Articolo metodologico

Glycoengineering metabolica di acido sialico utilizzando N-acil-per volta Mannosamines

DOI:

10.3791/55746

⸱

25 novembre 2017

 , 
1Max von Pettenkofer-Institut & Genzentrum, Virologie, Nationales Referenzzentrum für Retroviren, Medizinische Fakultät, LMU München, 2Institut für Laboratoriumsmedizin, klinische Chemie und Pathobiochemie, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Institut für Physiologische Chemie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

In questo articolo

Sommario

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Acido sialico è una tipica unità di monosaccaride trovata nei glycoconjugates. È coinvolto in una pletora di interazioni cellulari e molecolari. Qui presentiamo un metodo per modificare l'espressione di superficie acido sialico cellulare utilizzando glycoengineering metabolica con N- monosaccaridico derivati.

Abstract

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Acido sialico (Sia) è un costituente importante di glicoconiugati, quali N- e O- glicani o glicolipidi. Grazie alla sua posizione presso le estremità non riducente di oligo - e polisaccaridi, come pure le sue caratteristiche chimiche uniche, acido sialico è coinvolto in una moltitudine di interazioni recettore-ligando diverso. Modificando l'espressione di acido sialico sulla superficie delle cellule, interazioni acido sialico-dipendente di conseguenza saranno influenzati. Questo può essere utile per indagare le interazioni acido sialico-dipendente e ha il potenziale per influenzare determinate malattie in modo benefico. Via metabolica glycoengineering (MGE), l'espressione di acido sialico sulla superficie delle cellule può essere modulata. Nel presente documento, cellule, tessuti o addirittura interi animali sono trattati con derivati C2-modificati del N- monosaccaridico (ManNAc). Questi zuccheri amminici fungere da molecole di acido sialico precursore e pertanto sono metabolizzati della corrispondente specie di acido sialico ed espressi sulla glycoconjugates. L'applicazione di questo metodo produce effetti intriganti su vari processi biologici. Ad esempio, e può drasticamente ridurre l'espressione di acido polisialico (polySia) in cellule di un neurone trattate e quindi colpisce differenziazione e crescita neuronale. Qui, indichiamo la sintesi chimica di due dei più comuni C2-modificato N- acilmannosammina derivati, N- propionylmannosamine (ManNProp) così come N- butanoylmannosamine (ManNBut) e ulteriormente mostrano come questi non-naturali aminici possono essere applicati in esperimenti della coltura cellulare. L'espressione di acido sialico modificato specie è quantificata mediante cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e ulteriormente analizzato tramite spettrometria di massa. Gli effetti sull'espressione acido polisialico sono chiariti tramite Western blot usando un anticorpo acido polisialico commercialmente disponibili.

Introduzione

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Acido sialico è un monosaccaride che è reperibile in genere le estremità non riducente dei glicoconiugati, quali N- e O- glicani o glicolipidi. Tra tutti i monosaccaridi, acido sialico ha alcune caratteristiche chimiche uniche. Ha una spina dorsale C-atomo 9, un gruppo carbossilico in posizione C-1, che è deprotonato e quindi negativamente caricate sotto condizioni fisiologiche e una funzione amminica nella posizione C-5. Anche se oltre 50 varianti di acido sialico naturali sono stati caratterizzati a data1, la forma predominante di acido sialico trovato in esseri umani è acido N- acetilneuraminico (Neu5Ac). Altri mammiferi anche esprimono una maggiore quantità di N- glycolylneuraminic acido (Neu5Gc)2,3.

Grazie alla sua posizione esposta nei glycoconjugates, acido sialico è coinvolto in una pletora di interazioni recettore-ligando, ad esempio, l'associazione dipendente emagglutinina del virus dell'influenza a host cellule4. Un epitopo di acido sialico con importanti funzioni biologiche, soprattutto durante l'embriogenesi e nel sistema nervoso, è l'acido polisialico. Acido polisialico è un polimero di fino a 200 2,8-collegato sialico acidi alfa. Il vettore di proteina principale di acido polisialico è la molecola di adesione neurale delle cellule (NCAM). Espressione di acido polisialico modula le proprietà adesive di NCAM in quanto espressione acido polisialico diminuisce l'adesione e aumenta la plasticità con il sistema nervoso5.

