Articolo metodologico

L'isolamento di Murine adiposo derivate dal tessuto microvascolare Frammenti come vascolarizzazione Unità per Tissue Engineering

DOI:

10.3791/55721

⸱

30 aprile 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Clinical and Experimental Surgery, Saarland University, 2Division of Plastic Surgery and Hand Surgery, University Hospital Zurich, University of Zurich

In questo articolo

Sommario

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Vi presentiamo un protocollo per isolare frammenti adiposo microvascolari derivate dal tessuto che rappresentano le unità di vascolarizzazione promettenti. Possono essere isolati rapidamente, non richiedono l'elaborazione in vitro e, pertanto, può essere utilizzato per un passo prevascularization in diversi campi dell'ingegneria dei tessuti.

Abstract

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Una rete microvascolare funzionale è di importanza fondamentale per la sopravvivenza e l'integrazione dei costrutti ingegneria tessutale. A questo scopo, sono state stabilite diverse strategie angiogenici e prevascularization. Tuttavia, la maggior parte degli approcci basati su celle includono passi in termini di tempo in vitro per la formazione di una rete microvascolare. Quindi, essi non sono adatti per intraoperatori procedure one-step. Adiposo derivate dal tessuto frammenti microvascolari (ad-MVF) rappresentano le unità vascolarizzazione promettenti. Essi possono essere facilmente isolati dal tessuto grasso e presentano una morfologia microvasi funzionale. Inoltre, essi rapidamente rimontare in nuove reti microvascolari dopo l'impianto in vivo. Inoltre, ad-DMV hanno dimostrato di indurre linfangiogenesi. Infine, sono una ricca fonte di cellule staminali mesenchimali, che possono ulteriormente contribuire alla loro elevato potenziale di vascolarizzazione. In studi precedenti abbiamo dimostrato la notevole vascularizatisulla capacità di ad-MVF in sostituti ossei e cutanei ingegnerizzati. Nel presente studio, riportiamo un protocollo standardizzato per l'isolamento enzimatica di ad-DMV da tessuto adiposo murino.

Introduzione

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Ingegneria tissutale si concentra sulla fabbricazione di tessuti e organi succedanei mantenere, ripristinare o aumentare la funzione di inutilizzabile in vivo controparti 1, 2. Il destino di costrutti di tessuto ingegnerizzati dipende essenzialmente una vascolarizzazione adeguata 3. Reti microvascolari all'interno di questi costrutti dovrebbero essere organizzati gerarchicamente con arteriole, capillari e venule per consentire efficiente perfusione sanguigna dopo inosculation alla vascolarizzazione del destinatario 4. La generazione di queste reti è tra le principali sfide nel campo dell'ingegneria dei tessuti. A tale scopo, un ampio spettro di strategie di vascolarizzazione sperimentali è stata introdotta nel corso degli ultimi due decenni 5, 6.

approcci angiogenici stimolano la crescita interna dei microvasi dei destinatari nel tiss ingegnerizzatiues mediante modificazione ponteggio strutturale o fisico-chimiche, come ad esempio l'incorporazione di fattori di crescita 7. Tuttavia, per la vascolarizzazione di grandi costrutti tridimensionali, le strategie di angiogenesi-dipendenti sono notevolmente limitate da tassi di crescita lenta di sviluppo di microvasi 8.

Al contrario, il concetto di prevascularization mira per la generazione di reti microvascolari funzionali all'interno del tessuto costruisce prima del loro impianto 9. Prevascularization convenzionale comporta la co-coltura delle cellule del vaso che formano, come le cellule endoteliali, cellule murali o cellule staminali 10, all'interno ponteggi. Dopo la formazione della rete microvascolare, i costrutti prevascularized possono essere impiantati in difetti del tessuto. Degno di nota, questo approccio prevascularization è di difficile applicazione in un ambiente clinico, perché si basa sulla complessa e richiede molto tempo in vitro </ em> le procedure, che sono limitati dai maggiori ostacoli normativi 9. Di conseguenza, v'è ancora una necessità per lo sviluppo di strategie prevascularization nuovi che sono più adatti per un'ampia applicazione clinica.

