Riassorbimento degli acidi biliari nell'intestino tenue-dipendente e feedback inibizione della sintesi dell'acido di bile epatica è importante per la salute e l'omeostasi sistemica. In questo studio, descriviamo un modello murino per resezione ileale valutare il malassorbimento indotta da ileectomy bile, overaccumulation e tossicità nell'intestino del mouse.
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Articolo metodologico
Overaccumulation ileectomy-indotta della Bile nell'intestino del Mouse
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La resezione intestinale è un comune approccio terapeutico per le malattie umane quali l'obesità, le malattie infiammatorie intestinali, morbo di Crohn e tumore del colon che si traduce spesso in effetti avversi di intestino corto grave sindrome-come compreso diarrea degli acidi biliari, disidratazione, alterazioni elettrolitiche e malassorbimento dei nutrienti. Qui vi presentiamo un modello murino di resezione ileale, chiamato ileectomy, per valutare la comunicazione del tessuto e il mantenimento dell'omeostasi sistemica. Dopo resezione ileale, sangue circolante è permanentemente priva il fattore di crescita del fibroblasto ileo-specifico ormone endocrino 15 (FGF15), che rilascia la sua endocrine inibizione della sintesi degli acidi biliari nel fegato. In combinazione con l'aumento della produzione e abolita riassorbimento degli acidi biliari dopo aver rimosso l'ileo, topi che ha subito l'ambulatorio soffrono overaccumulation sale biliare nell'intestino e la diarrea associata, la morbosità e la mortalità. Romanzo l'utilizzo del modello chirurgia introdotto in questo studio può fornire le comprensioni meccanicistiche e funzionale nel controllo ileale di regolazione metabolica sistemica nella fisiologia e nella malattia.
Introduzione
Nella moderna ricerca biomedica, modelli animali geneticamente manipolati sono ampiamente utilizzati per raccogliere intuizioni in malattie umane. In particolare, tessuto o cellula-specifico funzioni di guadagno e perdita di geni sono state utilizzate per studiare la regolazione molecolare così come gli effetti biologici indotti. Nonostante i progressi nel manipolare geni bersaglio in vivo, non ci sono limitazioni persistente. Primo, molte delle cellule o del tessuto specifiche delezioni interesserà gli organi multipli. Ad esempio, omissione del gene epiteliali eliminerà espressione negli epiteli dei tessuti multipli. Ulteriormente, anche se l'eliminazione è limitato ad un tessuto specifico, controllo spaziale è raramente realizzabile. Per esempio, in un tessuto come l'intestino, segmenti distinti svolgere funzioni molto specifiche che non possono essere manipolate con precisione in vivo. In queste situazioni, resezione dei tessuti contenenti gene è considerata come un approccio più efficiente di studio per determinare il significato meccanicistico e funzionale di comunicazione del tessuto.
Ileectomy è principalmente usato in pazienti con Crohn e malattie infiammatorie che coinvolge l'ileo distale 1,2,3. L'ileo in genere produce diversi ormoni di deposito di energia come fattore di crescita fibroblastico 15/19 (FGF15/19), peptide YY (PYY) e peptide glucagone-simile 1/2 (GLP1/2); questi ormoni svolgono i ruoli importanti locali ed endocrini in molte funzioni biologiche4,5,6. Tra questi ormoni, FGF15 è stato identificato come un robusto endocrino inibitore della sintesi degli acidi biliari nel fegato. Una volta riassorbito nel enterocytes ileale, acidi biliari attivano il recettore di farnesoid X di recettori nucleari (FXR) stimolare l'espressione di Fgf15 , che successivamente conduce ad inibizione di risposte di sintesi di acidi biliari epatici 7. In uno studio recente, abbiamo introdotto il modello di ileectomy di topo per studiare il fattore kruppel-like ileale 15 (KLF15) -Fgf15 segnalazione asse che regola la produzione circadiana dell'acido di bile nel fegato 8. La cosa più importante, abbiamo introdotto una nuova famiglia, i fattori di kruppel-like, specialmente KLF15, in biologia degli acidi biliari. Basato su studi funzionali, compresa la chirurgia ileectomy, abbiamo determinato quella sintesi di acidi biliari sopraregola KLF15 tramite un meccanismo non-epatico indiretto. Infine, KLF15 ileale è anche identificato come il primo regolatore endogeno negativo di Fgf15.