Cambiamenti nell'espressione di acido sialico (poli) influirà in definitiva una moltitudine di interazioni biologiche diverse. Questo può essere utilizzato per studiare processi dipendenti noto acido sialico a livello molecolare, per scoprire nuovi glicoconiugati interazioni, o esplorare i possibili approcci terapeutici. Ci sono diversi metodi disponibili da cui l'espressione di acido sialico sulla superficie delle cellule può essere modulata, ad esempio il trattamento con acido sialico specifiche glicosidasi (sialidasi), inibizione di enzimi coinvolti nella biosintesi di acido sialico6 ,7,8, o di abbattere o cambiare l'espressione dell'enzima chiave della biosintesi di acido sialico9.

Un altro metodo versatile per modulare l'espressione di acido sialico è MGE (ingegneria conosciuto anche come metabolica oligosaccaride, MOE). Nel presente documento, cellule, tessuti o anche gli animali sono trattati con derivati non naturali della ManNAc che recano modifiche C2-amminico. Essendo molecole precursori dell'acido sialico, dopo l'assorbimento cellulare, questi analoghi ManNAc sono unidirezionale metabolizzato a non naturali sialico acidi e possono essere espressa su sialilato glicoconiugati. Le cellule trattate con derivati di ManNAc portando alifatiche C2-modifiche, come ManNProp o ManNBut, incorporare N- propionylneuraminic (Neu5Prop) o N- butanoylneuraminic acido (Neu5But) nel loro glicoconiugati10 , 11. utilizzando gruppi funzionali introdotti alla C2-posizione della ManNAc, gli acidi di sialico non naturali che si verificano possono essere accoppiati, per esempio, tramite la legatura di Staudinger o l'azide alkine cicloaddizione, con le tinture fluorescenti e pertanto visualizzate sulla superficie delle cellule12.

L'espressione di questi acidi sialici non naturali ha intriganti effetti su molti processi biologici, tra cui infezioni da agenti patogeni, l'adesione e la migrazione di cellule tumorali, adesione cellulare generale, come pure vascolarizzazione e differenziazione (per revisione vedere: Wratil et al. 13). interessante, MGE con N-acil per volta mannosamines può essere utilizzato anche per interferire con l'espressione di acido polisialico. Acido polisialico è generato da due differenti polysialyltransferases (ST8SiaII e ST8SiaIV). È stato dimostrato, che polysialyltransferase ST8SiaII è inibita da precursori di acido sialico innaturali, come ad esempio ManNProp o ManNBut14,15. Inoltre, è stato dimostrato in cellule umane di neuroblastoma che ManNProp o ManNBut applicazione riduce anche sialylation in totale15.

MGE con N-acil per volta mannosamines è un facile da applicare il metodo che è stato utilizzato con successo, non solo in coltura delle cellule dei batteri ma anche nell'intero animali di specie diverse, ad esempio Caenorhabditis elegans16e mammiferi zebrafish17, o topi18,19,20,21. Soprattutto i derivati di ManNAc recanti modifiche alifatiche, compreso ManNProp e ManNBut, sono modo trascurabile citotossici, anche alle concentrazioni millimolar in terreno di coltura delle cellule o plasma sanguigno. Inoltre, sono relativamente facili da sintetizzare.

Qui, forniamo i dettagli su come utilizzare MGE con N-acetile per volta mannosamines. In primo luogo, la sintesi chimica di due dei derivati ManNAc più ampiamente usati in questo campo, ManNProp e ManNBut, è spiegata. Successivamente, vi mostriamo come MGE può essere applicata in un esperimento in vivo . Ad esempio, la linea cellulare di neuroblastoma Kelly è stato scelto per dimostrare la diminuita espressione dell'epitopo polisialico mediante Western blot dopo il trattamento con i derivati di ManNAc. Gli acidi sialici non naturali sulla superficie delle cellule sono stati quantificati da HPLC e ulteriormente analizzati tramite spettrometria di massa.

