Articolo metodologico

Gli effetti del trapianto Allogeneic Plasma ricco di piastrine (PRP) sul processo di guarigione dei tendini di Achilles sezionato dei ratti: una descrizione metodologica

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DOI:

10.3791/55759

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19 marzo 2018

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1Experimental Surgery, GIGA-R & Credec, University of Liège, 2Laboratory of Connective Tissues Biology, GIGA-R, University of Liège, 3Department Argenco, University of Liège, 4Department of Clinical Biology, University Hospital of Liège, University of Liège, 5Physical Medicine and Sport Traumatology Department, FIFA Medical Center of Excellence, University Hospital of Liège, University of Liège

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive il processo di valutazione della guarigione tendini in ratti che sono stati iniettati con plasma ricco di piastrine allogeniche (PRP) o soluzione salina dopo la rimozione di parte del tendine di Achille. L'andamento del tendine che guarisce è valutato a diversi intervalli di tempo utilizzando diversi tipi di analisi.

Abstract

Questo articolo descrive le procedure sperimentali utilizzate per osservare se PRP può influenzare positivamente la guarigione del tendine. Ci sono 4 principali passi da seguire: indurre una lesione nel tendine di Achille; PRP di preparare ed iniettare (o soluzione salina); rimuovere il tendine; ed eseguire valutazioni biomeccaniche, molecolari ed istologiche. Ad ogni passo, tutte le procedure e i metodi sono descritti in dettaglio, quindi possono essere riprodotti facilmente.

Tendini di Achilles sono stati chirurgicamente sezionata (rimozione di una sezione di lunghezza di 5 mm). In seguito, PRP o soluzione salina è stata iniettata per studiare se PRP ha un effetto positivo sulla guarigione del tendine. Tre gruppi di 40 animali (un totale di 120 ratti sono stati utilizzati in questo studio) sono stati suddivisi in 2 sottogruppi: gruppo di controllo di gruppo di iniezione di PRP e un'iniezione salina. Ratti sono stati sacrificati ad aumentare i punti temporali (gruppo a: 5 giorni; Gruppo b: 15 giorni; Gruppo c: 30 giorni) e tendini sono stati rimossi. 90 tendini hanno subito la prova biomeccanica prima di eseguire analisi trascrittomica e 30 restanti tendini sono stati sottoposti ad analisi istologica.

Introduzione

Coagulazione, processi infiammatori e i ruoli di modulazione di immunità delle piastrine sono ben noti1. Più recentemente, è stato dimostrato che hanno anche proprietà lenitive2,3. Infatti, diversi fattori di crescita e citochine (VEGF, PDGF, TGF-B, IGF-I e HGF) vengono rilasciati dalle piastrine durante la degranulazione. Questi fattori di crescita promuovono l'angiogenesi, rimodellamento tissutale e ferita guarigione (ossa, pelle, muscolo, tendine)2. Centrifugazione del sangue autologo produce plasma ricco di piastrine (PRP) che contiene concentrazioni piastrinica elevata a seconda del metodo di isolamento (tra 3 e 10 volte concentrazioni basali del sangue). Infatti, varie tecniche di preparazione del PRP non possono fornire un prodotto finale identico. Fino ad ora, c' non è stato nessun accordo generale internazionale su questo tema. Nel complesso, PRP potrebbe essere un'interessante opzione terapeutica per il trattamento di patologie muscolo-scheletriche croniche, quali tendinopatia, fascite plantare, osteoartrite e non sindacale4. Esso è stato utilizzato per la prima volta in chirurgia orale e implantologia4 per migliorare e accelerare la guarigione dopo aver piazzato un impianto dentale ossea. In questo studio, descriviamo un metodo riproducibile che consente l'acquisizione di PRP per sperimentazione animale4.

Poiché le lesioni dei tendini sono osservate frequentemente in sportivi e fisica dei lavoratori, migliorare il processo di guarigione e riducendo così il tempo per il recupero sono di grande interesse5. Nuovi metodi di trattamento che sviluppano spesso implicano l'uso di fattori di crescita, e l'amministrazione di PRP è un modo semplice e come minimo dilagante per fornire una miscela di fattori di crescita endogeni4.

