Qui, descriviamo una tecnica per isolare le cellule popolazione lato da un modello zebrafish di cellule T myc indotta da leucemia linfoblastica acuta (T-ALL). Questo saggio popolazione lato è altamente sensibile ed è descritta per zebrafish T-ALL, ma può essere applicabile ad altri tipi di cellule zebrafish maligne e non maligne.
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Articolo metodologico
Isolamento della popolazione Side di Myc-indotta delle cellule T leucemia linfoblastica acuta in Zebrafish
In questo articolo
Sommario
Abstract
popolazioni cellulari eterogenee, da entrambi i tessuti sani o maligni, possono contenere una popolazione di cellule caratterizzati da una diversa capacità di efflusso del colorante DNA-binding Hoechst 33342. Questa "side population" di cellule possono essere identificate usando i metodi di citometria a flusso dopo la Hoechst 33342 colorante viene eccitato da un (UV) laser ultravioletto. La popolazione collaterale di molti tipi di cellule contiene cellule progenitrici stem- o simile. Tuttavia, non tutti i tipi di cellule hanno una popolazione lato identificabile. Danio rerio, zebrafish, hanno un robusto modello in vivo di cellule T leucemia linfoblastica acuta (T-ALL), ma se questi zebrafish T-alls hanno una popolazione lato è sconosciuto. Il metodo descritto qui delinea come isolare le cellule popolazione lato in zebrafish T-ALL. Per cominciare, il T-ALL in zebrafish viene generato tramite la microiniezione di plasmidi tol2 in embrioni stadio di una cellula. Una volta che i tumori sono cresciuti ad uno stadio in cui si espandono in più della metà del aniIl corpo di Mal, le cellule T-ALL può essere raccolto. Le cellule vengono poi colorate con Hoechst 33342 ed esaminati mediante citometria di flusso per celle popolazione lato. Questo metodo ha vaste applicazioni in zebrafish T-ALL ricerca. Mentre non ci sono noti marcatori di superficie delle cellule in zebrafish che confermano se queste cellule popolazione lato sono cellule simil-staminali del cancro, in vivo test di trapianto funzionali sono possibili. Inoltre, trascrittomica monocellulari potrebbero essere applicati per identificare le caratteristiche genetiche di queste cellule popolazione lato.
Introduzione
Il test di popolazione laterale capitalizza sulla capacità aumentata di alcune cellule all'interno di un tessuto per scaricare il colorante vincolante del DNA Hoechst 33342 a causa di elevati livelli di proteine transporter di cassetta (ATP) leganti per le membrane cellulari. Le cellule che effluxano il colorante Hoechst 33342 possono essere identificate usando doppia analisi citometrica a flusso di lunghezza d'onda dopo che il colorante viene eccitato da un laser UV. Questo saggio è stato usato per identificare le cellule staminali ematopoietiche murine (HSCs) 1 , ma da allora è stato utilizzato per identificare le popolazioni di ce....
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Protocollo
Tutte le procedure con zebrafish sono stati approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso (IACUC) presso l'Università di Chicago. L'Università di Chicago è accreditato dalla Associazione per la valutazione e l'accreditamento del Laboratorio di Animal Care (AAALAC).
1. Generazione e isolando fluorescente T-Tutte le celle in Zebrafish
- Microiniezione in embrioni di zebrafish singenici
- Utilizzando kit disponibili in commercio, isolare RAG2 circolare: c-myc e RAG2: proteina fluorescente verde (RAG2: GFP) DNA plasmide contenente ripetizioni terminali invertite riconosciuto ....
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Risultati
Per generare efficientemente fluorescenti myc-indotta T-ALL tumori in zebrafish, costrutti di DNA circolare fiancheggiati da siti trasposasi tol2 possono essere co-iniettati con RNA tol2. Precedenti studi da l'iniezione di DNA linearizzato in embrioni di zebrafish riportano un tasso di transgenesi 5% 8. Con il protocollo adeguata per includere transgenesi tol2-mediata, tassi transgenesi vanno dal 10-44% possono essere osservati (Tabella 1).
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Discussione
Il saggio popolazione lato è molto sensibile; pertanto, piccole modifiche al protocollo può comportare una difficoltà di individuare cellule popolazione lato. In primo luogo, la temperatura durante la fase di colorazione specifica per ogni sistema animale / cellule. Per i sistemi di mammifero, il saggio popolazione lato viene tipicamente eseguita a 37 ° C 2. Quando il T-ALL cellule zebrafish sono state incubate a 37 ° C, molte delle cellule morti, che ha reso questa temperatura di incubazione ina.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Board of Women's University of Chicago, dal Wendy Will Case Fund e dall'Università di Chicago nel complesso del Cancer Center Grant (P30 CA014599). Vorremmo ringraziare il Core Flow Cytometry presso l'Università di Chicago per il loro aiuto nella creazione di questo esperimento, e come altri membri del laboratorio de Jong, in particolare Leslie Pedraza e Sean McConnell.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pesce zebra singeneico (CG2) | Vedi Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:plasmide | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP plasmide costruito nel de Jong Lab | rag2 promotore dal Langenau Laboratory | ||
| plasmide | Chien Laboratorio | ||
| NotI -HF enzima di restrizione | New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 unità in 25 & micro; L |
| mMessage Machine SP6 Kit di trascrizione | Ambion | Thermo Fisher Scientific - AM1340 | 25 reazioni |
| QIAGEN Plasmide Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| Microscopio SteREO Discovery V8 Microscopia | Carl Zeiss | 495015-0008-000 | |
| Microiniettore digitale | Tritech Research | MINJ-D | |
| Porta aghi a braccio dritto in ottone | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Base magnetica e supporto | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipolatore | Narishige International | MN153 | |
| Capillari in vetro | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm senza |
| filamento Estrattore per micropipette fiammeggiante/marrone | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microloader, | Eppendorf North America Inc. | ||
| Soluzione di rosso fenolo | Sigma Life Science | P0290 | Concentrazione 0,5% 100 mL |
| Pipette di trasferimento in plastica | Fisherbrand | 137119D | bulbo graduato da 7,5 mL |
| Tricaina metanassonato (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific - NC0342409 | 100 g |
| Siero fetale bovino (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific - SH3007103 | 500 mL |
| di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Gibco di Life Technologies | 1001-023 | pH 7,4 (1x) - 500 mL |
| di sale sodico di eparina | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 - 300 fiale da |
| 40 &; micro; m filtro a rete | Falcon Corning Marca | 352340 | Confezione da 50 |
| Trypan blue | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL - Soluzione (0,4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamil | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidio Ioduro | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Selezionatore di cellule a fusione | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
Riferimenti
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S.
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Ristampe e permessi