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Protocollo

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1. preparazione dei tamponi e reagenti

  1. Preparazione della soluzione di idrossido di sodio 3 mM
    1. Sciogliere metossido di sodio 8,1 mg in 50 mL di metanolo (3 mM) in una bottiglia di vetro 100ml con un'ancoretta. Conservare a temperatura ambiente (TA) per diverse settimane.
  2. Preparazione del tampone Tris-HCl
    1. Combinare 8,766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl e 146 mg EDTA in un flacone di vetro da 100 mL con un'ancoretta e sciogliere in 80 mL di acqua.
    2. Aggiungere alla soluzione mescolando, idrossido di sodio (1 M, in acqua) o HCl (20%, in acqua) rispettando il pH con un pH-metro e regolare il pH a 8.0.
    3. Aggiungere il volume di acqua necessaria per ottenere un volume finale di 100 mL. Filtrare la soluzione utilizzando un sistema di filtro sterile da 0,22 µm.
      Nota: 100 mL di Tris-HCl buffer conterrà 150 mM NaCl, Tris-HCl 10 mM e 5 mM EDTA (pH 8.0). La soluzione può essere conservata a 4 ° C per diverse settimane.
  3. Preparazione della soluzione di aprotinina
    1. Sciogliere aprotinina 10 mg in 1 mL di acqua (1,54 millimetri). Aliquota della soluzione di aprotinina in 10 x 1,5 mL-plastica tubi (100 µ l). Conservare a-20 ° C per diverse settimane.
  4. Preparazione della soluzione leupeptina
    1. Sciogliere leupeptina 10 mg in 2 mL di acqua (10 mM). Aliquotare la soluzione leupeptina 10 x 1,5 mL-plastica tubi. Conservare a-20 ° C per diverse settimane.
  5. Preparazione della soluzione di fluoruro (PMSF) phenylmethylsulfonyl
    1. Sciogliere 34,8 mg PMSF in 2 mL di etanolo (100 mM). Aliquota della soluzione PMSF in 10 x 1,5 mL-plastica tubi. Conservare a-20 ° C per diverse settimane.
  6. Preparazione della soluzione di 1,2-diamino-4,5-methyldioxybenzol-dicloridrato (DMB)
    1. Combinare 15,62 mg DMB, 352 µ l β-mercaptoetanolo e 48 µ l sodio bisolfito-soluzione (39%) e aggiungere acqua mL 9,6 (6,9 mM DMB, 500mm β-mercaptoetanolo e 0,19% sodio bisolfito). Aliquota della soluzione DMB in 40 x 1,5 mL-plastica tubi (250 µ l). Conservare al riparo dalla luce a-20 ° C per diverse settimane.
  7. Preparazione 1 M trifluoroacetico (TFA) di soluzione di acido
    1. 770.3 µ l di 100% TFA a 9,23 mL di acqua in un tubo di plastica da 15 mL (1 M). Conservare a 4 ° C per diverse settimane.
  8. Preparazione della soluzione TFA 120 mM
    1. µ L 92,4 TFA (100%) a 9,91 mL di acqua (120 mM) in un tubo di plastica da 15 mL. Conservare a 4 ° C per diverse settimane.
  9. Preparazione della soluzione di idrossido di sodio (NaOH) 400 mM
    1. Sciogliere 160 mg di NaOH in 10 mL di acqua (400 mM) in un tubo di plastica da 15 mL. Conservare a 4 ° C per diverse settimane.
  10. Preparazione del tampone di lisi di Western blot
    1. Sciogliere 5,84 g NaCl, 0,1 g Tris (idrossimetil)-aminomethan (Tris), 0,1 g CaCl2, 0,95 g MgCl2e 1 g Triton-X100 in 100 mL di acqua e regolare il pH a 7,8. Conservare a 4 ° C. Aggiungere 100 µ l di ogni inibitore di proteasi (aprotinina, leupeptina e PMSF) prima di utilizzare il buffer di lisi.
  11. Preparazione del buffer di sodio dodecil solfato del gel di poliacrilammide elettroforesi (SDS-PAGE)
    1. Sciogliere 0,3 g Tris, glicina 1,5 g e 0,1 g SDS in 100 mL di acqua e regolare il pH a 7,3. Conservare a RT.
  12. Preparazione del buffer di Western blot
    1. Sciogliere 0,3 g Tris, glicina 1,1 g in 90 mL di acqua e aggiungere 10 mL di etanolo. Conservare a RT.
  13. Preparazione della soluzione di blocco
    1. Sciogliere 1 g di potere di grasso del latte gratis in salino di 25 mL tamponato fosfato (PBS). Sempre preparare fresco.