Parecchi studi in vitro o animale hanno dimostrato che la somministrazione di plasma, che contiene un alto livello di piastrine, attraverso il rilascio di mediatori biologici, può stimolare la riparazione del tendine e del legamento attraverso il rilascio di mediatori biologici6 ,7,8,9. Inoltre, altri studi hanno dimostrato che PRP può stimolare il tipo I e la sintesi del collagene III nel tendine celle9,10,11. È anche stato suggerito che PRP può diminuire l'attivazione di metalloproteinasi (MMPs) e di conseguenza ridurre la degradazione della matrice. Le cellule che sono coinvolte nel processo di infiammazione possono produrre MMP-9, che svolge un ruolo nel rimodellamento tissutale (fisiologiche e patologiche) indotta dall'infiammazione12.

Basato su queste informazioni, abbiamo supposto che una singola iniezione di PRP nei tendini di Achille sezionati dei ratti potrebbe migliorare il processo di recupero e la resistenza meccanica del tessuto riparato. Questo è testato misurando le proprietà biomeccaniche dei tendini guarigione durante il processo di recupero e attraverso un'analisi istologiche e molecolare per valutare collagene rimodellamento nel tessuto formato di recente. Lo scopo dello studio era di osservare se una singola iniezione di PRP allogeniche potrebbe influenzare la guarigione dei tendini di Achilles sezionati.

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Protocollo

Cura e manipolazione degli animali sono state eseguite in conformità con la guida per la cura e uso di animali da laboratorio a cura dell'Accademia nazionale delle scienze e pubblicato da istituti nazionali di salute (USA). Legislazione europea e nazionale sono stati seguiti attentamente.

1. animale preparazione

  1. Utilizzare 132 2 - mesi-vecchio maschi ratti Sprague-Dawley 320-450 grammi (120 ratti per la sperimentazione) e 12 ratti per il prelievo di sangue, Figura 1. Basato su Dell13, 15 ratti per ogni gruppo è stato sufficiente per una potenza pari a 0,8 (80% di possibilità di trovare significato statistico, se l'effetto specificato esiste).
  2. Casa tutti i ratti in gabbie classiche in condizioni di isolamento in un impianto convenzionale dotato di un fasciatoio. Istigare allevamento in un rack IVC (gabbia individualmente ventilata), con i ratti SPF (patogeno specifico gratuito) specificamente acquistati.
  3. Utilizzare le seguenti condizioni di alloggiamento: gamma di temperature da 19 a 24 ° C; umidità relativa: 40-60%; ventilazione: frequenza di rinnovo dell'aria: 10-15 a h; ciclo luce/buio: 12 h - 12 h.
  4. Sterilizzare tutti i attrezzature di ingabbiamento e utilizzano letti irradiati. Sistemica di implementare arricchimento gabbia mettendo asciugamani e vassoi di cartone sterile dentro le gabbie.
  5. Consentire l'accesso alla zona in condizioni limitate: nuovo cofano cappotto, maschera, guanti, scarpe e capelli di laboratorio all'ingresso.
  6. Eseguire monitoraggio dello stato di Colonia su sentinel animali ospitati su biancheria sporca su base annua, secondo le raccomandazioni di14 Felasa per strutture convenzionali. Tenere quattro o cinque animali per gabbia, con l'appropriato irradiati dieta e forniscono acidificata acqua ad libitum. Monitorare quotidianamente.
  7. Trasferimento ratti eletti per intervento chirurgico nel filtraggio gabbie superiore alle camere 2 h prima dell'intervento chirurgiche.