Tale strategia prevascularization può essere l'applicazione di frammenti di tessuto adiposo derivate microvascolari (ad-MVF). ad-MVF rappresentano le unità di vascolarizzazione potenti che possono essere raccolti in grandi quantità dal tessuto adiposo dei ratti 11, 12 e 13 topi. Sono costituiti da arteriolare, capillare e segmenti di flotta venulari, che presentano una morfologia microrecipiente fisiologico con un lume e stabilizzanti cellule perivascolari 14, 15. Questa caratteristica unica permette l'inserimento immediato di ponteggi ad-MVF-seminato in difetti del tessuto, senza precoltura. C'è, l'annuncio-DMV rapidamente rimontare inalle reti microvascolari funzionali. Inoltre, ad-DMV rappresentano una ricca fonte di cellule staminali mesenchimali 16, che possono inoltre contribuire alla loro capacità rigenerativa sorprendente. Di conseguenza, ad-DMV sono sempre più utilizzati in diversi campi dell'ingegneria dei tessuti 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.

L'isolamento di ad-DMV è stato originariamente istituito nel ratti 11, 12. Qui, descriviamo un protocollo, che permette l'isolamento standardizzato di murino ad-DMV da cuscinetti di grasso dell'epididimo. Ciò può fornire ulteriori informazioni sui meccanismi molecolari alla base della funzione ad-DMV utilizzando modelli di topi transgenici.

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Protocollo

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Tutte le procedure sono state eseguite secondo l'Istituto Nazionale di Salute linee guida per l'uso di animali da laboratorio e hanno seguito le linee guida istituzionali (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und di veterinaria, Zentralstelle, Saarbrücken, Germania).

1. Preparazione di strumenti chirurgici

  1. Tenere pronte le forbici dissezione, pinze chirurgiche, forbici preparazione piccole pinza sottile e una piastra di Petri sterile con terreno Eagle modificato da 15 mL Dulbecco (DMEM, 10% siero di vitello fetale (FCS), 100 U / ml di penicillina, 0,1 mg / mL di streptomicina ) per la raccolta cuscinetti di grasso dell'epididimo.
  2. Esporre gli strumenti chirurgici per una soluzione disinfettante per 5 min. In alternativa, sterilizzarli (sterilizzazione a vapore; 121 ° C, 20 min).

2. Gli animali e l'anestesia

  1. Scegli con attenzione il ceppo di topi come indicato per lo studio e la soggetto sotto indagine.
    NOTA: In questo studio abbiamo utilizzato maschio wild-type C57BL 6 topi / come donatori per la raccolta dei grassi dell'epididimo. Di interesse, ad-DMV può essere isolato anche da transgenici proteina fluorescente verde (GFP) animali donatori -positive (C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb / J) 22. Questo porta il grande vantaggio che i frammenti sono facilmente individuabili dalla colorazione immunoistochimica di GFP dopo l'impianto in topi wild-type GFP-negativi 14.
  2. Anestetizzare gli animali con un'iniezione intraperitoneale di xilazina (15 mg / kg) e ketamina (75 mg / kg). Assicurarsi che gli animali sono profondamente anestetizzati eseguendo un pizzico piedi con nessuna risposta. lubrificante occhio non è indicata come animali donatori vengono sacrificati dopo la raccolta grasso.
    NOTA: Assicurarsi che l'analgesia e la sterilità chirurgica sono in accordo con le rispettive linee guida del paese e istituzione in cui sono previsti gli esperimenti.
Le "> 3. La raccolta delle epididimali Fat Pads

  1. Trasferire l'animale ad un tavolo operatorio. Posto l'animale in posizione supina allo stereomicroscopio chirurgica e confermare anestesia profonda con punta pizzico.
  2. Immobilizzare lo zampe da loro nastratura ad un telo chirurgico e disinfettare l'addome con soluzione disinfettante.
  3. Separare la pelle addominale libera dello strato muscolare sottostante con le forbici dissezione.
  4. Eseguire una laparotomia mediana con le forbici dissezione e lateralmente spiegare i lembi della parete addominale.
  5. Bilateralmente identificare testicolo, epididimo e il cuscinetto adiposo dell'epididimo base alle pinza sottile (Figura 1). Non danneggiare le strutture intestinali per evitare la contaminazione fecale delle cuscinetti adiposi.
  6. Raccogliere i cuscinetti adiposi dell'epididimo con le forbici piccole di preparazione e le pinza sottile allo stereomicroscopio. Mantenere un margine di sicurezza di diversi mm tra l'epididimo e il grasso perridurre il rischio di accidentali raccolta dell'epididimo.
    NOTA: Questa procedura può essere eseguita anche senza uno stereomicroscopio. Tuttavia, questo può aumentare ulteriormente il rischio di lesioni accidentali dell'epididimo e corde spermatiche.
  7. Trasferire i cuscinetti adiposi dell'epididimo in una capsula Petri contenente 15 ml di DMEM preriscaldato a 37 ° C per il trasporto al laboratorio cella.
  8. Sacrificare l'animale tramite incisione dell'aorta addominale o dislocazione cervicale.

