Questo lavoro descrive un protocollo che utilizza un approccio risolti dai componenti per studiare la sensibilizzazione agli allergeni pollenici in una coorte di pazienti provenienti dalla Cina meridionale con rinite allergica e / o asma.
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Articolo metodologico
Un approccio diagnostico risolto con componente per uno studio sugli allergeni di polline delle erbe nei meridionali cinesi con rinite allergica e / o asma
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La sensibilizzazione al polline dell'erba impone un rischio globale per le malattie allergiche delle vie aeree. Sebbene la prevenzione si basi sull'indagine locale degli allergeni pollini, i dati su questo argomento sono limitati nella Cina meridionale. Tutti i dati disponibili sono stati ottenuti tramite questionari di autocertificazione, test di prick cutanei e test IgE totali o specifici utilizzando estratti grezzi. Per molti motivi questi metodi sono inaffidabili. La reattività del siero serpente all'erba di Bermuda, l'erba di Timothy e gli allergeni di Humulus scandens in una coorte di pazienti provenienti da Greater Guangzhou (la città più grande della Cina meridionale e le sue periferie) con rinite allergica e / o asma sono state esaminate usando un analizzatore di immunoassay completamente automatizzato come componente - strumento diagnostico (CRD) risolto.
Per la prima volta, è stata dimostrata una prevalenza notevolmente elevata della positività sIgE in erba bermuda nei meridionali cinesi con rinite allergica e / o asma. In questi pazienti, una sottile prevalenza di sensibilizzazioneAnche per l'erba di Timothy e gli scandini di Humulus , che possono derivare dalla reattività incrociata, in quanto i due ultimi non sono comuni nella regione. Questo è stato anche supportato dall'individuazione di componenti allergeni.
Gli analizzatori di immunoassay completamente automatizzati possono offrire consistenza soddisfacente tra regioni, laboratori e istituzioni e nel tempo. L'automatismo dello strumento può consentire una rilevazione standardizzata che non sarebbe stata immediatamente rivelata prima dell'avvento del CRD.
Questo è uno studio che utilizza un approccio CRD per indagare la sensibilizzazione agli allergeni pollenici dell'erba in Cina meridionale. Aggiunge le evidenze attuali in letteratura. Studi futuri sono necessari per convalidare questi risultati. Tuttavia, sebbene CRD sia uno strumento utile, i risultati ottenuti con l'analizzatore immunologico completamente automatizzato non dovrebbero sostituire altre indagini di laboratorio, valutazioni cliniche e competenze mediche.
Introduzione
Il polline erba rappresenta quasi il 50% delle allergie legate all'immunoglobulina E (IgE) e, a causa della sua natura aerea, impone un rischio globale di malattie allergiche delle vie aeree, in particolare l'asma e la rinite allergica 1 , 2 , 3 , 4 . La prevenzione delle allergie polline di erbe in una regione si basa su informazioni sulla distribuzione locale degli allergeni pollenici. Purtroppo lo spettro degli allergeni sensibilizzanti varia da luogo a luogo, un'osservazione generalmente nota come specificità regionale.
In Cina, un vasto territorio dell'Asia orientale, la specificità regionale della sensibilizzazione del polline erboso è ulteriormente complicata da dati limitati attualmente disponibili dalla parte meridionale del paese negli ultimi decenni 5 . Tale pacchione nei dati ha portato ad una difficoltà nel mostrare la sensibilità generale del polline dell'erbaIn questo grande paese 6 . Inoltre, i dati molto limitati sui meridionali cinesi sono stati ottenuti in gran parte da questionari di autocertificazione, test di prick cutanei (piuttosto che da test di siero di laboratorio), misure totali IgE (anziché IgE specifiche allergene) e rilevamento di allergeni a Piuttosto che alle molecole di componenti allergene).
