Acido sialico è una tipica unità di monosaccaride trovata nei glycoconjugates. È coinvolto in una pletora di interazioni cellulari e molecolari. Qui presentiamo un metodo per modificare l'espressione di superficie acido sialico cellulare utilizzando glycoengineering metabolica con N- monosaccaridico derivati.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Glycoengineering metabolica di acido sialico utilizzando N-acil-per volta Mannosamines
In questo articolo
Sommario
Abstract
Acido sialico (Sia) è un costituente importante di glicoconiugati, quali N- e O- glicani o glicolipidi. Grazie alla sua posizione presso le estremità non riducente di oligo - e polisaccaridi, come pure le sue caratteristiche chimiche uniche, acido sialico è coinvolto in una moltitudine di interazioni recettore-ligando diverso. Modificando l'espressione di acido sialico sulla superficie delle cellule, interazioni acido sialico-dipendente di conseguenza saranno influenzati. Questo può essere utile per indagare le interazioni acido sialico-dipendente e ha il potenziale per influenzare determinate malattie in modo benefico. Via metabolica glycoengineering (MGE), l'espressione di acido sialico sulla superficie delle cellule può essere modulata. Nel presente documento, cellule, tessuti o addirittura interi animali sono trattati con derivati C2-modificati del N- monosaccaridico (ManNAc). Questi zuccheri amminici fungere da molecole di acido sialico precursore e pertanto sono metabolizzati della corrispondente specie di acido sialico ed espressi sulla glycoconjugates. L'applicazione di questo metodo produce effetti intriganti su vari processi biologici. Ad esempio, e può drasticamente ridurre l'espressione di acido polisialico (polySia) in cellule di un neurone trattate e quindi colpisce differenziazione e crescita neuronale. Qui, indichiamo la sintesi chimica di due dei più comuni C2-modificato N- acilmannosammina derivati, N- propionylmannosamine (ManNProp) così come N- butanoylmannosamine (ManNBut) e ulteriormente mostrano come questi non-naturali aminici possono essere applicati in esperimenti della coltura cellulare. L'espressione di acido sialico modificato specie è quantificata mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e ulteriormente analizzato tramite spettrometria di massa. Gli effetti sull'espressione acido polisialico sono chiariti tramite Western blot usando un anticorpo acido polisialico commercialmente disponibili.
Introduzione
Acido sialico è un monosaccaride che è reperibile in genere le estremità non riducente dei glicoconiugati, quali N- e O- glicani o glicolipidi. Tra tutti i monosaccaridi, acido sialico ha alcune caratteristiche chimiche uniche. Ha una spina dorsale C-atomo 9, un gruppo carbossilico in posizione C-1, che è deprotonato e quindi negativamente caricate sotto condizioni fisiologiche e una funzione amminica nella posizione C-5. Anche se oltre 50 varianti di acido sialico naturali sono stati caratterizzati a data1, la forma predominante di acido sialico trovato in esseri umani è acido N- acetilneuraminico (Neu5Ac). Altri mam....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. preparazione dei tamponi e reagenti
-
Preparazione della soluzione di idrossido di sodio 3 mM
- Sciogliere metossido di sodio 8,1 mg in 50 mL di metanolo (3 mM) in una bottiglia di vetro 100ml con un'ancoretta. Conservare a temperatura ambiente (TA) per diverse settimane.
-
Preparazione del tampone Tris-HCl
- Combinare 8,766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl e 146 mg EDTA in un flacone di vetro da 100 mL con un'ancoretta e sciogliere in 80 mL di acqua.
