuata in retrospettiva e non consente l'isolamento prospettico di LICs. Pertanto, manca un metodo per isolare prospetticamente una popolazione arricchita per l'attività delle cellule staminali del cancro. Identificare e isolare le cellule di popolazione laterali da zebrafish T-ALLs è il primo passo verso l'affrontare questa carenza.

Il protocollo qui descritto descrive come generare in modo efficiente tumori T-ALL in zebrAffish utilizzando transgenesis tol2-mediata, raccogliere le cellule tumorali T-ALL e colorarle con Hoechst 33342 per identificare la popolazione laterale delle cellule. I futuri esperimenti in vivo con zebrafish T-ALL potrebbero includere se le cellule di popolazione laterali sono arricchite per LIC o hanno altre proprietà stem- o progenitrici.

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Protocollo

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Tutte le procedure con zebrafish sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso (IACUC) presso l'Università di Chicago. L'Università di Chicago è accreditato dalla Associazione per la valutazione e l'accreditamento del Laboratorio di Animal Care (AAALAC).

1. Generazione e isolando fluorescente T-Tutte le celle in Zebrafish

  1. Microiniezione in embrioni di zebrafish singenici
    1. Utilizzando kit disponibili in commercio, isolare RAG2 circolare: c-myc e RAG2: proteina fluorescente verde (RAG2: GFP) DNA plasmide contenente ripetizioni terminali invertite riconosciuto da tol2 transposase (vedere la tabella dei materiali per fonte di DNA plasmidico) 12 ed eluire il DNA in acqua sterile.
      NOTA: GFP è usato in questo studio, ma qualsiasi proteina fluorescente funzionerà.
    2. Preparare pCS2-trasposasi (tol2) RNA
      1. Isolare tol2 DNA plasmidico utilizzando kit disponibili in commercio (vedi tegli Tabella dei materiali per la fonte di DNA plasmidico) 12 ed eluire il DNA in acqua sterile.
      2. Incubare 1 pg di DNA tol2 a 37 ° C per 1 ora con 5 unità di enzima di restrizione NotI nel buffer appropriato per linearizzare il plasmide. Heat-inattivare la noti a 65 ° C per 20 min.
      3. Trascrivere RNA tol2 con SP6 RNA polimerasi dal DNA linearizzato utilizzando un kit RNA trascrizione disponibile in commercio 13. Conservare l'RNA in monouso aliquote a -80 ° C.
    3. Preparare la miscela iniezione su ghiaccio aggiungendo 250 ng di RAG2: c-myc DNA plasmidico, 250 ng di RAG2: GFP plasmide DNA, 150 ng di RNA tol2, e 0,5 ml di rosso fenolo. Regolare il volume a 10 ml con acqua priva di nucleasi.
    4. Iniettare ~ 1 nL dell'impasto iniezione nella cella di uno stadio unicellulare singenici zebrafish utilizzando un microinjector e ago tirato da un tubo capillare di vetro, seguendo precedentemente istiMetodi istituito 8, 14.
      NOTA: zebrafish Singenico generato per partenogenesi 15 sono utilizzati qui per eliminare eterogeneità genetica e rigetto immunitario dopo il trapianto. Tuttavia, tipo selvatico zebrafish o qualsiasi ceppo desiderato può anche essere usato.
    5. Rimuovere embrioni morti, sottosviluppati, o malformati a 24 ore e 48 ore dopo l'iniezione 16.
    6. Mettere il pesce iniettato sul sistema di pesce a 6 giorni dopo l'iniezione e farli crescere secondo il protocollo standard 6.
  2. Screening zebrafish iniettato e monitoraggio della crescita tumorale
    1. A 21 giorni dopo l'iniezione, posizionare un singolo larva iniettato in una goccia di mezzo embrione in una piastra di Petri e schermo per la fluorescenza GFP utilizzando un microscopio epifluorescente (eccitazione passabanda: 470/40, passa-banda di emissione: 525/50) 8.