L'auto-segnalazione di sintomi allergici può essere inaffidabile quando si tratta di allergeni specifici. I test di pelli cutanei, pur ampiamente accessibili, implicano l'uso di estratti di allergeni grezzi non standardizzati, che possono contenere altri componenti sensibilizzanti che confondono l'interpretazione dei risultati. L'affidabilità del test cutaneo della pelle dipende anche dalla manipolazione abile da parte di allergisti o infermieri specializzati, l'uso recente di istamina e la conformità del paziente (a volte molto difficile per i bambini piccoli). L'IgE totale è utile per la screening di un'allergia, ma non determina sensibilmenteE offendere allergeni in un paziente. Inoltre, quasi tutti gli allergeni contengono una serie di molecole di componenti allergeni. La sensibilizzazione dei componenti principali ( es. Der p 1 e Der p 2 da acari della polvere domestica) può suggerire un'allergia "genuina" (allergia ad un allergene specifico, piuttosto che falsa positività dovuta a reazioni trasversali con altri allergeni), ma sensibilizzazione A determinati ( cioè il Der p 10 cross-reattivo, un tropomosiosina) non può essere 7 .
Prima di introdurre la diagnostica risolta con componenti (CRD), questi fallimenti deludenti impedivano studi di allergene in Cina. CRD rileva con precisione i componenti di un allergene utilizzando molecole allergene ricombinanti o purificate, rendendo quindi la misurazione facilmente quantificabile e caratterizzabile 8 . Negli ultimi decenni, gli studi di allergia hanno spesso impiegato estratti grezzi di allergeni che inevitabilmente contengono una serie di componenti irrilevanti. Molti di questi coI componenti sono inerti, ma occasionalmente, alcuni potrebbero portare a confondere reazioni positive. L'uso di molecole allergene ricombinanti o purificate in CRD può aggirare questo e quindi fornire una migliore precisione di test. Quando vengono elaborati in microarray, un approccio CRD rapida o identifica la sensibilizzazione a centinaia di molecole di allergeni nei singoli soggetti. Attualmente manca uno studio CRD ben progettato sulla sensibilizzazione del polline erboso nel sud della Cina. Idealmente, un tale studio dovrebbe includere una popolazione locale di notevole copertura geografica, tenendo conto dei pollini d'erba comunemente riportati in Cina e affrontare gli aspetti tecnici sopra menzionati. Per raggiungere un livello pratico di rilevanza clinica e per facilitare l'assunzione di campioni di siero, le prime indagini sulla sensibilizzazione dei pollini d'erba come allergeni inalanti possono anche essere concentrati su pazienti con disturbi respiratori allergici, piuttosto che sulla popolazione generale.
Questo lavoro descrive un metodoUtilizzato per testare la reattività del sIgE sierico all'erba di Bermuda, l'erba Timothy e gli scandini Humulus nei pazienti di Greater Guangzhou (la più grande città della Cina meridionale e le sue periferie) con rinite allergica e / o asma utilizzando l'approccio CRD 5 . Questi risultati sulla sensibilizzazione a questi pollini subtropicali e temperati dell'erba nel sud della Cina aggiungono elementi importanti a quelli attualmente in letteratura.
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Protocollo
Il protocollo di studio, incluso l'uso del campione di siero umano, è stato approvato dal Comitato Etico, primo ospedale affiliato di Guangzhou Medical University. Tutti i partecipanti hanno fornito un consenso informato scritto, indipendentemente o tramite i loro genitori (nel caso dei bambini). Il protocollo è stato registrato in linea (Registro di prova clinico cinese, Registro no: ChiCTR-DCC-13004003, fare riferimento a http://www.chictr.org/cn/).
1. Identificazione della popolazione dello studio
NOTA: Il repository di informazione sull'allergia del Laboratorio chiave di Stato della malattia respiratoria (AIR-SKLRD) è la principale fonte di reclutamento del paziente, in quanto AIR è il database più documentato di pazienti per test di allergeni nella Cina meridionale 9 , 10 . AIR ha conservato campioni di siero di pazienti per quasi un decennio. In breve, questi campioni conservati sono stati precedentemente preparati mediante centrifugazione di 5 mL oF sangue venoso phlebotomized per 10 min a 3.000 xg e recupero del supernatante. I campioni di siero sono stati collocati in frigoriferi da -80 ° C per l'immagazzinamento a lungo termine. I campioni che hanno incontrato i criteri di inclusione del paziente erano pronti per essere utilizzati per tutti i test nello studio in corso.