2. sintesi di ManNProp e correlati N-acil-per volta Mannosamines

  1. Sciogliere mg 431,2 mannosammina cloridrato in soluzione di idrossido di sodio 3 mM 10 mL in una bottiglia di vetro 50ml con un'ancoretta.
  2. Raffreddare la miscela sul ghiaccio a 0 ° C. Per la soluzione di agitazione, aggiungere lentamente goccia a goccia 210 µ l propionil cloruro (2,4 mmol), o 248 µ l butanoil (2,4 mmol) di sintetizzare ManNProp o ManNBut, rispettivamente. Incubare la miscela agitazione a 0 ° C per 4 h.
  3. Trasferire la soluzione in un tubo di plastica da 50 mL. Poke 4-8 fori nel coperchio del tubo di plastica con un ago sottile. Congelare rapidamente la soluzione usando azoto liquido e successivamente lyophilize (congelamento a secco) e per 48 ore o fino a quando non si è completamente asciugata.
  4. 350 g gel di silice 60 si mescolano 750ml etil-acetato/metanolo/acqua (15:2:1) (si tratta di una sospensione). Riempire una colonna di vetro (35 mm di diametro e 70 cm di lunghezza) con la sospensione di gel di silice 60 e lavare la colonna preparata con un ulteriore 100 mL etil-acetato/metanolo/acqua (15:2:1) prima dell'uso.
  5. Sciogliere i secchi prodotti dal passaggio 2.3 (5g essiccato prodotto) in 10 mL di etil-acetato/metanolo/acqua (15:2:1) e carico di loro utilizzando una pipetta sulla silice gel colonna. Raccogliere le frazioni 4 mL dopo 500 mL (per ManNProp). Nota: ManNBut sarà eluire dalla colonna dopo circa 700 mL.
  6. Trasferire le frazioni eluite in tubi di plastica da 15 mL. Poke 3-6 fori nel coperchio del tubo di plastica con un ago sottile. Rapid congelare la soluzione usando azoto liquido e successivamente si lyophilize fino a quando non si è completamente asciugata.
    Nota: I prodotti liofilizzati possono essere memorizzati per diversi mesi a TA.
  7. Verificare la purezza dei prodotti mediante spettrometria di massa (cfr. capitolo 9).
    Nota: In alternativa, purezza può essere verificata anche da 1H a risonanza magnetica nucleare (NMR).

