Fette di cuore ventricolare dell'asse corto dell'urina per gli studi elettrofisiologici

Sommario

Qui descriviamo la preparazione di fette ventricolari vitali da topi adulti e il loro utilizzo per registrazioni potenziali di azione elettrodo. Queste preparazioni multicellulari forniscono una struttura tissutale conservata in vivo , che li rende un prezioso modello per studi elettrofisiologici e farmacologici in vitro .

Abstract

Cardiomiociti murini sono stati ampiamente utilizzati per studi in vitro di fisiologia cardiaca e nuove strategie terapeutiche. Tuttavia, le preparazioni multicellulari di cardiomiociti dissociati non rappresentano la struttura complessa in vivo di cardiomiociti, non miociti e matrice extracellulare, che influenza sia le proprietà meccaniche che elettrofisiologiche del cuore. Qui descriviamo una tecnica per preparare fette ventricolari vitali di cuori adulti con un tessuto tissutale in vivo e dimostrare la loro idoneità alle registrazioni elettrofisiologiche. Dopo l'escissione del cuore, i ventricoli vengono separati dall'atria, perfezionati con soluzione Ca ²⁺ -libera contenente 2,3-butanedione monoxime e incorporati in un blocco agarosio a basso contenuto di fusione al 4%. Il blocco è posto su un microtomo con una lama vibrante, e fettine di tessuto con uno spessore di 150-400 μm sono preparate mantenendo la vibrazione freDella lama a 60-70 Hz e spostare la lama in avanti in modo più lento possibile. La spessore delle fette dipende dall'ulteriore applicazione. Le fette vengono conservate in soluzione di Tyrode ghiacciata con 0,9 mM Ca ²⁺ e 2,3-butanedione monoxime (BDM) per 30 minuti. Successivamente, le fette vengono trasferite a 37 ° C di DMEM per 30 minuti per lavare il BDM. Le fette possono essere utilizzate per studi elettrofisiologici con elettrodi taglienti o matrici di microelettrodi, per misurare le forze per analizzare la funzione contrattile o per indagare l'interazione tra i cardiomiociti derivanti dalle cellule staminali trapiantati e il tessuto ospite. Per registrazioni di elettrodo nitide, una fetta viene posta in un piatto di coltura da 3 cm sulla piastra riscaldante di un microscopio invertito. La fetta è stimolata con un elettrodo unipolare e potenziali d'azione intracellulari di cardiomiociti all'interno della fetta sono registrati con un elettrodo di vetro nitido.

Introduzione

Le fette di tessuto sottile sono state utilizzate frequentemente nella scienza di base poiché Yamamot e Mcllwain hanno mostrato nel 1966 che l'attività elettrica delle fette del cervello è mantenuta in vitro ¹ . Da allora, studi elettrofisiologici e farmacologici sono stati condotti su fette da cervello ² , fegato ³ , polmone ⁴ e tessuto miocardico ^{5 , 6 , 7} . Le prime registrazioni di patch-clamp in fette ventricolari da cuori di ratto neonatale sono state descritte nel 1990 ⁸ , ma questa tecnica è caduta nell'oblio per un certo tempo. Più di un decennio più tardi, il nostro gruppo ha stabilito un nuovo metodo per preparare le embrioni murine ⁹ , le neonate ¹⁰ e le ¹¹ fette di cuore adulte. Queste fette di tessuto vitale possono essere utilizzate per esperimenti acuti (fetta adultaS possono essere coltivati ​​per diverse ore) o esperimenti di coltura a breve termine (fette embrionali e neonatali possono essere coltivate per alcuni giorni). Le fette mostrano in vivo caratteristiche elettrofisiologiche simili e una diffusione di eccitazione omogenea valutata con potenzialità di azione dell'elettrodo acuto e registrazioni a matrice di microelettrodi ¹¹ . Grazie alla loro morfologia "bidimensionale", consentono l'accesso diretto degli elettrodi di registrazione a tutte le regioni del ventricolo, che li rende uno strumento interessante per le indagini elettrofisiologiche e solleva nuove opzioni sperimentali rispetto ai cuori interi perfezionati da Langendorff. La risposta del farmaco delle fette ai bloccanti del canale ionico come verapamil (bloccante canale L-tipo Ca ²⁺ ), lidocaina (bloccante Na ⁺ -cannel), 4-aminopiridina (bloccante K ⁺ -kanelare dipendente dalla tensione non selettiva) e linopirdina (KCNQ K ^{+ -} blocco canale) ^{9 , 11} corrispondevano a effetti noti sui cardiomiociti dissociati. Le misure di forza isometrica hanno rivelato una relazione positiva di frequenza di forza e suggerito fortemente la funzione contrattuale intatta ¹⁰ . Questi risultati hanno dimostrato che le fettine ventricolari murine sono adatte come un modello di tessuto in vitro per studi fisiologici e farmacologici. Inoltre, le fetture ventricolari di cuori riceventi in combinazione con registrazioni di elettrodo nitide hanno dimostrato di essere uno strumento molto utile per caratterizzare l'integrazione elettrica e meccanica, nonché la maturazione dei cardiomiociti fetali ^{12 , 13 e 14} trapiantati.