2. intervento chirurgico

  1. Preparare gli strumenti chirurgici: sottili forbici, una pinza, due pinze emostatiche e un porta-aghi. Durante tutte le procedure, indossare guanti, una maschera, un cappuccio e un camice da laboratorio.
  2. Dividere in modo casuale i ratti in due gruppi (PRP e soluzione salina).
  3. Prendere il topo fuori dalla sua gabbia e pesarlo. Utilizzare etichette numerate orecchio per identificare i ratti. Per evitare l'essiccazione degli occhi, posto waterdrops sulla cornea.
  4. Anestetizzare il topo per via intraperitoneale con xilazina (10 mg/kg di peso corporeo) e ketamina (80 mg/kg di peso corporeo). Per confermare amputate, sistemare gli animali sotto monitoraggio cardio-respiratorio e controllare per eventuali riflessi di occhio.
  5. Iniettare per via sottocutanea 50 µ l di buprenorfina (0,01-0,05 mg/kg ogni 8-12 h) nella zona del collo come un antidolorifico.
  6. L'arto sinistro di radersi con un rasoio elettrico, disinfettarlo con 3 alternando scrub di soluzione iso-betadine/alcolica (diluito 01:10) e posizionare il topo su un pad caldo (20 ° C) sotto un microscopio per dissezione. Posto il ratto il decubito laterale con la gamba per essere operati in una posizione superiore. Tenere la zampa con pinze chirurgiche.
  7. Usando le forbici, fare una piccola incisione laterale (20-25 mm) nella pelle che circonda il tendine di Achille sinistro e sezionare la fascia utilizzando forbice per esporre il complesso del tendine di Achille (Figura 2a).
  8. Rimuovere il tendine plantare con un paio di forbici (Figura 2b).
  9. Tagliare il tendine di Achille trasversalmente 5mm prossimale alla sua inserzione calcaneare e rimuovere una parte lunga di 5 mm utilizzando le forbici. Non suturare il tendine (Figura 2C, 2d).
  10. Suturare la fascia e poi la pelle con filo riassorbibile facendo una sutura overjet (sutura continua). Suture monofilamento possono essere utilizzate anche per prevenire il sudore dalla pelle nell'incisione chirurgica.
  11. Posizionare il ratto sotto una lampada di riscaldamento fino a quando è sveglio e quindi posizionare il ratto indietro in una gabbia (58 x 38 cm) (Nota bene: nessuna immobilizzazione è imposto).

3. PRP preparazione15

  1. Anestetizzare i ratti di donatore con xilazina (10 mg/kg di peso corporeo) e ketamina (80 mg/kg di peso corporeo) tramite l'iniezione intraperitoneale. L'iniezione di PRP avviene entro 2 h postoperatorio senza alcuna re-anestesia.
  2. Iniettare per via sottocutanea 50 µ l di buprenorfina come antidolorifico.
  3. Raccogliere il sangue intero (20 mL per ratto, sanguinamento finale) dalla puntura cardiaca in provette sterili contenenti 3,2% tampone citrato di sodio (0,109 M, anticoagulante). Quindi eutanasia ratto di iniezione intracardiaca.
  4. Per ottenere PRP, centrifugare il sangue per 10 min a 150 x g e a temperatura ambiente. Questo passaggio di centrifugazione iniziale bassa velocità produce due fasi distinte: una fase inferiore costituito da globuli rossi (RBC) che rappresenta circa il 80-90% del volume totale e una fase superiore costituita da plasma ricco di piastrine (PRP) (in genere 10-20% del sangue campione).
  5. Raccogliere delicatamente il PRP (fase superiore) in un tubo di plastica secondario utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica. Come l'interfaccia tra PRP e cellule di anima rosse è molto sciolto, non pipettare troppo vicino all'interfaccia. Quando maneggiati correttamente, contaminando RBCs in PRP deve essere inferiore a 0,05 x 103 cellule / µ l. scartare la fase inferiore rimanente e il tubo di raccolta sangue primario.
  6. Determinare il volume di PRP raccolti e misurare il conteggio delle piastrine su un analizzatore ematologico. Questi valori sono necessari per i calcoli regolare la concentrazione di piastrine nel passaggio successivo. Un conteggio del globulo è anche utile per valutare la potenziale contaminazione con globuli rossi e globuli bianchi. piastrinica concentrazione in PRP in questa fase è in genere 1 – 1.5 x106/µL.
  7. Eseguire una seconda centrifugazione di PRP per 10 min a 1.000 x g e a temperatura ambiente. Questo passaggio di centrifugazione ad alta velocità produce un pellet sciolto della piastrina e un surnatante costituito da plasma autologo della piastrina-poveri (PPP). Utilizzando i valori determinati al punto 3.6, calcolare il volume del surnatante da scartare per concentrare il PRP e raggiungere una concentrazione finale di 2,5 x106/µL.
  8. Delicatamente e raccogliere il surnatante (PPP) in un tubo di plastica secondario utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, lasciando circa due terzi del volume finale calcolato al punto 3.7. Come il pellet è sciolto, una quantità significativa di piastrine è persa quando PPP viene scartato, quindi potenzialmente riducendo la concentrazione finale desiderata.
  9. Attentamente risospendere il sedimento della piastrina con il surnatante rimanente pipettando ripetute delicato. Misurare il conteggio delle piastrine su questo PRP concentrato. Se necessario, aggiungere il volume appropriato di PPP autologo per raggiungere la concentrazione di destinazione finale.
    Nota: Utilizzare il PRP entro 3 ore di preparazione.
  10. Aggiungere 50 µ l di CaCl2 (11 mEq 10 mL) per mL di PRP per attivare le piastrine.
  11. Iniettare 50 µ l di PRP freschi o soluzione salina con un ago 21G direttamente nel sito del funzionamento suturato circa 1 h dopo la preparazione. Durante questo tempo, tenere PRP a temperatura ambiente.
  12. Monitorare il recupero funzionale dei ratti da vicino durante i giorni dopo l'intervento chirurgico e prima della rimozione del tendine di Achille.