3. coltura cellulare

  1. Cellule di neuroblastoma di Kelly di cultura in mezzo di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contenente 10% siero bovino fetale, 100 U penicillina, streptomicina 100 mg, 2 mM L-Glutammina contenente 5 mM ManNAc, 5mm ManNProp o 5 mM ManNBut, a 37 ° C e 5% CO2.
    Nota: Le cellule coltivate in medium senza ManNAc o i suoi analoghi sono utilizzate come controllo.
  2. Prima dell'applicazione della mannosamines, staccare le cellule di neuroblastoma Kelly incubando li per 10 min con tripsina/EDTA (0,25%, 0,02% in PBS) e contare utilizzando un contatore di Neubauer-camera o cella. Le cellule a numeri definiti in base alla dimensione del piatto/piatto del seme.
    1. Per misurare l'acido sialico monosaccaridi, seme 1 x 105 cellule nel mezzo di 500 µ l in una piastra di coltura del tessuto 48 pozzetti. Per l'analisi degli acidi polisialico, seme 1 x 106 cellule in 3 mL di terreno su una piastra di coltura cellulare di diametro 6 cm. Incubare a 37 ° C e 5% CO2. Sostituire il mezzo ogni 24 ore.
      Nota: L'effetto di MGE aumenta con il tempo totale di trattamento. Per alta efficienza metabolica trattare le cellule per 5-7 giorni.
  3. Dopo il trattamento, decantare il mezzo. Lavare i piatti/piatti con PBS. Staccare le cellule incubando li per 10 min con tripsina/EDTA (0,25%, 0,02% in PBS). Neutralizzare la tripsina aggiungendo lo stesso volume di terreno di coltura delle cellule alle cellule indipendente. Trasferire le cellule indipendente in tubi di plastica da 15 mL. Centrifugare i campioni per 3 min a 500 x g e scartare il surnatante.
    1. Aggiungere 5 mL PBS e centrifuga celle (Vedi punto 3.3). Ripetere il lavaggio due volte.
      Nota: Il pellet cellulare lavato senza surnatante possa essere memorizzato a-20 ° C per diversi giorni. Se l'espressione di acido polisialico deve essere delucidato continuare alla sezione 10.

4. cellula Lisi per l'analisi HPLC

  1. Preparazione del tampone di lisi HPLC
    1. Combinare il buffer di 5 mL di Tris-HCl, 5 µ l di soluzione di aprotinina, 20 µ l di soluzione di leupeptina e 50 µ l di soluzione PMSF.
      Nota: 5 mL di tampone di lisi HPLC conterrà 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1,54 aprotinina µM, 40 µM leupeptina e 1 mM PMSF (pH 8.0). Questo buffer dovrebbe sempre essere preparato freschi prima della lisi cellulare.
  2. Risospendere il pellet cellulare raccolti (punto 3.3) ogni in 500 µ l ghiacciata HPLC-tampone di lisi e ultra-Sonicare i campioni con un ago di processore ultra-sonico tre volte per un periodo di 30 s a medio-alte ampiezze. Raffreddare i campioni su ghiaccio per almeno 1 min tra i cicli.

5. la separazione della frazione della membrana

  1. Centrifugare i campioni lisati cellulari per 2 h a 20.000 x g e a 4 ° C. Separare il surnatante (circa 480 µ l), che rappresentano proteine citosoliche, in tubi di plastica da 1,5 mL. Determinare la concentrazione di proteina di queste frazioni utilizzando, ad esempio, il Bradford o il dosaggio (BCA) acido bicinconinico.
    Nota: La concentrazione di proteina (circa 1 mg/mL) delle frazioni citosoliche più tardi può essere correlata agli importi misurati delle specie rispettato acido sialico. Il pellet rappresenta la frazione di membrana, che viene utilizzata nel passaggio 6.1.

6. acido idrolisi

Nota: Oligo - e polisaccaridi nelle membrane cellulari sono idrolizzati a monosaccaridi. Inoltre, possibile O-modifiche nei monosaccaridi sono idrolizzate, pure. Ciò è necessario per l'analisi HPLC quantitativa, perché la stragrande maggioranza degli acidi sialici nelle frazioni della membrana è naturalmente incorporata nei glycoconjugates e potrebbe possibilmente bear O-acetile o O- lactolyl modifiche.

  1. Aggiungere 150 µ l 1 M TFA-soluzione per le frazioni di membrana separati (pellet dalla sezione 5). Incubare i campioni per 4 h a 80 ° C con agitazione a 200-600 giri/min.
  2. Centrifugare i campioni per circa 30 min a 20.000 x g e 21 ° C, utilizzando tubi filtro 0,5 mL con 3 membrane di esclusione di kDa, fino a quando il volume di fase superiore è meno di 20 µ l.
    Nota: Questo passaggio è importante smaltire detriti molecolare più elevato.
  3. Trasferire la fase inferiore contenenti molecole più piccole, comprese le specie di acido sialico, in tubi di plastica di 2 mL. Poke 2-4 fori nei tappi dei tubi in plastica con un ago sottile. Rapid congelare i campioni utilizzando azoto liquido e poi li lyophilize durante la notte.
    Nota: I campioni essiccati possono essere conservati per diversi giorni a RT. Sostituisci un cappuccio senza fori per archiviazione a lungo.