- Dalla base del database AIR, recuperare i dati sui pazienti con rinite allergica e / o asma che hanno sottoposto i test sierici per l'allergene erboso sIgE tra gennaio 2013 e giugno 2015, il periodo di studio pre-progettato.
- Selezionare i pazienti con rinite allergica e / o asma da lieve a moderata secondo la rinite allergica e il suo effetto sull'asma (ARIA) 11 e sull'iniziativa globale per l'asma (GINA). Assegnali come "gruppo di studio".
- Escludere i pazienti con incompleta documentazione medica, quelli persi per il follow-up, quelli che rifiutano di dare consensi informati sull'uso dei loro campioni di siero per scopi scientifici, quelli con iLa disfunzione medica, quelli attualmente in immunoterapia o agenti immunomodulatori, o quelli che si trovano ad avere infezioni parassitarie.
- Selezionare una coorte contemporanea di pazienti con allergie non respiratorie ( es. Eczema, dermatite allergica e allergia alimentare) secondo gli stessi criteri di esclusione e assegnarli come "gruppo di controllo".
- Assicurarsi che i campioni di siero siano stati raccolti prima di qualsiasi prescrizione o trattamento è stato dato per ridurre al minimo gli effetti confondenti sui risultati del laboratorio. Escludere qualsiasi campione di siero che non soddisfi questo requisito.
- Assicurarsi che tutti i soggetti siano residenti permanenti da tutte le parti del Grande Cantone ( vale a dire, nati o hanno vissuto lì per più di 10 anni).
2. Flusso di studio e misurazioni di interesse
- Recuperare i campioni di siero di pazienti ammissibili dalla biobank. Per testare un componente allergenico / allergene, utilizzare 140 μL di siero (compresa 100 μl per riempireLo spazio morto).
NOTA: Il volume totale del siero totale necessario per ogni paziente in questo studio è: 3 allergeni specifici e 8 componenti allergeni, sIgE = 140 μL * 11 = 1.540 μL. - Quando si utilizza questo strumento, prima di tutto testare i campioni di siero per sIgEs a allergeni interi dell'erba di Bermuda, erba Timothy e Hagenus scandens . Seguire le istruzioni riportate nella Sezione 3.
NOTA: Questi pollini sono stati selezionati per le misurazioni perché gli erba di Bermuda 13 , 14 , 15 e Humulus scandens 16 sono stati ampiamente riportati in Cina, mentre l'erba Timothy 17 , 18 , 19 è una tipica specie vegetale che vive in ambienti che vanno dalla tropicale al temperato Zone ed è più studiata in tutto il mondo. - In secondo luogo, prova i campioni di siero identificati nel passaggio 2.3 per avereSIgEs a allergeni interi per la presenza di sIgEs ai componenti allergeni di Bermuda [Cyn d 1 (g216)], Timothy [Phlp 1 (g205), Phl p 4 (g208), Phl p 5 (g215), Phl p 6 (g209 ), Phl p 7 (g210), Phl p11 (g211) e Phl p 12 (g212)], e determinanti carboidrati cross-reattivi [CCD (o214)]. Seguire le istruzioni riportate nella Sezione 3.
3. Procedura di prova completamente automatizzata usando il sistema di analisi Immunoassay
NOTA: L'intera procedura di test di allergen sIgE, completamente automatizzata e descritta altrove 7 , 8 , 9 , 10 , segue il protocollo del produttore.
- Avviare l'analizzatore di immunoassay completamente automatizzato ( ad es. ImmunoCAP1000) e utilizzarlo per eseguire l'immunoassay durante lo studio. Accendere il computer IDM incorporato.
NOTA: L'analogo dell'immunoassayYzer è in modalità stand-by. - Con "Primary Power" acceso, accendere la "Power System" e attendere 3 minuti fino a quando il software incorporato inizia. Fare clic su "Carica risciacquo" e "Carica soluzione di lavaggio".