4. rimozione del tendine di Achille e prove biomeccaniche16

  1. 5, 15 o 30 giorni più successivamente5, pesare il ratto. Quindi, anestetizzare con xilazina (10 mg/kg di peso corporeo) e ketamina (80 mg/kg di peso corporeo) tramite l'iniezione intraperitoneale.
  2. Iniettare per via sottocutanea 50 µ l di buprenorfina come antidolorifico. Rimuovere il tendine prima di sacrificare l'animale per mantenere le condizioni fisiologiche per quanto possibile.
  3. Radere l'arto sinistro e posizionare il ratto sotto un microscopio per dissezione. Posto il ratto il decubito laterale con la gamba per essere operati in una posizione superiore. Tenere la zampa con le dita.
  4. Praticare una piccola incisione (10 mm) in luogo di funzionamento precedente ed estendere fino a quando il suralis del tricipite è esposto.
  5. Per rimuovere il guarigione del tendine di Achille, tagliare l'osso calcaneare trasversalmente il 5-10 mm distale al suo attaccamento del tendine di Achille. Quindi sezionare una parte del suralis tricipite, che è attaccato al tendine di Achille (Figura 3b). La parte muscolare deve essere abbastanza grande da contenere il cryo-mascella (Figura 3 c-d). Il campione viene posto immediatamente in cryo-mascella usando il forcipe (Figura 3e).
  6. Dopo aver rimosso il complesso muscolo-tendine-osso, eutanasia il ratto di iniezione intracardiaca con Nembutal (200 mg/kg). Confermare la morte valutando l'assenza di ritmo cardiaco e la respirazione per 15 min.
  7. Inserire l'unità muscolo della mascella superiore (Figura 3e), chiuderlo e posizionarlo verticalmente in un universale macchina di prova (106,2 kN, Figura 3a). Quindi fissare l'osso tra i morsetti inferiori della macchina (Figura 3f).
  8. Aggiungere azoto liquido in entrambi i bacini di mascella superiore per bloccare il muscolo, in modo che esso è un ordine di grandezza più il tendine rigido e non si deforma durante la prova di trazione.
  9. Quando la zona di congelamento raggiunge il bordo del morsetto di metallo, avviare la prova di trazione, così il tendine manterrà la sua struttura. Impostare la velocità di spostamento della macchina ad una velocità costante di 1 mm/s fino a rottura. Registrare la resistenza ultima a trazione (UTS) data in Newton (N) in un computer.
  10. Per calcolare l'area della sezione trasversale, posizionare due telecamere perpendicolari tra loro, formando una forma ellittica e scattare foto.
  11. Per tenere conto la differenza tra l'area della sezione trasversale dei tendini guarigione, normalizzare il UTS per un'unità di superficie (N per millimetro quadrato), che rappresenta lo sforzo meccanico sperimentato dal tessuto.

5. istologici

Nota: 15 tendini di ogni gruppo ha subito l'analisi istologica.