      NOTA: le larve Zebrafish che have integrato sia RAG2: c-myc e RAG2: GFP avrà un timo verde fluorescente (pesce positivo) e può già esibire l'espansione di cellule fluorescenti verdi maligne oltre il timo. Tutti i pesci con un GFP + timo andrà a sviluppare un GFP + T-ALL. Le larve che non dimostrano l'integrazione dei plasmidi non avrà alcun cellule fluorescenti verdi (pesce negativo).
    2. Separare il pesce negativo (sulla base di una mancanza di fluorescenza) in un serbatoio diverso e monitorare il pesce di nuovo a 28 e 35 giorni dopo l'iniezione. A 28 e 35 giorni dopo l'iniezione, anestetizzare il pesce con 0,02% tricaine tamponata (MS-222) in acqua sistema pesci prima dello screening.
    3. Posizionare ogni larva zebrafish che è positivo per una timo fluorescente o un tumore fluorescente in un serbatoio individuale per monitorare la crescita tumorale tre volte alla settimana.
  3. Raccolta di fluorescente T-ALL cellule dal pesce tumore primario
    1. Preparare almeno 20 mL di 10% di siero fetale bovino inattivato termicamente in soluzione salina fosfata tamponata da 0.9x (FBS / PBS).
    2. Aggiungere 1 mL di FBS / PBS in un flacone di sale di eparina sodico (300 unità).
    3. Selezionare i tumori portanti dei pesci in più del 50% del corpo o quelli che hanno difficoltà a mangiare o nuotare. Sacrificare i pesci con sovradosaggio con tricaine o immersione con acqua ghiacciata. Confermare la morte per mancanza di movimento e battito cardiaco.
    4. Utilizzare una lama di rasoio per rimuovere la testa del pesce.
    5. Lavare la cavità del pesce con la soluzione eparina per rimuovere le cellule del sangue rosso in eccesso.
      1. Usando una pipetta, iniettare 100 μL di soluzione eparina (preparata al punto 1.3.2) nella cavità del corpo del pesce. Rimuovere tutto il liquido che esce (contenere le cellule del sangue) e pipettarlo in un tubo da 1,5 ml di microcentrifuga.
      2. Utilizzare una punta fresca per pipetta per lavare di nuovo il corpo. Eseguire almeno tre lavaggi, o fino a quando il liquido che esce non appare libero da blOOD.
      3. Eliminare tutti i liquidi dalle lavaggi nei punti 1.3.5.1 e 1.3.5.2, in quanto non verranno utilizzati in ulteriori analisi.
    6. Raccogli le cellule di leucemia.
      1. Iniettare 100 μl di FBS / PBS nella cavità del corpo del pesce.
      2. Applicare una pressione dolce all'esterno del corpo del pesce con la punta della pipetta per spremere / spingere le cellule tumorali.
        NOTA: Se questo passaggio viene eseguito usando un microscopio di dissezione, le cellule tumorali che escono dalla cavità del corpo saranno evidenti.
      3. Raccogliere il liquido e le cellule da ogni lavaggio in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml.
      4. Ripetere i passaggi 1.3.6.1-1.3.6.3 finché la maggior parte delle cellule tumorali vengono raccolte (di solito 5-10 volte). Raccogliere tutte le cellule tumorali nello stesso tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Mantenere le cellule a temperatura ambiente.
    7. Mescolare le cellule tumorali raccolte dal punto 1.3.6 pipettandole delicatamente per dissociare i grumi delle cellule. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un 4filtro a rete 0 micron. Lavare il filtro 1-2 volte con 100 microlitri di FBS / PBS. Mantenere le cellule a temperatura ambiente.
    8. Mescolare 2 ml di sospensione cellulare con 18 ml di trypan blu (0,4%, diluito 1:10 e filtrata) in una nuova provetta. Carico 10 microlitri su un emocitometro e contare il numero di (non-blu) cellule fluorescenti vivo per calcolare il numero di cellule tumorali isolate.
      NOTA: Le cellule non-blu GFP-negativi sono probabilmente normali, non maligne cellule T e non devono essere conteggiati. Almeno 2 x 10 6 cellule sono tenuti a macchiare le cellule con Hoechst 33342.