4. Isolamento di ad-MVF

  1. Preparare tre piastre sterili con 15 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), provette sterili di polipropilene da 14 ml (PP), una beuta da 50 ml sterile, sterili provette coniche microcentrifuga da 1,5 ml e forbici sottili sterilizzati.
  2. Lavare i cuscinetti adiposi tre volte in piastre Petri con 15 ml di PBS sotto una cappa a flusso laminare.
  3. Trasferire il grasso in un tubo da 14 ml in PP. Determinare il volume del tessuto adiposo raccolto (in mL) per mezzo di tHe scala tubo. Tritare il tessuto grasso meccanicamente con fini forbici fino ad ottenere una sospensione omogenea tessuto.
  4. Trasferire il tessuto tritato con due volumi di collagenasi NB4G (0,5 U / mL PBS) in un pallone da 50 mL beuta con 10 mL di misurazione pipetta. Il volume totale diventa tre volte il volume del tessuto grasso, determinato nel passo 4.3. Eseguire digestione tissutale in un incubatore per 10 min sotto vigorosa agitazione mediante un agitatore automatico (dimensione di ancoretta magnetica: 25 mm) a 37 ° C e le condizioni atmosferiche umidificati con 5% di CO 2.
  5. Osservare una piccola frazione (10 ml) del tessuto digerito sotto un microscopio per giudicare se la digestione può essere fermato. Accertarsi che il digestato contiene principalmente "libero" ad-DMV accanto a singole cellule, che indica il punto appropriato per arrestare il processo di digestione enzimatica (Figura 2).
    NOTA: Questo passaggio richiede esperienza con la procedura ed è fondamentale per la qualitàdi isolato ad-MVF. Prolungato risultati digestione dei grassi in una cella singola sospensione senza ad-DMV.
  6. Neutralizzare dell'enzima con due volumi di PBS / FCS 20%. Il volume totale diventa tre volte il volume della sospensione cellulare vasi nel passaggio 4.4. Trasferire la sospensione cellulare-nave di nuovo in nuovi tubi PP.
  7. Incubare la sospensione per 5 min a 37 ° C per separare ad-DMV rimanga grasso per gravità. Quindi rimuovere con attenzione il surnatante grasso principale con una precisione pipetta da 1 ml. Ripetere questo ciclo più volte con una pipetta di precisione da 100 ml fino a quando la sospensione sembra essere priva di grassi.
  8. Mettere un filtro da 500 micron in cima ad una provetta da centrifuga conica da 50 ml. Trasferire la sospensione cellulare vasi con una pipetta di misurazione 10 mL dai tubi 14-mL PP sulla membrana filtrante per rimuovere i coaguli residuo grasso. Trasferire la sospensione filtrata in nuove provette da 14 mL PP secondo il numero dei singoli ad-DMV isolati per gli esperimenti pianificati.
    NOTA: Per in Vitro saggi incentrati sulla formazione rete microvascolare, può essere utile per purificare ulteriormente la sospensione cellulare vasi per migliorare la qualità delle immagini durante analisi al microscopio. A tale scopo, la sospensione può essere ulteriormente filtrata una volta con un filtro da 20 micron per rimuovere le cellule singole dal ad-DMV raccolti sul filtro.
  9. Centrifugare la sospensione cellulare cardiovascolare (600 xg, 5 min, temperatura ambiente) per ottenere un pellet contenente ad-DMV.
  10. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante fino 1 mL viene lasciata. Risospendere il pellet con ad-DMV in 1 ml e trasferire la sospensione in una provetta conica da 1,5 mL.
  11. Centrifugare la sospensione ad-DMV nella provetta (600 xg, 5 min) per ottenere un pellet.
  12. Rimuovere il surnatante per risospendere il pellet nel volume finale richiesto di PBS / FCS 20%.
    NOTA: Il numero di ad-DMV per isolare può essere valutata mediante conteggio al microscopio. A tale scopo, 1/10 della cellula-vesse finalel sospensione viene diluita 1:10 in PBS e 100 pl di questa diluizione vengono trasferiti in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. L'intero numero di ad-DMV presentante una morfologia a recipiente viene contato e estrapolato a tutta isolare. La concentrazione ad-MVF richiesto e la purificazione possono essere adattati individualmente al rispettivo in vitro o in vivo applicazione dell'annuncio-DMV. Ciò può includere l'incorporamento di annuncio-DMV in gel di collagene per l'analisi in vitro di formazione rete microvascolare o la semina di ad-DMV su scaffold per l'impianto in vivo in difetti del tessuto.