  1. Dopo la sua rimozione, immergere il tendine di Achille immediatamente in paraformaldeide al 4% per preservare la sua struttura (1 mm di tessuto viene fissato all'ora, così il tempo di fissazione varia a seconda delle dimensioni del tendine).
  2. Sostituire il paraformaldeide di etanolo al 70% e lasciare il campione per almeno una notte in questa soluzione.
  3. Posizionare il tendine in un piccolo contenitore di plastica con fori e inserire tale contenitore in una soluzione di etanolo 70% fresco per 1 h.
  4. Mettere il recipiente in etanolo al 95% per 1 h. ripetere.
  5. Mettere il recipiente in etanolo al 100% per 1 h. ripetere.
  6. Mettere il recipiente in xilene 100% per 1 h. ripetere.
  7. Ora posto il contenitore di plastica, che contiene il tendine, in paraffina liquida (56 ° C) e lasciarlo tutta la notte.
  8. Utilizza una stazione di incorporamento (attrezzata con cera fusa, un piatto caldo e un piatto freddo), scegliere uno stampo metallico che meglio si adatta il campione di tessuto e riempirlo con paraffina liquida un po' in modo che la base è coperto.
    Nota: Orientare il campione per ottenere sezioni verticali presso il microtomo.
  9. Quando il campione è posizionato correttamente, riempire lo stampo con paraffina liquida e posizionatelo sopra la macchina frigorifera. Lasciarlo raffreddare per almeno 15 min.
  10. Togliere il blocco di paraffina e posizionarlo sul ghiaccio per almeno 30 min.
  11. Preparare più lastre di vetro pulito e mettere alcune gocce d'acqua deionizzata su di loro.
  12. Presso il microtomo, tagliare i blocchi in sezioni di 5 µm (solo uso sezioni dalla parte centrale del tendine) e la sezione in una diapositiva.
  13. Porre i vetrini in un forno di riscaldamento a 65 ° C per diversi minuti, affinché la paraffina appena inizia a sciogliersi per legare il tessuto al vetro.
  14. Porre i vetrini contenenti paraffina sezioni in un supporto di fetta.
  15. Ora deparaffinizzare e reidratare il tessuto inserendolo nei bagni successivi seguenti:
    8 min in xilene (bagno 1)
    4 min in xilene (bagno 2)
    2 min in etanolo al 100%
    2 min in etanolo al 95%
    2 min in etanolo al 70%
    2 min in acqua deionizzata
  16. Per ematossilina-eosina, posizionare il tessuto nelle seguenti soluzioni.
    1. Immergere il tessuto per 8 min in soluzione di ematossilina (1g ematossilina monoidrato, 0,2 g KIO3, 50g AIK (SO4)2.12h2O; glicerina 200ml; regolare a 1 L con acqua distillata).
    2. Immergere il tessuto per 8 min sotto acqua corrente.
    3. Immergere il tessuto per 30 s in soluzione di eosina (0,25% eosina in 100 mL di acqua distillata contenente 200 µ l di acido acetico diluito).
    4. Immergere il tessuto per 2 minuti sotto acqua corrente.
  17. Per la colorazione tricromica di Masson, seguire questi passaggi.
    1. Dopo la reidratazione, inserire le sezioni in un contenitore con allume di ferro (0,5 g (NH4) Fe (SO4)2.12h2O 10 mL H2O) e chiudere il contenitore. Riscaldare per 3 min a 280 W in un forno a microonde.
    2. Lasciarlo raffreddare per un minuto e quindi risciacquare con acqua deionizzata.
    3. Inserire le sezioni in un contenitore chiuso con soluzione di ematossilina di Regaud (ematossilina 0,5 g sciolto in 50 mL di H2O a 50 ° C, quindi aggiungere 5 mL di etanolo al 95% e 5 mL glicerina), scaldarlo per 90 s a 280 w.
    4. Sciacquare con acqua deionizzata.
    5. Inserire le sezioni in una soluzione di acido picrico (a saturazione in metanolo) per 3 min, sciacquare per 5 minuti sotto acqua corrente e poi metterlo in acqua deionizzata per pochi secondi.
    6. Ora posto le sezioni in Fucsina acida (0,5 g in 50 mL di H2O contenenti 0,25 mL di acido acetico diluito) per 5 s e risciacquare sotto acqua corrente fino a quando scomparirà la tintura.
    7. Incubare le sezioni in soluzione di Acido fosfomolibdico (0,5 g in 50 mL di H2O) per 5 min, posto per pochi secondi in acqua deionizzata.
    8. Inserire le sezioni in soluzione verde chiaro (0,5 g in 50 mL di H2O contenenti 0,25 mL di acido acetico diluito) per un altro 5 min e posizionarlo sotto acqua corrente fino a quando scomparirà la tintura.
  18. Ora disidratare il tessuto nuovo.
    1. Immergere la sezione per 1 min in etanolo al 70%.
    2. Immergere la sezione per 1 min in etanolo al 95%.
    3. Immergere la sezione per 1 min in etanolo al 100%.
    4. Immergere la sezione per 1 min in xilene (bagno 1).
    5. Immergere la sezione per 1 min in xilene (bagno 2).
    6. Rimuovere le sezioni senza togliere troppo xilene e mettere una goccia di mezzo di montaggio sul campione.
    7. Mettere un vetrino coprioggetto sulla parte superiore (senza provocare eventuali bolle) e lasciare indurire per almeno 2 h.
    8. Idrolizzare 5 sezioni istologiche (ciascuno di un tendine diverso) di ogni gruppo in 6 N HCl per 3 h e determinare la concentrazione di collagene misurando idrossiprolina come indice a 5 µm senza macchia sezioni.
  19. Normalizzare i risultati per l'area della sezione utilizzando il software del produttore.
  20. Alcune delle sezioni macchia con luce verde macchia per visualizzare e quantificare il collagene fibrillare di analisi coadiuvata dal computer.
  21. Le sezioni per la scansione e convertire le immagini in sfumature di grigio utilizzando il software IrfanView. Utilizzare il software per semi-quantificazione (ad es., Quantity One).