7. fluorescente etichettatura

  1. Risospendere i campioni essiccati in soluzione TFA di 10 µ l 120 mM e aggiungere 50 µ l di soluzione DMB. Trasferire i campioni in provette scuro 1,5 mL per proteggerli dai raggi ultravioletti.
  2. Per gli standard, sciogliere 1 µ l Neu5Ac (60 ng/mL, in acqua) o 1 µ l Neu5Gc (60 ng/mL, in acqua) in soluzione di TFA mM 120 µ l 10 provette scuro 1,5 mL. Aggiungere 50 µ l di soluzione DMB.
  3. Incubare i campioni di membrana delle cellule e gli standard per 1,5 h a 56 ° C al riparo dalla luce. Dopo l'incubazione, aggiungere 4 µ l 400 mM della soluzione di NaOH per ogni campione per arrestare la reazione d'etichettatura.

8. analisi HPLC

Nota: Con etichettati campioni vengono analizzati su un sistema HPLC equipaggiato con una colonna C18 RP (110 Å, dimensione delle particelle di 3 µm, 4.6 x 150 mm), un rivelatore a fluorescenza e un collezionista di frazione. I solventi utilizzati sono metanolo, acetonitrile e acqua. Assicurarsi di degassare tutti i solventi prima le misurazioni, se il sistema HPLC manca un degasatore interna.

  1. Impostare la temperatura della colonna a 40 ° C e configurare il rivelatore a fluorescenza con 373 nm per l'eccitazione e 448 nm per l'emissione, rispettivamente. Iniettare 10 µ l di campione e separare le sonde per 50 min a 0,5 mL/min di portata con metanolo/acetonitrile/acqua (6:8:86) come eluente. Per l'analisi di spettrometria di massa, raccogliere i picchi di interesse.
    Nota: Neu5Gc è previsto di eluato dopo 6-8 min, Neu5Ac dopo 9-12 min, Neu5Prop dopo 17-23 min e Neu5But dopo 38-44 min. I campioni frazionati possono essere conservati per diverse ore a 4 ° C al riparo dalla luce.
  2. Dopo la misurazione ogni campione, lavare la colonna per 7,5 min a portata di 1,0 mL/min (volumi di colonna 1,5 ≈) con metanolo/acetonitrile/acqua (6:25:69) e riequilibrare il sistema per 7,5 min a 1,0 mL/min di portata con metanolo/acetonitrile/acqua (6:8:86).
  3. Per l'analisi quantitativa, calcolare l'area sotto la curva dei picchi di interesse utilizzando il software operativo del rispettivo sistema HPLC22acido sialico.
    Nota: I dati ottenuti possono essere correlati per il Neu5Ac o lo standard di Neu5Gc e per le concentrazioni di proteina misurati nelle frazioni citosoliche (vedere paragrafo 5.1).

9. spettrometria totale analisi di acido sialico monosaccaridi

Nota: Picchi di ritenzione HPLC di interesse possono essere ulteriormente analizzati tramite spettrometria di massa di cromatografia liquida (LC)-elettrospray (ESI-MS), al fine di verificare le specie di acido sialico innaturale.

  1. Per l'analisi di spettrometria di massa, iniettare 20 µ l di campione raccolto in un sistema rivelatore selettivo LC/massa (MSD) con 79,9% metanolo, alcool isopropilico al 20% e 0,1% acido formico come eluente, portata 0,5 mL/min, 4 kV tensione capillare e 350 ° C di temperatura capillare 22 , 23.
  2. Il software di valutazione del rispettivo sistema LC/MSD, selezionare il picco di interesse nel cromatogramma totale dello ione. Mostra lo spettro di massa del picco risolto. Visualizzare il rapporto massa/carica positiva tra 300 e 700.
    Nota: DMB etichettatura degli acidi sialici conduce ad un aumento della massa molecolare di 116,2 g/mol. Le specie di DMB-etichettati acido sialico hanno le masse molecolari seguenti: DMB-Neu5Ac = 424.2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441,8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436,2 g/mol, DMB-Neu5But = 453,2 g/PM comune addotti sono acetonitrile, sodio o alcool isopropilico.

