Personalizzato aghi per microiniezioni nel cervello del roditore

Sommario

Descriviamo qui un protocollo per il microinjection nel cervello del roditore che utilizza aghi di quarzo. Questi aghi non producono danni rilevabili del tessuto e garantire la consegna affidabile anche in regioni profonde. Inoltre, può essere adattati alle esigenze di ricerca di disegni personalizzati e può essere riutilizzati.

Abstract

Microiniezioni sono stati utilizzati per un lungo tempo per la consegna di farmaci o tossine all'interno di specifiche aree cerebrali e, più recentemente, sono stati utilizzati per fornire prodotti di terapia genica o cellulare. Purtroppo, le attuali tecniche di microiniezione utilizzano aghi in acciaio o vetro che sono non ottimali per molteplici ragioni: in particolare, aghi d'acciaio possono causare danni ai tessuti, e aghi di vetro possono piegarsi quando abbassato profondamente nel cervello, mancante della regione di destinazione. In questo articolo, descriviamo un protocollo per preparare e utilizzare aghi di quarzo che combinano una serie di funzioni utili. Questi aghi non producono danni rilevabili del tessuto e, essendo molto rigida, garantire la consegna affidabile nella regione del cervello desiderata anche quando si utilizza coordinate profonde. Inoltre, è possibile personalizzare il design dell'ago facendo più fori del diametro desiderato. Più fori di facilitano l'iniezione di grandi quantità di soluzione all'interno di un'area più ampia, mentre grandi fori facilitano l'iniezione delle cellule. Inoltre, questi aghi di quarzo possono essere puliti e riutilizzati, tale che la procedura diventa conveniente.

Introduzione

Microiniezioni sono stati utilizzati per un lungo tempo per la consegna di composti farmacologicamente attivi di modulare l'attività neuronale in specifiche aree cerebrali. Inoltre, sono stati utilizzati per iniettare tossine vicino particolare popolazioni neuronali, per simulare eventi neurodegenerative caratteristici di alcune malattie, ad esempio 6-idrossi-dopamina nel sistema nigrostriatal della dopamina per imitare la malattia del Parkinson ^{1 , 2} o l'immunotossina 192 IgG saporin ha a lesione del sistema colinergico³. Più recentemente, procedure di microiniezione sono state utilizzate per trasportare gli innesti vettori o cellule virali per la terapia genica o delle cellule di cervello sperimentale disturbi^4,5.

Il tipo classico di aghi impiegati in questi studi è fatto di acciaio inossidabile. Anche se facile e pratico da usare, aghi in acciaio hanno un numero di problemi⁶: essi sono relativamente grandi e può causare danni ai tessuti, con perdita della barriera sangue - cervello e attivazione degli astrociti; Inoltre, possono produrre carotaggio del tessuto cerebrale che ottiene nell'ago creando un ostacolo o persino completamente evitando il flusso della soluzione desiderata. Più recentemente, aghi di vetro preparati ad hoc dai vasi capillari sono stati introdotti in usano^7,8. Questi non causano l'attivazione di danni né Astrocita significativa del tessuto, ma sono relativamente flessibili e possono piegarsi quando introdotto in strutture profonde, riducendo la precisione della localizzazione (osservazioni personali).

Esiste quindi la necessità di ridurre quanto più possibili danni (soprattutto durante gli esperimenti per curare i danni), aumentando la precisione e la riproducibilità (cioè, garantire che tutta la soluzione viene consegnata e garantire la corretta localizzazione). Inoltre, sarebbe auspicabile utilizzare disegni differenti dell'ago per assicurare una distribuzione ottimale della soluzione iniettata nelle aree del cervello con geometrie variabili. In questo articolo, descriviamo un protocollo per preparare e utilizzare il quarzo aghi per microiniezioni nel cervello del roditore. Dovuto l'alto punto di fusione, quarzo capillari non possono essere tirati su un estrattore convenzionale e pertanto, non sono stati utilizzati in passato per generare gli aghi. Quarzo, tuttavia, offre alcuni importanti vantaggi rispetto a vetro, in particolare ad alta rigidità e rottura resistenza⁹. A causa della loro rigidità, aghi di quarzo sono ideali per iniezioni nelle regioni ventrali del cervello. A causa della loro elevata resistenza alla rottura può essere modellate per includere più fori, ottenendo disegni che possono rivelarsi più efficaci anche quando la destinazione di regioni del cervello con geometrie complesse¹⁰.

Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal comitato etico di Ateneo per la sperimentazione animale e dal Ministero della salute. All'arrivo (Animal Research: Reporting In Vivo esperimenti¹¹) sono state seguite le linee guida.

1. preparazione degli aghi di quarzo

1. Pulire e sterilizzare i capillari di quarzo (Vedi Tabella materiali) inserendoli per 5 min in acqua distillata, 5 min in etanolo al 99% e 5 min in etere etilico.
2. Lasciare i capillari sotto il cofano per almeno 1 h per lasciarli asciugare completamente.
3. Preparare gli aghi con l'estrattore laser secondo parametri che permettono la produzione di un ago sufficientemente lungo, sufficientemente sottile, a seconda delle esigenze individuali.
   Nota: Utilizziamo un estrattore di laser (Vedi Tabella materiali). Utilizzare un programma di due linee per la trazione. La prima riga utilizza ad alta potenza, la più grande lunghezza di scansione (corrispondente al valore di filamenti) e nessuna forza di trazione. Questa combinazione di parametri conduce alla fusione della parte più grande del capillare con la minima velocità di estensione, consentendo per la concretizzazione di un lungo ago con interno/esterno di grande dimensioni e ridotto la tibia. In questo modo, l'ago conserva un'elevata resistenza meccanica e diametro interno esteso che consente il passaggio di cellule staminali o particelle virali senza intasamenti. Velocità e il ritardo di questa linea di programma dovrebbe interrompere l'estensione capillare prima la punta diventa troppo piccola e lunga, manca la necessaria meccanica e caratteristiche di forma. La seconda riga del programma trazione viene eseguita automaticamente, una volta che il quarzo si raffredda (5 s). Parametri di potenza, filamento e forza di trazione sono funzionali per tagliare una punta con la minor lunghezza possibile suggerimento e gambo ripida, evitando la separazione tra i due aghi con una rottura della punta. Ordinariamente, con le nostre attrezzature utilizziamo i seguenti: (a) linea 1 = potenza 990, filamento 5, tirare di ritardo 130, velocità di 110, 0; (b) linea 2 = potenza 970, filamento 3, velocità 0, ritardo di 70, tirare 0.
4. Mettere gli aghi in una capsula Petri precedentemente puliti con etanolo al 70%.
   1. Coprire il piatto con una pellicola di plastica paraffina.
5. Tagliare i capillari micro-dissettore.
   1. All'accensione, lasciate il laser eseguire un processo di calibrazione automatica per controllare la potenza e l'energia consegnata. Quindi impostare i parametri di taglio.
      Nota: Noi usiamo un micro-dissettore (Vedi Tabella materiali) e i seguenti parametri: energia di impulso di potere (63 µ j), diametro del raggio laser del 20% della massima apertura del laser (apertura massima: 1,0 µm) e velocità di taglio del 10% della velocità massimale (maximal velocità: 30 µm/s).
   2. Saldamente fissare l'ago sul tavolo microscopio e posizionare la punta al centro dello schermo del computer.
   3. Sulla barra dei menu, fare clic sull'icona della matita e utilizzarlo per disegnare un segno per il taglio laser dell'ago.
      Nota: Il taglio deve essere ad un angolo di circa 45 ° rispetto alla superficie dell'ago.
   4. La funzione di barra laterale, seleziona la bandiera che contiene il pulsante "START CUT" per consentire il laser tagliare il punto precedentemente marcato.
   5. Se necessario, tagliare il lato fori ripetendo le procedure descritte in 1.5.2-3; non c'è nessuna necessità di riposizionare l'ago (Figura 1).
6. Post-taglio di pulizia.
   1. Collegare l'ago ad una pompa di vuoto tramite un tubo di plastica.
   2. Accendere la pompa e impostare manualmente la portata avanti a velocità moderata (3 µ l/min).
   3. Aspirare l'etanolo al 99% prima e poi l'acqua distillata per rimuovere le impurità dovuta al taglio.
   4. Aspirare l'etanolo al 99% per facilitare l'asciugatura.
      Nota: Ogni passo dovrebbe durare per almeno 3 minuti.
7. Conservare gli aghi in una capsula Petri correttamente coperto fino al giorno della chirurgia.
8. Gli aghi possono essere riutilizzati; alla fine dell'esperimento, pulire con la candeggina e l'etanolo per rimuovere la soluzione ed eventuali residui di tessuto. Per una pulizia più completa, mettere gli aghi in un vaso di stoccaggio micropipetta con la punta rivolta verso il basso, riempite il vaso con acqua distillata fino a quando le punte sono coperti, bollire per 1,5 minuti per rimuovere tutto il tessuto rimanente, poi lavare con etanolo.