In sintesi, le fetture ventricolari sono un prezioso e ben consolidato modello di tessuto multicellulare e devono essere considerati complementari ai cardiomiociti dissociati e ai cuori perfezionati da LangendorffNella ricerca cardiovascolare, con il grande vantaggio di fornire una struttura tissutale in vivo (in contrasto con le cellule dissociate), nonché l'accesso diretto delle tecnologie di misura come le registrazioni di elettrodo nitido a tutte le regioni del cuore (in contrasto con i preparati cardiaci interi).

Protocollo

La manipolazione degli animali deve essere conforme alle linee guida del comitato locale per la protezione degli animali e alla direttiva 2010/63 / UE del Parlamento europeo.

1. Preparare soluzioni

1. Preparare la soluzione di Tyrode senza Ca ²⁺ (composizione in mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH ₂ PO ₄ 0,33, MgCl2 1, glucosio 10, HEPES 5, 2,3-butanedione monoxime (BDM) 30. Regolare il pH a 7,4 Con NaOH a 4 ° C.
2. Preparare la soluzione di Tyrode con Ca ²⁺ (composizione in mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH ₂ PO ₄ 0,33, MgCl2 1, glucosio 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl2 0,9. Regolare il pH a 7,4 con NaOH a 4 ° C.
3. Preparare agarosio a basso contenuto di fusione al 4%: inserire 0,6 g di agarosio a bassa percentuale di fusione in soluzione di Tyrode da 15 ml senza Ca ²⁺ . Scaldare la miscela in un forno a microonde due volte a 750 W per 10-15 s finché l'agarosio non si scioglie. Tenere la soluzione a una temperatura costante di 37 &# 176; C e mescolare continuamente.
4. Mantenere il Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) senza siero a 37 ° C in bolle con carbogeno (5% CO ₂ , 95% O ₂ ).

2. Preparare il Microtomo

1. Accendere il microtomo.
2. Riempire la camera esterna del microtomo con ghiaccio.
3. Riempire la camera interna del microtomo con la soluzione di Tyrode ghiacciata senza Ca ²⁺ e continuamente ossigenare la soluzione con 100% O ₂ .
4. Mettere una lamiera d'acciaio nel porta-lama del microtomo.

3. Isolamento del cuore del mouse

1. Iniettare 2,500 U di eparina sottocutanea. Attendere 15 min.
2. Sacrificare l'animale per dislocazione cervicale.
3. Apri il petto con la sternotomia.
4. Separare con attenzione il pericardio usando piccole forbici e una pinza # 5.
5. Inserire una cannula nell'arto ascendente e perfezionare le arterie coronarie in situ con Tyrode's ghiaccio freddoSoluzione senza Ca ²⁺ fino a rimuovere il sangue rimanente.
6. Rescondare delicatamente il cuore con una pinza e forbici e trasferire il cuore in soluzione fredda di Tyrode, guidata senza Ca ²⁺ .
7. Separare l'atria dai ventricoli con un bisturi o forbici.