6. valutazione molecolare

  1. Dopo la rottura del tendine, che si verifica durante le prove meccaniche, prelevare i campioni, snap congelarli in azoto liquido e conservarli a-80 ° C (PRP e soluzione salina)17.
  2. Utilizzare un kit commerciale di RNA totale per isolare di RNA totale17.
  3. Misurare l'espressione di collagene (Col I e Col III), metalloproteinasi della matrice (MMP-2, MMP-3 e MMP-9) e tenomodulin (TNMD) da RT-PCR17,18.
  4. Normalizzare i livelli di espressione di mRNA per i livelli di 28S19.

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Risultati

I risultati sono espressi come media ± deviazione standard di media e sono stati confrontati con analisi della varianza (ANOVA). Un ANOVA a due vie e post hoc test de Scheffe, che è un test parametrico, sono stati utilizzati.

La resistenza ultima a trazione (UTS) necessaria per provocare una rottura dei tendini d'Achille non-ferito di ratti era 42.0 ± 5,7 N (n = 10). La resistenza alla trazione è aumentato significativa...

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Discussione

Le piastrine sono essenziali per la fase infiammatoria iniziale del tendine del processo di guarigione. Quando queste piastrine sono esposti all'associazione di tessuto o fattori che inducono la coagulazione, rilasciano fattori di crescita che sono immagazzinati nei granuli α. A causa di questa interazione, macromolecole della matrice extracellulare sono sintetizzati e cellule mesenchimali proliferano. Le piastrine hanno anche un'attività chemiotattica su cellule progenitrici nella circolazione sanguigna, migliorando l'a...

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Dichiarazioni

Conflitti di interesse non dichiarati.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto da Standard de Liège e Lejeune - Lechien concede dei fondi Frédéricq Leon.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Xilazina (Xyl-M)VMDnessunoanestetico
Ketamin (Jé tamine 1000 CEVA)CEVA Santé Animalenonanestetico
Buprenorfina (Vetergé sic Multidosis)ALSTOEnoneAntidolorifico
iso-BetadineMEDA-PharmanoneDesinfectant
filato riassorbibile Vicryl 6/0Johnson &
NembutalCEVA Santé AnimalenoneAnestetico
ParaformaldeideSigma-AldrichP6148Preserva la struttura del tessuto
Isopropanolo 100%VWR20,922,364
Etanolo 95%VWR20,823,362
XileneVWR28973.363
ParaffinaVWRLEIC3950.1006
EmatossilinaMillipore1.15938.0025Colorante
eosinaMillipore1.15935.0100Colorante
EukittSigma-Aldrich3989Mezzo di montaggio
CaCl2
Johnson

Riferimenti

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