- Aggiungere alla soluzione mescolando, idrossido di sodio (1 M, in acqua) o HCl (20%, in acqua) rispettando il pH con un pH-metro e reg....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Cromatogrammi HPLC di fluorescente etichettati Neu5Ac e gli standard di Neu5Gc sono rappresentati in Figura 2. Utilizzando il metodo qui descritto, Neu5Gc DMB-labeled eluisce in genere tra 7-9 min tempo di eluizione e DMB-Neu5Ac tra 10-12 min. Parecchi più piccoli picchi nel cromatogramma appaiono in genere tra 2-6 min. Questi picchi rappresentano non reagito DMB e reazione intermedi25.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Se i derivati chimicamente sintetizzati di ManNAc, ManNProp e ManNBut vengono analizzati tramite spettrometria di massa, solo il picco di massa corretto per entrambi gli esemplari deve essere identificato. Di conseguenza, i prodotti possono essere presupposto per avere una purezza superiore al 99%. Piccole quantità di Neu5Gc, che normalmente non viene trovato in cellule umane29, vengono rilevati nelle frazioni della membrana delle cellule lisate. Questo si verifica più probabilmente attraverso una.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo L. D. Nguyen per la correzione del manoscritto e per discussioni fruttuose. Inoltre, ringraziamo J. Dernedde e H. G. Nguyen per aiutarci a preparare le riprese video. La maggior parte delle scene del video sono state girate nei laboratori di R. Tauber. Ringraziamo anche il Max Planck Institute per i colloidi e le interfacce e per averci dato libero accesso alla loro funzione di spettrometria di massa. RH è stata sostenuta dal DFG (ProMoAge).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cellule | Sigma-Aldrich | 92110411 | |
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Palloni per coltura tissutale da 75 ml | Greiner | 690175 | |
| piastre a 48 pozzetti | Corning | 3548 | |
| FCS | PAA | A15-102 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Tripsina | Gibco | 15400-054 | |
| EDTA | Roth | X986.1 | |
| Tris | Serva | 37190.03 | |
| SDS | Roth | 2326.2 | |
| SDS-PAGE attrezzature (serbatoi, vetreria ecc., macchina | VWR | SDS Gel/Blot | |
| Acrilammide | Roth | 3019.1 | |
| Scala proteica | Fisher Scientific | 267620 | |
| Nitrocellulosa | GE Healthcare | 10600002 | |
| Ponceau rosso | Roth | 5938.2 | |
| Latte in polvere | Roth | T145.3 | |
| ECL | Millipore | WBLUF 0500 | |
| Unità filtrante centrifuga da 0,5 ml con membrana da 3 kDa | Merck-Millipore | UFC500324 | |
| provette da centrifuga da 15 mL | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430791-500EA | |
| 2-Mercaptoetanolo | Sigma-Aldrich | M6250-10ML | |
| 2-Propanolo | Sigma-Aldrich | 34965-1L | HPLC grado |
| gradiente 4,5-metilenediossi-1,2-fenilendiammina dicloridrato | Sigma-Aldrich | D4784-50MG | |
| 48 pozzetti, piastra per coltura tissutale a fondo piatto | Sigma-Aldrich (Corning) | Provette da centrifuga CLS3548-100EA | |
| da 50 mL | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430829-500EA | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34967-1L | di grado HPLC |
| da polmone bovino | Sigma-Aldrich | A1153-10MG | polvere liofilizzata, 3-8 TIU/mg |
| cloruro di butirrile | Sigma-Aldrich | 109614-250G | |
| C18 colonna RP | Phenomenex | 00F-4435-E0 | 110 Å, 3 µ m dimensione delle particelle, 4,6 x 150 mm |
| D-mannosamina cloridrato | Sigma-Aldrich | M4670-1G | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Acido etilendiamminotetraacetico | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| Acido formico | Sigma-Aldrich | 56302-50ML-GL | |
| Soluzione | di acido cloridricoSigma-Aldrich | H1758-100ML | 36,5-38,0%, in acqua |
| Leupeptina | Sigma-Aldrich | L2884-10MG | |
| Metanolo | Carl-Roth | T169.2 | Grado di gradiente HPLC |
| N-Acetil D-mannosamina | Sigma-Aldrich | A8176-250MG | |
| Acido N-acetilneuraminico | Sigma-Aldrich | A0812-25MG | |
| Acido N-glicolilneuraminico | Sigma-Aldrich | G9793-10MG | |
| Fenilmetansulfonilfluoruro | Sigma-Aldrich | P7626-250MG | |
| Cloruro di propionil | Sigma-Aldrich | P51559-500G | |
| Provette Safe-Lock, 1,5 mL, ambra (protezione dalla luce) | Eppendorf | 30120191 | |
| Provette Safe-Lock, 1,5 mL, incolore | Eppendorf | 30120086 | |
| Sodico soluzione di bisolfito | Sigma-Aldrich | 13438-1L-R-D | 40%, in acqua |
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | 746398-500G-D | |
| Idrossido di sodio | Sigma-Aldrich | 795429-500G-D | |
| Soluzione di idrossido di sodio | Sigma-Aldrich | 319511-500ML | 1.0 M, in acqua |
| Metossido di sodio | Sigma-Aldrich | 164992-5G | |
| Acido trifluoroacetico | Sigma-Aldrich | T6508-100ML-D | |
| Tris cloridrato | Sigma-Aldrich | T5941-100G | |
| Tripsina 0,25 %/EDTA 0,02 % in PBS | PAN Biotech | P10-019100 | |
| Acqua | Carl-Roth | T905.1 | HPLC gradiente grado |
| Gel di silice 60 | Carl-Roth | 9779.1 | |
| HPLC | Agilent | ||
| Sistema ESI-MSD | Agilent |
Riferimenti
- Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
- Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