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Risultati

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Nel presente studio abbiamo eseguito sei procedure di isolamento ad-MVF con il tessuto grasso da 7 a 12 mesi maschio wild-type C57BL 6 topi / (peso corporeo medio: 35 ± 1 g). La Figura 1 illustra la raccolta dei cuscinetti adiposi dell'epididimo murini con conseguente isolamento meccanico ed enzimatica ad-DMV. Il tempo necessario per la raccolta di grasso era 30 minuti e per l'isolamento di ad-DMV era di 120 min. In totale, la procedura ha avuto 150 min.

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Discussione

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In questo studio vi presentiamo un protocollo consolidata per l'isolamento di ad-MVF. Ottenere ad-MVF dal tessuto adiposo murino è una procedura semplice con pochi passaggi critici. I topi mostrano sottocutaneo diverso e depositi di grasso intra-addominale. Come precedentemente descritto per ratti, la fonte di grassi più adatto per l'isolamento di annuncio-DMV sono i cuscinetti adiposi dell'epididimo causa delle loro dimensioni, struttura omogenea e poco contaminate con vasi sanguigni più grandi

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

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Siamo grati per l'eccellente assistenza tecnica di Janine Becker, Caroline Bickelmann e Ruth Nickels. Questo studio è stato finanziato da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG - German Research Foundation) - LA 2682 / 7-1.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta per microcentrifuga conica da 1,5 mLVWR, Kelsterbach, Germania700-5239
100-µ Pipetta di precisione LEppendorf, Amburgo, Germania4920000059
Pipetta dosatrice da 10 mlCostar, Corning Inc., New York, USA4488
Provette in PP da 14 mlGreiner bio-one, Frickenhausen, Germania187261
Pipetta di precisione da 1 mlEppendorf, Amburgo, Germania4920000083
500-µ m filtro (pluriStrainer 500 µ m)HISS Diagnostics, Friburgo, Germania43-50500-03
Provetta da centrifuga conica da 50 mlGreiner bio-one, Frickenhausen, Germania227261
50 mL Pallone di ErlenmeyerVWR, Kelsterbach, Germania214-0211
Piastra a 96 pozzettiGreiner bio-one, Frickenhausen, Germania65518
soluzione di distacco cellulare (Accutase)eBioscience, San Diego, CA USA00-4555-56
C57BL/6 topiCharles River, Colonia, Germania027
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J topiThe Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA003291
CD117-FITCBD Biosciences, Heidelberg, Germania553373
CD31-PEBD Biosciences, Heidelberg, Germania553354
Collagenasi NB4G Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germania17465.02Lotto testato dal produttore per l'attività enzimatica
Forbici da dissezioneBraun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, GermaniaBC 601
Colorante legante il DNA (bisbenzimmide H33342)Sigma-Aldrich, Taufkirchen, GermaniaB2261
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) PAN Biotech, Rickenbach, GermaniaP04-03600
Siero fetale di vitello (FCS)Biochrom GmbH, Berlino, GermaniaS0615
Pinze finiS& T AG, Neuhausen, SvizzeraFRS-15 RM-8
Forbici finiWorld Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA503261
Sostituto dermico della pelle (Integra)Integra Life Sciences, Sain Priest, Francia62021
Ketamina Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germania7005294
M-IgG2akAL488   eBioscience, San Diego, CA USA53-4724-80
Octeniderm (soluzione disinfettante)Schü lke & Mayer, Norderstedt, Germania118211
Penicillina/StreptomicinaBiochrom, Berlino, GermaniaA2213
Piastra di PetriGreiner bio-one, Frickenhausen, Germania664160
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Lonza Group, Basilea, Svizzera17-516F
pluriFiltro 20-µ m (20 µ HISS Diagnostics, Friburgo, Germania43-50020-03
Rat-IgG2akFITCBD Biosciences, Heidelberg, Germania553988
Rat-IgG2akPEBD Biosciences, Heidelberg, Germania553930
Forbici per piccola preparazioneS& T AG, Neuhausen, SvizzeraSDC-15 R-8S
Pinze chirurgicheBraun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, GermaniaBD510R
Nastro (Heftpflaster Seide) 1,25 cmFink & Walter GmbH, Mechweiler, Germania1671801
Xilazina Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germania1320422
α-SMA-AL488eBioscience, San Diego, CA USA53-9760-82La marcatura intracellulare richiede inoltre Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germania; #554722)

Riferimenti

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