I segmenti intestinali discendente da prossimale a distale regioni sono responsabili di assorbimento dei diverse nutrienti. L'ileo è il segmento principale responsabile degli acidi biliari e della vitamina B12 (VB12) assorbimento 9. Un precedente studio ha impiegato un modello murino di resezione dell'intestino prossimale per studiare la sindrome da intestino corto; vari tipi di sutura, diete e lunghezze di resezione sono stati proposti per mantenere un tasso di sopravvivenza post-operatorio ottimale 10. Inoltre, una revisione più recente indica che la resezione ileale in genere comporta la malattia più severa rispetto altre resezioni di segmento gastrointestinale (GI) a causa della diminuita capacità di adattamento del rimanente tratto 11. Questo argomento ha guadagnato intensivi interessi di gruppi di ricerca clinica e di base, mentre la comprensione del recupero e gli approcci terapeutici efficaci sono ancora limitate.
Acidi biliari diarrea risultati da squilibri nell'omeostasi dell'acido di bile nella circolazione enteroepatica 12,13. Può essere una conseguenza della resezione ileale, malattia gastrointestinale o un risultato di malassorbimento idiopatico dell'acido di bile. Più dell'80% dei pazienti sono stati trovati per presentare con diarrea dopo avere subito la resezione ileale 14. Ileectomy ha il potenziale per essere un modello di intervento chirurgico importante per l'indagine di acidi biliari diarrea. In questo studio, una serie di resezioni ileali forniscono una valutazione gradiente di carenza di FGF15 così come malassorbimento intestinale di sali biliari, overaccumulation e danni tossici.
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Protocollo
protocollo animale è stato esaminato e approvato dal comitato di uso presso Case Western Reserve University School of Medicine e istituzionali Animal Care ed è stato condotto in conformità con la guida del National Institutes of Health (NIH) per la Cura e l'uso degli animali da laboratorio (8 ° edizione, 2011). Topi sono stati eutanasizzati dai metodi compatibile con l'associazione medica veterinaria americana (AVMA) linee guida per l'eutanasia degli animali (edizione 2013). C57BL/6J, Maschio, 8-16 settimana vecchi topi sono stati usati in questo protocollo. Topi sono stati alloggiati in un ambiente buio/luce ciclo di 12 h.
1. preparazione pre-operatoria
- topi di trasferimento per una gabbia pulita 24 h prima della procedura. Gli animali ammessi libero accesso all'acqua. Sostituire il chow cibo con cibi morbidi (gel integratore alimentare) 4-6 h prima della chirurgia per ridurre il contenuto dell'intestino tenue per chirurgia.
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e preparare i materiali chirurgici sterili monouso. Pulire l'area di chirurgia e il cono di naso anestetico con etanolo al 70%.
- Impostare un microscopio di dissezione, vaporizzatore anestetico isoflurano, strumenti, e di un temperatura controllata piccolo animale tavolo operatorio per manutenzione di temperatura del corpo. Organizzare gli strumenti, suture e siringhe in una posizione per il libero accesso durante l'intervento chirurgico.
- Impostare una fonte di luce per fornire abbastanza luce per l'area chirurgica.
- Preparare soluzione fisiologica 0,9% sterile nella siringa da 5 mL per la pulizia intestinale e addominale.
2. Ileectomy e l'anastomosi
- Anesthetize topi con isoflurano (2-3%) in una camera di incubazione animale piccolo. Determinare adeguate amputate utilizzando la tecnica del pizzico di punta, mentre l'animale è il isoflurane.
- Rimuovere capelli addominali applicando il prodotto di rimozione dei capelli e pulire capelli distanza utilizzando spugne chirurgiche, mantenendo l'anestesia. Posizionare il mouse su un temperatura controllata piccolo animale tavolo chirurgico ( Figura 1 A) per mantenere la temperatura corporea presso l'anestesia Maintain a 37 ° C. con isoflurano (1-2%) attraverso una maschera facciale. Trattare gli occhi del mouse con unguento oculare.