10. Western Blot analisi di acido polisialico in cellule di Neuroblastoma di Kelly

  1. Preparazione dei lisati cellulari
    1. Aggiungere 1 mL di tampone di lisi Western blot per il pellet cellulare dalla fase 3.3 e vortice. Incubare per 30 min in ghiaccio. Vortice ogni 5 min. Centrifugare i campioni per 1,5 h a 20.000 x g e a 4 ° C. Raccogliere il surnatante contenente le proteine dalle cellule lisate.
    2. Determinare la concentrazione di proteina le frazioni di proteine, per esempio, il Bradford o il dosaggio BCA. Diluire i campioni ad una concentrazione di proteina di 1,5 µ g / µ l di tampone di lisi.
    3. Preparare i campioni per la SDS-PAGE con l'aggiunta di tampone di Laemmli 10 µ l dei campioni alla frazione di proteina 90 µ l (1,5 µ g / µ l) e far bollire il campione per 5 min24.
  2. Immunoblotting
    1. Utilizzare gel SDS-acrilammide 8% con 20-30 µ l tasche e 0,75 o 1 mm di spessore. Esegua il gel a 25 mA per 2 h a TA.
    2. Rimuovere attentamente la copertura di vetro dal gel. Tagliare ed eliminare la parte superiore del gel contenente le tasche di caricamento. Collocare il gel su una membrana di nitrocellulosa (0,2 µm), precedentemente ammollato nel buffer di Western blot. Trasferire le proteine alla nitrocellulosa secondo la raccomandazione del sistema (ad es., 250 mA per 1 h a 4 ° C).
    3. Rimuovere la membrana di nitrocellulosa dal sistema macchiante. Macchia la macchia con Ponceau rosso per visualizzare le proteine. Trasferire la membrana di nitrocellulosa in un alloggiamento di plastica e aggiungere 10 mL di soluzione di blocco. Incubare per 1 h a RT o durante la notte a 4 ° C.
    4. Decantare la soluzione bloccante e aggiungere dell'anticorpo monoclonale anti-polySia 735 (1 µ g/mL) in PBS. Incubare la membrana per 1h a RT o durante la notte a 4 ° C. Dopo l'incubazione, lavare la membrana almeno tre volte per 5 min con PBS.
    5. Aggiungere policlonale anticorpo secondario di IgG anti-topo (1 µ g/mL) accoppiato alla perossidasi di rafano (HRP) o un'etichetta fluorescente in PBS. Incubare la membrana per 1 h a TA. Dopo l'incubazione, lavare la membrana almeno tre volte per 5 min con PBS.
    6. Trasferire la membrana su un piatto di un imager appropriato. Rilevare il segnale secondo le istruzioni del produttore.

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Risultati

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Cromatogrammi HPLC di fluorescente etichettati Neu5Ac e gli standard di Neu5Gc sono rappresentati in Figura 2. Utilizzando il metodo qui descritto, Neu5Gc DMB-labeled eluisce in genere tra 7-9 min tempo di eluizione e DMB-Neu5Ac tra 10-12 min. Parecchi più piccoli picchi nel cromatogramma appaiono in genere tra 2-6 min. Questi picchi rappresentano non reagito DMB e reazione intermedi25.