4. Incorporazione dei ventricoli in agarosio a basso contenuto di fusione del 4%

1. Posizionare i ventricoli con l'apice rivolto verso l'alto nello stampo agarosio ( Figura 1 ). Posizionare il perno in mezzo dello stampo nella camera ventricolare sinistra.
2. Riempire lo stampo con agarosio a basso contenuto di fusione al 4% a 37 ° C, finché il cuore non sia completamente coperto.
3. Posizionare lo stampo sul ghiaccio per una tempra più rapida dell'agarosio che impedisce il galleggiamento del tessuto.
4. Rimuovere il blocco di agarosio contenente i ventricoli dallo stampo con un bisturi.
5. Girare il blocco capovolto e riempire le camere ventricolari e il divario sul retro del blocco agarosio, cheS lasciata dal perno del molt, con agarosio a basso contenuto di fuso al 4% utilizzando una siringa con un ago da 20 G.
6. Tagliare il blocco di agarosio con uno scalpello per ottenere un fondo piatto del blocco e in posizione verticale dell'apice cardiaco.

5. Sezione del tessuto ventricolare

1. Fissare il blocco sul supporto del campione del microtomo con una goccia di colla cianoacrilato. Affrontare l'apice cardiaco verso l'alto.
2. Posizionare il supporto del campione nella camera del campione interno del microtomo, che è riempito di Tyrode senza ghiaccio senza Ca ²⁺ . Completamente coprire il blocco di agarosio con la soluzione di Tyrode.
3. Preparare le fette di asse corto a uno spessore di 150-400 μm, a seconda dell'ulteriore applicazione (per registrazioni di elettrodo nitido 150-200 μm), mantenere la frequenza di vibrazione della lama a 60-70 Hz e spostare la lama in avanti in modo più lento possibile .
4. Utilizzare una spazzola fine per rimuovere attentamente l'agarosio residuo dalle fette.
5. Trasferisce delicatamenteR sezioni con una pipetta Pasteur nella soluzione Tyrode con 0,9 mM Ca ²⁺ aerata con 100% O ₂ e conservarle per almeno 30 minuti in ghiaccio per recuperare dalla procedura di affettatura.
6. Successivamente, tenere le fette per 30 minuti in DMEM a 37 ° C, aerata con carbogeno, per lavare BDM prima dell'uso successivo.

6. Preparazione dell'installazione dell'elettrodo Sharp

1. Per il pre-riscaldamento, accendere tutti i dispositivi elettrici 30 minuti prima che le registrazioni inizieranno.
2. Mettere un piatto di coltura da 3 cm sulla piastra riscaldante posta sul microscopio invertito.
3. Posizionare l'elettrodo ad anello su misura ( figura 2 ) nel piatto e collegare i fili di messa a terra del preamplificatore e dell'elettrodo di stimolazione.
4. Collegare i tubi flessibili del sistema di perfusione al piatto.
5. Riempire il serbatoio del sistema di perfusione con DMEM, aerato con carbogeno.
6. Accendere la pompa di perfusione e impostare la perfusioneTe a 2-3 ml / min.
7. Regolare la temperatura del DMEM nel piatto a 37 ° C regolando il riscaldatore di flusso e la piastra riscaldante.

7. Potenziali registrazioni di azione

1. Mettere una fetta ventricolare nel piatto riempito con DMEM.
2. Controllare l'integrità strutturale e la vitalità (sulla base della funzione contrattile) del tessuto con il microscopio invertito.
3. Riempire un elettrodo di vetro di registrazione con 3 M KCL.
4. Riempire un elettrodo di stimolazione con DMEM.
5. Posizionare l'elettrodo di registrazione e l'elettrodo di stimolazione sui supporti degli elettrodi.
6. Posizionare con cura l'elettrodo di stimolazione sulla fetta e accendere lo stimolatore elettrico. Inizia con una frequenza di stimolazione di 1-2 Hz.
7. Spostare l'elettrodo di registrazione con il micromanipolatore sulla posizione di registrazione desiderata.
8. Abbassare lentamente l'elettrodo di registrazione fino a quando la punta tocca il tessuto.
9. Applicare un breve impulso elettrico rettangolare attraverso laL'elettrodo di registrazione per penetrare nella membrana cellulare.
10. Riposizionare con cautela l'elettrodo di registrazione fino a garantire un segnale stabile.
11. Avviare la registrazione dei potenziali di azione.