2. la procedura

1. Seguendo le istruzioni fornite dal manuale utente della pompa, selezionare il menu impostazioni per calibrare la pompa secondo il diametro/volume della siringa microiniezione e impostare la portata a 0,3 µ l/min.
2. Riempire una siringa 10 mL (attrezzata con un ago smussato (ad es., Hamilton ago, 30g) e un tubo breve politetrafluoroetilene) con acqua sterile e si usa per riempire la siringa di Microiniezione (dopo aver tolto con molta cautela il pistone) e l'iniezione kit di parti di assemblaggio per la pompa manuale microiniezione (MMP).
   Nota: Il kit MMP è utilizzato per fissare l'ago nella cornice stereotassica (Figura 2). Il kit comprende: una tubazione del politetrafluoroetilene, luer-a-tubazione accoppiatore, supporto per pipette e guarnizioni per pipette con diversi diametri esterni.
3. Collegare l'ago al kit MMP.
   1. Sciacquare più acqua in tutto il sistema tramite la siringa 10 mL e controllare se l'acqua esce l'ago.
      Nota: Assicurarsi di rimuovere qualsiasi bolla d'aria all'interno del sistema ripetendo la procedura di riempimento.
4. Staccare la siringa 10 mL dalla siringa microiniezione spingendo lentamente il pistone al fine di lasciare una goccia d'acqua nella parte superiore della siringa microiniezione. Inserire il pistone della siringa di microiniezione.
5. Collegare la siringa di microiniezione alla pompa e impostare la velocità di flusso a 0,3 µ l/min.
   Nota: Attendere fino a quando c'è una goccia fuoriuscita dalla punta dell'ago e poi lasciarlo andare per un altro 3 min.
6. Impostare il flusso a 0,1 µ l/min e avviare la procedura di chirurgia. La pompa deve essere in corso durante l'esecuzione dell'intervento.
   Nota: Per gli esperimenti riportati in questo articolo, usiamo i ratti maschii di Sprague Dawley 300g (3 mesi di età). Tuttavia, la procedura è applicabile ad altre specie, topi in particolare.
7. Indurre l'anestesia generale usando un metodo approvato dai regolamenti locali.
   Nota: Usiamo un mix di iniezione intraperitoneale (i.p.) di 85 mg/kg xylazina ketamina e 8 mg/kg per 20-50 minuti di anestesia. È importante che pizzichi di coda e/o punta vengono utilizzati per garantire che l'animale è completamente sedato. Livello di anestesia e segni vitali di base vengono valutati prima di chirurgia comincia e monitorati ogni 10 min durante l'esecuzione dell'operazione. Temperatura corporea degli animali viene mantenuta costante prima, durante e dopo le procedure chirurgiche utilizzando un ricircolo di rilievo di riscaldamento di acqua. Gli animali vengono monitorati fino a quando completamente recuperato (per esempio sono in posizione verticale e ambulatoriale). Inoltre, gli animali ricevono analgesici (tramadol, 5 – 7 mg/kg i.p.) postoperatorio ogni 24 h per tre giorni.
   1. Radere la testa dell'animale e preparare adeguatamente il sito chirurgico per chirurgia asettica. Eseguire uno scrub bistadio con soluzione a base di iodio (Betadine) seguita da etanolo al 70%. Inoltre, per mantenere l'asepsi, avvolgere il sito chirurgico con un telo chirurgico (nel video è stato omesso a scopo dimostrativo).
8. Posizionare il ratto nella cornice stereotassica su un acqua di ricircolo termocoperta. Per fornire ulteriore dolore, presso il sito della chirurgia applicare 0,5% lidocaina soluzione (non superare 7 mg/kg). Pre-sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici utilizzando una perlina sterilizzatore o liquido freddo di disinfezione di immergere l'attrezzatura in entrambi 2% glutaraldeide più 7,05% fenolo (Sporodicin o Cidex) seguita da risciacquo con acqua sterile o soluzione fisiologica. La disinfezione deve essere eseguita anche tra le procedure. Fare un taglio longitudinale sul cranio usando un bisturi sterilizzato. Sii gentile per evitare un eccessivo sanguinamento. Aprire il cuoio capelluto con una spatola piatta e applicare la clip chirurgiche dei lembi di pelle per mantenerla aperta. Molto delicatamente, staccare il periostio per esporre il bregma e la zona del cranio attraverso il quale verrà inserito l'ago.