- Aggiungere 140 μL di siero in una fiala per ogni test di componenti allergeni / allergeni. Etichettare ogni fiala contenente 140 μL di siero con un numero di identificazione unico per ogni paziente.
- Dall'interfaccia IDM, eseguire le seguenti operazioni facendo clic sul menu.
- Controllare la finestra "Richiedi elenco" sull'ID per assicurarsi che "sIgE" sia il metodo di prova da scegliere.
- Caricare i tubi di campionamento nei rack di campionamento e nei tubi di controllo della qualità nei rack di controllo di qualità, con codici a barre.
NOTA: Per ciascun paziente, è stato inizialmente previsto un test per sIgE a 3 allergeni specifici e 8 componenti allergeni o 346 * 11 (3.806) tubi campione. Per ogni tubo di campionamento, 3 tubi di controllo qualitàChe contengono bassi, medi e elevati livelli di controllo sIgE (vedere la tabella dei materiali per i dettagli) sono stati abbinati. Infine, solo il 58 pazienti che hanno provato positivi nel test primario (fase 2.3) sono stati ulteriormente esaminati nel test secondario (fase 2.3). Il caricamento dei tubi può essere impostato automaticamente sulla console del computer. - Selezionare "Load Reagents" nella schermata "Processing Assay". Completa il caricamento del rack di campionamento e di controllo qualità, soluzione di sviluppo, coniugato, calibratori, portante, pipette, soluzione di arresto e soluzione di lavaggio secondo la "lista di caricamento" (vedere la tabella dei materiali per i dettagli).
- In "Carica e inizio", premi "OK".
NOTA: Al termine della misurazione, i risultati vengono visualizzati sull'IDM. - Dall'interfaccia IDM, selezionare i dati da esportare. Fai clic su "Menu", "Approva" e "Salva con nome" e esporta i risultati della misurazione sIgE come un foglio di foglio di calcolo.
- Importa il file foglio di calcolo in un software statistico ( ad esempio, SPSS) 10 . Utilizzando un modulo specifico per i coefficienti di Spearman dal menu SPSS, analizzare le correlazioni nella sensibilizzazione tra questi pollini d'erba (sIgE positivo all'intero allergene) e componenti polline (sIgE positivo alle molecole allergene).
4. Definizione della reattività di sIgE
NOTA: Per un campione di siero non diluito, la gamma di misura specifica IgE è di 0,35 a 100 kU / L.
- Diluire i campioni con valori sIgE> 100 kU / L 1: 5 e re-assay. Se il valore rimane superiore a 100 kU / L, procedere con ulteriori diluizioni fino a raggiungere un livello finale fino a 1000 kU / L.
- Sulla base del valore di soglia di 0,35 kU / L, considerare un livello di sIgE superiore a 0,35 kU / L per essere positivo 5 , 7 , 10 . Valuta il reattivo(≥0,35 e <0,70 kU / L), classe 2 (≥0,70 e <3,50 kU / L), classe 3 (≥3,50 e <17,50 kU / L), classe 4 (≥ 17,50 e <50,00 kU / L), classe 5 (≥50,00 e <100,00 kU / L) e classe 6 (≥100,00 kU / L).
5. Analisi statistica
- Analizzare i dati con software statistico ( es. SPSS) 10 . Rapporti i dati quantitativi come la media e la deviazione standard, i dati qualitativi come intervalli medi e interquartile (IQR) e i dati categorici come percentuale dei risultati positivi.
- Utilizzare un test chi-quadrato per il confronto tra le categorie di proporzioni, un t-test indipendente per i dati quantitativi e un test di rango-somma per i dati qualitativi.
- Utilizzare il test di Pearson per analisi di correlazione tra i dati parametrici, con i coefficienti di correlazione espressi come "r" e il test di Spearman per i valori non parametrici, con tI coefficienti di correlazione espressi come " r s ". Considerare che la significatività statistica sia quando P valori <0.05.