Risultati

L'infarto miocardico porta ad una perdita praticamente irreversibile di cardiomiociti. La terapia sostitutiva cellulare che utilizza cardiomiociti derivanti da cellule staminali per la rigenerazione cardiaca esogena è un approccio terapeutico promettente. L'integrazione elettrica e la maturazione delle cellule trapiantate sono fondamentali per la sicurezza e l'efficienza della terapia sostitutiva delle cellule.

Per...

Discussione

Le fetture ventricolari consentono studi elettrofisiologici, farmacologici e meccanici con una struttura tissue preservata in vivo e accesso diretto della tecnologia di misura a tutte le regioni del cuore. Le proprietà del potenziale fisiologico di azione sono state dimostrate in fette embrionali, neonatali e adulti ^{9 , 10 , 11} . La vitalità delle fette, ad eccezione degli strati superficiali direttamente danneggiati d...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Leica VT 1000s	Leica Microsystems, Wetzlar, Germania		Microtomo con lama vibrante.
Lame in acciaio inossidabile	Campden Instruments, Loughborough, Inghilterra	7550-1-SS
Pipette Pasteur	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	Z627992
Fine brush, e.g. misura 6 (4/32")	VWR, International, Radnor, USA	149-2125
Tavolo
autocostruito Molt per l'inclusione di ventricoli in agarosio			autoprodotto
1 ml siringa	Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA	300013
27 G x 3/4'' Aghi	Braun, Melsungen, Germania	4657705
20 G 11/2'' Aghi	4657519
Forbice piccola	WPI, Sarasota, USA	501263
Pinzette #5, 0,1 x 0,06 mm	punta WPI, Sarasota, USA	500342
Gas ossigeno (grado medico O2)	Linde, Monaco di Baviera, Germania
Gas carbogen (95 % O2, 5 % CO2)	Linde, Monaco di Baviera, Germania
NaCl	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	7647-14-5
KCl	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	746436
CaCl2	Sigma-Aldrich, St. Louise, USA	746495
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louise, Stati Uniti	NIST200B
HEPES	Sigma-Aldrich, St. Louise, Stati Uniti	51558
NaHCO3	Sigma-Aldrich, St. Louise, Stati Uniti	S5761
D(+)-glucosio	Sigma-Aldrich, St. Louise, Stati Uniti	G8270
MgSO4	Sigma-Aldrich, St. Louise, Stati Uniti	M7506
NaOH	Sigma-Aldrich, St. Louise, Stati Uniti	S8045
Colla cianoacrilica	Henkel, Dü sseldorf, Germania
Agarosio Roth a basso punto di fusione	, Karlsruhe, Germania	6351.2
Eparina-sodico-25000 I.E./5 mL	Ratiopharm, Ulm, Germania
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), glucosio alto, GlutaMAX	ThermoScientific, Waltham, USA	10566016
SEC-10LX Amplifier	npi electronic GmbH, Tamm, Germania	SEC-10LX
EPC 9	HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germania
Zeiss Axiovert 200	Zeiss, Oberkochen, Germania
Micromanipolatore a basso ingrandimento	Narashige, Tokyo, Giappone	Nm-3
Micromanipolatore a tre assi ad alto ingrandimento	Narashige, Tokyo, Giappone	MHW-3
Pompa	di perfusione peristalticaMulti Channel Systems, Reutlingen, Germania	PPS2
Regolatore di temperatura a 2 canali	Multi Channel Systems, Reutlingen, Germania	TCO02
Stimolatore di impulsi quadrato	Natus Europe GmbH, Planegg, Germania	Grass SD9
Capillari in vetro	WPI, Sarasota, USA	1B150F-1

di preparazione