- Pulire la pelle con povidone-iodio e 70% di alcol e coprire l'area chirurgica dell'addome con garza chirurgica sterile ( Figura 1 B).
- Fare un'incisione addominale del midline usando un bisturi chirurgico una volta che l'anestesia è in vigore. Usare un applicatore con punta di cotone per proteggere il muscolo addominale del mouse intestino e tirare con Divaricatori per completamente aprire ed esporre la cavità addominale ( Figura 1 C).
- Individuare l'intestino cieco. A partire dall'intestino cieco, spostare con cautela l'ileo collegato e parte del digiuno dalla cavità addominale ( Figura 1 D).
Nota: L'intestino cieco possa essere facilmente identificato grazie alle sue grandi dimensioni anche dopo digiuno. - Legare il ramo superiore dell'arteria mesenterica superiore con una sutura in seta 7-0 per occludere il sangue fornendo il segmento ileale che deve essere asportato. Il colore ileale cambia dal rosa al viola scuro dopo la legatura. ( Figura 1 -E - F).
- a seconda dello scopo dell'esperimento, usando le forbici, asportare e rimuovere il 50% o 90% dell'ileo.
Nota: Per la chirurgia di sham, non eseguire la legatura dell'arteria mesenterica superiore e non rimuovono l'ileo. - Irrigare il lume di entrambe le estremità ileale con soluzione fisiologica allo 0,9%.
Nota: come ileo intatto restante sta ancora ricevendo un rifornimento di anima normale dall'arteria mesenterica superiore, una piccola quantità di sangue verrà svuotata durante il processo. Questo indica anche che l'afflusso di sangue alle estremità ileale è normale e non assicura ischemia durante la procedura di anastomosi ( Figura 1 G). - Individuare i mesenteries sul lato di entrambe le estremità ileale. Allineare i mesenteries e suturare le estremità ileale insieme usando 8-0 sutura ( Figura 1 G - H).
- Sutura sul lato controlaterale dell'ileo per mantenere l'ileo anastomizzato in maniera naturale ( Figura 1 ho).
- Suturare i lati superiori e inferiori tra le due suture originale a accuratamente unire le due ileale estremità insieme ( Figura 1, J).
- Confermare che non esiste nessuna perdita dal sito anastomosi dopo aver terminato la procedura di suturazione di tre fasi ( Figura 1 G-io). Restituire l'intestino cieco e piccolo intestino nella cavità addominale nella posizione anatomica originale. Lavare l'area operata con soluzione fisiologica 0,9% caldo utilizzando un ago smussato. ( Figura 1 K).
- Chiudere l'incisione dello strato muscolare addominale con sutura 6-0. Allineare l'incisione addominale pelle usando il forcipe e suturare la pelle addominale per facilitare la cicatrizzazione ottimale ( Figura 1 L).
3. Cure post-operatorie
topi- trasferimento post-chirurgia per un'unità di cure intensive per il recupero. Ospitarli in una gabbia di lettiera in carta su un rilievo di riscaldamento a temperatura controllata per continuare il recupero post-operatorio durante la notte. Topi con cibi morbidi, oltre al normale cibo e acqua di alimentazione.
- Amministrare buprenorfina (0,05 - 0,1 mg/kg) con iniezione sottocutanea ogni 8-12 h per analgesia.
Nota: Eutanasia topi di CO 2 se gravemente malato. - Nel punto finale, sacrificare topi utilizzando overdosed isoflurano e raccolto campioni come necessario (sezione 4).
4. Valutazione di Overaccumulation di Bile indotta da Ileectomy
- pesare e sezionare i topi un giorno dopo una resezione di 0% (falsità), 50% o 90% dell'ileo.
- Rimuovere il tratto GI e pesarlo. Calcolare il peso di GI al rapporto di peso del corpo per valutare la severità di malassorbimento di sali biliari e overaccumulation.
- Trasferire i tratti di GI in provette coniche da 15 mL e tagliarli in segmenti più brevi utilizzando le forbici. Dopo il taglio, centrifuga a 3.000 x g per 10 min. trasferire il surnatante (GI fluido contenente sali biliari) in una provetta pulita.