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se i derivati chimicamente sintetizzati di ManNAc, ManNProp e ManNBut vengono analizzati tramite spettrometria di massa, solo il picco di massa corretto per entrambi gli esemplari deve essere identificato. Di conseguenza, i prodotti possono essere presupposto per avere una purezza superiore al 99%. Piccole quantità di Neu5Gc, che normalmente non viene trovato in cellule umane29, vengono rilevati nelle frazioni della membrana delle cellule lisate. Questo si verifica più probabilmente attraverso una...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo L. D. Nguyen per la correzione del manoscritto e per discussioni fruttuose. Inoltre, ringraziamo J. Dernedde e H. G. Nguyen per aiutarci a preparare le riprese video. La maggior parte delle scene del video sono state girate nei laboratori di R. Tauber. Ringraziamo anche il Max Planck Institute per i colloidi e le interfacce e per averci dato libero accesso alla loro funzione di spettrometria di massa. RH è stata sostenuta dal DFG (ProMoAge).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
CelluleSigma-Aldrich92110411
RPMI mediumSigma-AldrichR8758
Palloni per coltura tissutale da 75 mlGreiner690175
piastre a 48 pozzettiCorning3548
FCSPAAA15-102
Pen/StrepGibco15140-122
TripsinaGibco15400-054
EDTARothX986.1
TrisServa37190.03
SDSRoth2326.2
SDS-PAGE attrezzature (serbatoi, vetreria ecc., macchinaVWRSDS Gel/Blot
AcrilammideRoth3019.1
Scala proteicaFisher Scientific267620
NitrocellulosaGE Healthcare10600002
Ponceau rossoRoth5938.2
Latte in polvereRothT145.3
ECLMilliporeWBLUF 0500
Unità filtrante centrifuga da 0,5 ml con membrana da 3 kDaMerck-MilliporeUFC500324
provette da centrifuga da 15 mLSigma-Aldrich (Corning)CLS430791-500EA
2-MercaptoetanoloSigma-AldrichM6250-10ML
2-PropanoloSigma-Aldrich34965-1LHPLC grado
gradiente 4,5-metilenediossi-1,2-fenilendiammina dicloridratoSigma-AldrichD4784-50MG
48 pozzetti, piastra per coltura tissutale a fondo piattoSigma-Aldrich (Corning)Provette da centrifuga CLS3548-100EA
da 50 mLSigma-Aldrich (Corning)CLS430829-500EA
AcetonitrileSigma-Aldrich34967-1Ldi grado HPLC
da polmone bovinoSigma-AldrichA1153-10MGpolvere liofilizzata, 3-8 TIU/mg
cloruro di butirrileSigma-Aldrich109614-250G
C18 colonna RPPhenomenex00F-4435-E0110 Å, 3 µ m dimensione delle particelle, 4,6 x 150 mm
D-mannosamina cloridratoSigma-AldrichM4670-1G
Soluzione salina tamponata con fosfato di DulbeccoPAN BiotechP04-36500
Acido etilendiamminotetraaceticoSigma-AldrichE9884-100G
Acido formicoSigma-Aldrich56302-50ML-GL
Soluzionedi acido cloridricoSigma-AldrichH1758-100ML36,5-38,0%, in acqua
LeupeptinaSigma-AldrichL2884-10MG
MetanoloCarl-RothT169.2Grado di gradiente HPLC
N-Acetil D-mannosaminaSigma-AldrichA8176-250MG
Acido N-acetilneuraminicoSigma-AldrichA0812-25MG
Acido N-glicolilneuraminicoSigma-AldrichG9793-10MG
FenilmetansulfonilfluoruroSigma-AldrichP7626-250MG
Cloruro di propionilSigma-AldrichP51559-500G
Provette Safe-Lock, 1,5 mL, ambra (protezione dalla luce)Eppendorf30120191
Provette Safe-Lock, 1,5 mL, incoloreEppendorf30120086
Sodico soluzione di bisolfitoSigma-Aldrich13438-1L-R-D40%, in acqua
Cloruro di sodioSigma-Aldrich746398-500G-D
Idrossido di sodioSigma-Aldrich795429-500G-D
Soluzione di idrossido di sodioSigma-Aldrich319511-500ML1.0 M, in acqua
Metossido di sodioSigma-Aldrich164992-5G
Acido trifluoroaceticoSigma-AldrichT6508-100ML-D
Tris cloridratoSigma-AldrichT5941-100G
Tripsina 0,25 %/EDTA 0,02 % in PBSPAN BiotechP10-019100
AcquaCarl-RothT905.1HPLC gradiente grado
Gel di silice 60Carl-Roth9779.1
HPLCAgilent
Sistema ESI-MSDAgilent
Aprotinina solido

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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