2. colorazione del fluorescente T-tutte le celle con Hoechst 33342 per identificare la popolazione Side

  1. Diluire Hoechst 33342 1:10 con priva di nucleasi H 2 O per rendere il 1 mg / ml concentrazione di lavoro. Conservare il colorante a 4 ° C e al buio.
  2. Preparare una soluzione di 100 mM di verapamil sciogliendo 49,1 mg in 1 ml di dimetilsolfossido (DMSO).
    NOTA: Verapamil è un inibitore dei trasportatori ABC ed è un controllo importante per gli esperimenti di popolazione lato. Aggiunta verapamil ai campioni inibirà la capacità dei trasportatori ABC di efflusso del colorante Hoechst 33342. Pertanto, una vera e propria popolazione lato scompare quando verapamil viene aggiunto al campione.
  3. Impostare un bagno d'acqua a 28 ° C.
  4. Preparare campioni e controlli al buio aggiungendo cellule e soluzioni per tubi fluorescenza-attivato cell sorter (FACS).
    1. Preparare i campioni aggiungendo 10 6 cellule, 15 microlitri di 1 mg / mL Hoechst 33342, e 2,5 ml di DMSO a un tubo FACS. Regolare il volume di 1 ml con FBS / PBS.
    2. Preparare i controlli aggiungendo 10 6 cellule, 15 microlitri di 1 mg / mL Hoechst 33342, e 2,5 ml di 100 mM verapamil ad un tubo FACS. Regolare il volume di 1 ml con FBS / PBS.
      NOTA: Un minimo di 10 6 cellule / campione è consigliato, ma colorazione più cellule è preferito, specialmente se il lato popolatecelle agli ioni verranno ordinati per ulteriori analisi. Non superare i 10 6 cellule / ml, e mantenere la concentrazione Hoechst 33342 a 15 mg / ml. Se 10 x 10 6 cellule sono colorate, il volume di reazione totale è di 10 mL.
  5. Incubare in un 28 ° bagnomaria C al buio per 120 min.
  6. Dopo l'incubazione, posizionare le cellule immediatamente in ghiaccio e tenerli al buio.
  7. Agglomerare le cellule a 4 ° C per 6 minuti a 300 x g. Rimuovere il surnatante. Lavare con 1 ml di FBS / PBS.
  8. Agglomerare le cellule a 4 ° C per 6 minuti a 300 x g. Rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in 1 ml di FBS / PBS.
  9. Conservare a 4 ° C fino separazione delle cellule.
  10. 15 min prima della separazione delle cellule, aggiungere 2 ml di ioduro di propidio (PI) stock (1 mg / ml) ad 1 ml di FBS / PBS (concentrazione finale: 2 mg / mL). Mescolare bene.

3. Utilizzare FACS trovare la Popolazione laterale all'interno del T-ALL cellulare Popolazione fluorescente

  1. Analizzare le sospensioni di cellule T-ALL di zebrafish colorate su un separatore di celle dotato di un laser UV per l'eccitazione di tinture Hoechst 33342 ed un laser da 488 nm per l'eccitazione PI e per la rilevazione delle cellule GFP + T-ALL.
  2. Determinare un gate per le celle live, GFP + T-ALL.
    1. Utilizzare l'area di dispersione in avanti (FSC) e lato scatter (SSC) per eliminare i detriti.
      NOTA: FSC viene utilizzato per distinguere le dimensioni della cella e SSC viene utilizzato per distinguere la granularità della cella.
    2. Utilizzare la larghezza FSC e SSC per discriminare i dublets.
      NOTA: Ci sono tre componenti identificati dai rilevatori del flusso cytometro: area, altezza e larghezza. L'area viene usata tipicamente per misurare la fluorescenza della cella. La larghezza misura il tempo di volo ed è due volte più ampio se due celle vengono bloccate insieme.
    3. Per le cellule tumorali vive, disegnare un cancello attorno alle cellule positivo per GFP e negativo per PI utilizzando i rilevatori appropriati ( ad esempio , FITC per GFP e PerCP Cy5-5 per PI).
  3. Nel cancello vivo, misurare la fluorescenza Hoechst 33342 attraverso i filtri a banda passante Hoechst Blue e Hoechst Red (rispettivamente 450/50 e 670/30).
    NOTA: la popolazione laterale, se presente, sarà evidente dopo che questo è stato impostato. Importante, la popolazione laterale deve sparire nel controllo verapamil, affinché sia ​​considerata una vera popolazione laterale.
  4. Se ordinate le celle di popolazione laterali per ulteriori esperimenti, utilizzare la punta di ugello grande (100 μm) e raccogliere le cellule in un tubo FACS contenente 3 ml di 100% FBS. Utilizzare una punta ugello più grande (100 μm) invece della punta più piccola (70 μm) per migliorare la vitalità cellulare dopo l'ordinamento.