9. Montare il braccio sul telaio stereotassica (mentre il flusso è in corso) e spostare la punta dell'ago esattamente sulla cima di bregma, prestando attenzione a non rompere la sua punta. Annotare le coordinate antero-posteriore e medio-laterale del bregma e tradurre le coordinate desiderate. Guidati da uno stereomicroscopio, abbassare l'ago fino a quando la punta tocca quasi il cranio, marcare la foratura punto dopo alzando un po' il braccio stereotassica.
10. Trapano (trapano punta Ø: 0,8 mm; velocità trapano: 1.000 giri/min) il cranio sul punto marcato. Deve prestare attenzione a non penetrare la dura madre durante le procedure di foratura. Durante la perforazione, goccia a goccia di soluzione salina sterile per evitare il danno osseo e necrosi.
11. Tagliare un piccolo pezzo di pellicola di plastica paraffina e posizionarlo sul cranio. Utilizzando la pipetta da 10 µ l, fare una goccia della soluzione da iniettare sulla pellicola plastica paraffina. Fermare la pompa, leggermente recuperare il pestello della pompa e creare una piccola bolla d'aria nel capillare tirando delicatamente il pistone della siringa microiniezione.
12. Abbassare il braccio di stereotactic fino a quando la punta dell'ago raggiunge la goccia. Prelevare il campione tirando (molto lentamente) il pistone della siringa microiniezione, evitando qualsiasi formazione di bolle. Sostituire il pestello della pompa a contatto con il pistone e accendere la pompa con una portata di 0,3 µ l/min attesa fino alla formazione di una goccia (pochi minuti) prima di procedere al passaggio successivo.
    Nota: Nel presente esperimento esempio, liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) è stata infusa nel corpo striato (AP: + 1.5, ML: ±2.7; DV: -5,0) e nell'ippocampo dorsale (AP: -3,5, ML: ±2.1; DV: -3,5; in mm da dura), 2 µ l/sito. Per facilitare il confronto tra i metodi di due iniezione, ogni area del cervello è stata infusa utilizzando un ago di quarzo in un emisfero e una punta smussata 26 G o un ago di acciaio inossidabile 30 G conici-punta in altra.
13. Abbassare il flusso a 0,1 µ l/min, nick dura con un ago smusso-punta in acciaio inox e abbassare lentamente il braccio di stereotactic sull'asse dorso-ventrale, entrando il tessuto cerebrale. Quando viene raggiunta la posizione desiderata, andare giù altri 0,1 mm, fermare la pompa, sollevare il braccio stereotactic di 0,1 mm e avviare nuovamente la pompa a flusso a 0,3 µ l/min.
    Nota: Il motivo per mantenere un flusso lento mentre abbassando l'ago è quello di garantire una pressione positiva che evita la penetrazione di piccoli frammenti di tessuto nell'ago stesso. Tale evento ostacolerebbe la punta, alterando la consegna della soluzione. Poiché la portata è molto lenta, mentre abbassando l'ago e la velocità di abbassamento è di circa 10 s/mm, questo implica che la quantità di soluzione che rimanga lungo la pista dell'ago è trascurabile rispetto a quelli iniettati nel sito di destinazione. Questa precauzione può essere evitata quando si utilizzano aghi con fori laterali.
14. Avviare il timer e attendere il tempo necessario a seconda del volume desiderato per iniettare (ad esempio, 6 min 40 s se l'iniezione 2 µ l). Monitorare il movimento di bolla durante l'iniezione. Alla fine, fermare la pompa e attendere 5 minuti prima di recuperare lentamente l'ago. Quando viene estratta completamente l'ago di quarzo, avviare nuovamente la pompa e controllare per la formazione di una goccia sulla punta dell'ago.
15. Sigillare l'apertura nella superficie con cera dell'osso del cranio, rimuovere le clip emostatiche e suturare il cuoio capelluto, ricoprire la zona intorno alla ferita con una crema antibiotica (ad es., neosporin) e tornare l'animale dalla gabbia.
    Nota: Seguendo il protocollo di eutanasia approvato dal comitato etico istituzionale, per gli esperimenti descritti in questo articolo, gli animali erano profondamente anestetizzati con un'iniezione i.p. di 43 mg/kg ketamina e 7 mg/kg xylazina e decapitati. Cervelli sono stati rimossi, post-fissato in formalina per 48 h e paraffina. Sezioni coronali (8 µm) dei cervelli sono stati tagliati utilizzando un microtomo.