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Risultati
L'analizzatore immunologico completamente automatizzato utilizzato in questo studio ha una struttura a fase solida ricoperta da accoppiamenti covalenti di allergeni o componenti allergeni che reagiscono con le molecole di interesse (sIgE) in campioni di siero del paziente. Con un programma automatico, l'analizzatore esce da tutte le IgE non specifiche con 150 μL di soluzione di risciacquo e ripete questa 5 volte. Quindi aggiunge anticorpi anti-IgE etichettati con enzimi (50 μL) p...
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Discussione
Gli analizzatori di immunoassay completamente automatizzati possono offrire consistenza soddisfacente tra regioni, laboratori e istituzioni e nel tempo. Tale procedura automatica è stata trovata a sostenere sostanzialmente la ricerca sul banco e gli studi clinici, consentire la rilevazione standardizzata di molti componenti allergeni e / o allergeni e identificare la probabilità cross-reattività allergica che non sarebbe stata immediatamente rivelata prima dell'avvento dei CRD. Inoltre, l'intera procedura di tes...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Yueming Su per la sua assistenza nella preparazione della figura. Questo studio è stato finanziato dalla Fondazione Guangdong di Scienza e Tecnologia (N. progetto: 2014A020212352), dall'Ufficio di formazione di Guangzhou (1201630044, 1201630393) e dalla National Science Foundation di Cina (NSFC 81572063; NSFC 81601394).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Strumento ImmunoCAP 1000 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Svezia) | 12-3800-01 | |
| Pacchetto software Phadia Information Data Manager | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Svezia) | 12-3801-11 | |
| Pacchetto software, ImmunoCAP 1000 | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Svezia) | 12-3801-12 | |
| g2 ( Erba delle Bermuda) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Svezia) | 14-4131-01 | |
| g6 (Timothy grass) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Svezia) | 14-4100-01 | |
| w22 (luppolo giapponese) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Svezia) | 14-4452-01 | |
| g216 (nCyn d 1) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Svezia) | 14-4972-01 | |
| g205 (rPhl p 1) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Svezia) | 14-5234-01 | |
| g208 (nPhl p 4) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Svezia) | 14-5288-01 | |
| g215 (rPhl p 5b) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Svezia) | 14-5338-01 | |
| g209 (rPhl p 6) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Svezia) | 14-5289-01 | |
| g210 (rPhl p 7) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Svezia) | 14-5290-01 | |
| g211 (rPhl p 11) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Svezia) | 14-5291-01 | |
| g212 (rPhl p 12) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Svezia) | 14-5292-01 | |
| o214 Determinanti dei carboidrati a reazione incrociata (CCD) | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Svezia) | 14-5339-01 | |
| IgE specifiche coniugate 400 | Thermo Fisher Scientific, Inc.(Phadia AB, Uppsala, Svezia) | 10-9310-08 | |
| Striscia calibratrice di IgE specifiche | Thermo Fisher Scientific, Inc.(Phadia AB, Uppsala, Svezia) | 10-9459-08 | |
| Striscia di controllo della curva delle IgE specifiche | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Svezia) | 10-9312-08 | |
| IgE specifiche anti-IgE ImmunoCAP | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Svezia) | 14-4417-01 | |
| ImmunoCAP Controllo IgE Negative | Specifiche Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Svezia) | 10-9445-01 | |
| ImmunoCAP Controllo delle IgE specifiche L | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Svezia) | 10-9528-01 | |
| ImmunoCAP Controllo delle IgE specifiche M | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Svezia) | 10-9529-01 | |
| ImmunoCAP Controllo delle IgE specifiche H | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala Svezia) | 10-9530-01 | |
| Soluzione | di sviluppoThermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Svezia) | 10-9439-08 | |
| Soluzione di arresto | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Svezia) | 34-2271-58 | |
| Soluzione di lavaggio | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Svezia) | 10-9202-08 | |
| FluoroC | Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Svezia) | 10-9264-01 | |
| Kit di soluzioni per la manutenzione | : Thermo Fisher Scientific Inc.(Phadia AB, Uppsala, Svezia) | 10-9476-01 |
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