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Risultati

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Per generare efficientemente fluorescenti myc-indotta T-ALL tumori in zebrafish, costrutti di DNA circolare fiancheggiati da siti trasposasi tol2 possono essere co-iniettati con RNA tol2. Precedenti studi da l'iniezione di DNA linearizzato in embrioni di zebrafish riportano un tasso di transgenesi 5% 8. Con il protocollo adeguata per includere transgenesi tol2-mediata, tassi transgenesi vanno dal 10-44% possono essere osservati (Tabella 1).

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Discussione

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Il saggio popolazione lato è molto sensibile; pertanto, piccole modifiche al protocollo può comportare una difficoltà di individuare cellule popolazione lato. In primo luogo, la temperatura durante la fase di colorazione specifica per ogni sistema animale / cellule. Per i sistemi di mammifero, il saggio popolazione lato viene tipicamente eseguita a 37 ° C 2. Quando il T-ALL cellule zebrafish sono state incubate a 37 ° C, molte delle cellule morti, che ha reso questa temperatura di incubazione ina...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Board of Women's University of Chicago, dal Wendy Will Case Fund e dall'Università di Chicago nel complesso del Cancer Center Grant (P30 CA014599). Vorremmo ringraziare il Core Flow Cytometry presso l'Università di Chicago per il loro aiuto nella creazione di questo esperimento, e come altri membri del laboratorio de Jong, in particolare Leslie Pedraza e Sean McConnell.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pesce zebra singeneico (CG2)Vedi Mizgireuv et al., 2006
rag2:plasmideLangenau Laboratory
rag2:GFP plasmide costruito nel de Jong Labrag2 promotore dal Langenau Laboratory
plasmideChien Laboratorio
NotI -HF enzima di restrizioneNew England Bio-Labs Inc.R3189S500 unità in 25 & micro; L
mMessage Machine SP6 Kit di trascrizioneAmbionThermo Fisher Scientific - AM134025 reazioni
QIAGEN Plasmide Midi KitQiagen, Inc.12643
Microscopio SteREO Discovery V8 MicroscopiaCarl Zeiss495015-0008-000
Microiniettore digitaleTritech ResearchMINJ-D
Porta aghi a braccio dritto in ottoneTritech ResearchMINJ-4
Base magnetica e supportoTritech ResearchMINJ-HBMB
MicromanipolatoreNarishige InternationalMN153
Capillari in vetroSutter Instrument Co.B100-50-1010 cm senza
filamento Estrattore per micropipette fiammeggiante/marroneSutter Instrument Co.P-97
Microloader,Eppendorf North America Inc.
Soluzione di rosso fenoloSigma Life ScienceP0290Concentrazione 0,5% 100 mL
Pipette di trasferimento in plasticaFisherbrand137119Dbulbo graduato da 7,5 mL
Tricaina metanassonato (MS-222)Western Chemical, Inc.Fisher Scientific - NC0342409100 g
Siero fetale bovino (FBS)HyClone Laboratories, Inc.Fisher Scientific - SH3007103500 mL
di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Gibco di Life Technologies1001-023pH 7,4 (1x) - 500 mL
di sale sodico di eparinaSigma-Aldrich210615 - 300 fiale da
40 &; micro; m filtro a reteFalcon Corning Marca352340Confezione da 50
Trypan blueSigma Life ScienceT815420 mL - Soluzione (0,4%)
Hoechst 33342Life TechnologiesH357010 mL
VerapamilSigma Life ScienceV46291 g
Dimetil solfossido (DMSO)Sigma Life ScienceD8418100 mL
Propidio IoduroLife TechnologiesP356610 mL
FACSAria Selezionatore di cellule a fusioneBD Biosciences
BD FACSDiva 8.0.1BD Biosciences
FlowJo v10.2FlowJo, LLC
c-myc pCS2-trasposasi Puntali per pipette 930001007

Riferimenti

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  15. Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
  16. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregan Press. (1993).
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