- Misurare il volume totale e il peso del fluido di GI e calcolare il peso di fluido al rapporto di peso del tratto GI per valutare ulteriormente overaccumulation di bile nel tratto GI.
- Determinare la quantità totale di bile nel surnatante dall'analisi degli acidi biliari, come descritto nel riferimento 8.
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Risultati
Le procedure per ileectomy sono illustrate nella Figura 1. Il primo passo include preparazione pelle addominale del topo, facendo un'incisione addominale e l'utilizzo di Divaricatori per esporre completamente l'intestino (Figura 1A-C). Successivamente, si trovava l'intestino cieco del mouse (Figura 1D); dato che la sua forma e dimensione lo rendono un punto di riferi...
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Discussione
Al fine di eseguire un ileectomy successo, arteria mesenterica superiore deve essere legato in anticipo per bloccare l'afflusso di sangue al segmento resecting. Il segmento ileale ischemico diventerà viola scuro dopo la legatura. Il segmento ileale quindi dovrà essere completamente resecato. Un rifornimento di anima normale deve essere garantito per le estremità mantenute. Questo è essenziale per evitare la rimozione impropria e sanguinamento, che può facilmente causare errori chirurgici a causa di necrosi ischemica dopo...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è sostenuta dalla Fondazione di Tom Peterson e NIH concedere R01-HL119780 (Jain, MK).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio di dissezione | Olympus | SZ61 | Per chirurgia |
| Controllore di temperatura per animali | Physitemp Instruments, Inc. | TCAT-2LV | Per il controllo della temperatura corporea |
| Vaporizzatore per anestesia isoflurano | VetEquip | 911104 | Per anestesia |
| Pinze per dissezione | Strumenti di scienza fine, Inc. | 11274-20 | Per la chirurgia |
| Forbici | Strumenti di scienza fine, Inc. | 14084-08 | Per la chirurgia |
| Porta aghi | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7882 | Per la chirurgia |
| Micro coltelli-lama dell'ago | Fisher Scientific | 10318-14 | Per chirurgia |
| Sutura monofilamento 6-0 | Ethicon | 1698G | Per la chiusura della pelle addominale |
| Sutura seta 7-0 | Ethicon | 766G | Per legatura |
| Sutura monofilamento 8-0 | Ethicon | 1714G | Per anastomosi |
| Spugne chirurgiche | Dynarex Corp. | 3333 | Per la chirurgia |
| Piccoli applicatori con punta in cotone | Fisher Scientific | 23-400-118 | Per la chirurgia |
| Isoflurano | Piramal Healthcare Limited | 66794-013-25 | Per l'anestesia |
| Buprenorfina cloridrato | Reckitt-Benckiser Pharmaceuticals | 12496-0757-1 | Per l'analgesia |
| 0,9% cloruro di sodio Iniezione | B. Braun Medical Inc. | 0264-7800-10 | Per lavaggio/iniezione |
| Soluzione di preparazione di iodio povidone | Dynarex Corp. | 1413 | Per la preparazione della pelle |
| Puralube unguento veterinario | Dechra Prodotti veterinari | 17033-211-38 | Per la protezione degli occhi |
| Lozione depilatoria | Chiesa & Dwight Co., Inc. | Per la preparazione della pelle | |
| Unità di terapia intensiva | ThermoCare | FW-1 | Per il recupero post-operatorio |
| Recupero DietGel | ClearH2O | 72-06-5022 | Per il recupero post-operatorio |
| Kit di tessuto grasso e fibroso a RNA totale Aurum | Bio-Rad | 7326830 Per l'isolamento | dell'RNA |
| Supermix a trascrizione inversa iScript per RT-qPCR | Bio-Rad | 1708841 | Per test di trascrizione inversa |
| TaqMan master mix avanzato veloce | Applied Biosystems/Life Technologies | 4444965 | Per l'analisi QPCR |
| Kit di dosaggio degli acidi biliari totali | Genzyme | Diagnostic DZ042A-K01 | Per il test degli acidi biliari |
| C57BL/6J | Il laboratorio |
Riferimenti
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