Risultati

Abbiamo confrontato il danno indotto da microiniezione diretta nell'ippocampo dorsale del ratto e striato utilizzando un ago di quarzo (punta di diametro esterno 60 µM; foro laterale di uno 20 µM diametro; tipo C, Figura 1) rispetto ai due classici, estremità smussata 26 G e bordo smussato 30 G aghi in acciaio inox. A questo scopo, abbiamo iniettato 2 µ l di aCSF in destra e sinistra ippocampo dorsale e corpo striato utilizzando rispettivamente il quarzo e l'...

Discussione

La tecnica descritta in questo articolo soddisfa le esigenze descritte nell' Introduzione per l'ottimizzazione di microiniezioni che vengono eseguite per vari scopi¹². Gli aghi descritti qui riducono i danni a un livello minimo, essenzialmente non rilevabili; alla varianza con aghi di vetro (che sono inclini a piegare), quarzo aghi sono rigidi e garantiscono un successo affidabile della regione cerebrale desiderata anche in profonde coordinate. Inoltre, il foro laterale assicura l...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Capillari di quarzo	Sutter Instruments, Novato, CA USA	Q100-50-10	Senza estrattore di filamenti
	Sutter	P2000
Barattolo per micropipette	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	E210
Microdissettore laser	Leica Microsystems, Wetzlar, Germania	LMD6500
Siringa	HamiltonHamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸ tzerbach, Germania	19138-U
Pompa per microinfusione	Univentor, Zejtun, Malta	Modello 864
Kit pompa per microiniezione manuale	WPI	Articolo#: MMP-KIT	Kit che consente di montare saldamente le micropipette sul telaio stereotassico
Precision Drill	Proxxon	28510 MicroMot 50/E	Albero di trasmissione con cuscinetti a sfera con velocità variabile
Artficial Cerebral Liquido spinale	Tocris	3525
Aghi 26 g smussato e 30 g smussato	Hamilton	26 g smussato: 19138-U 30 g smussato: 20757
Microtomo	Leica, Germania	LEICA RM212RT