Articolo metodologico

Tecniche di laboratorio utilizzate per mantenere e differenziare i biotipi di Vibrio cholerae Isolati clinici ed ambientali

DOI:

10.3791/55760

⸱

30 maggio 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Plymouth State University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Questo manoscritto descrive le appropriate tecniche di manutenzione Vibrio cholerae oltre ad una serie di dosaggi biochimici, utilizzati collettivamente per una differenziazione rapida e affidabile tra la clinica e l'ambiente V. Biotipi di colera in un ambiente di laboratorio.

Abstract

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Il batterio Gram-negativo acquatico Vibrio cholerae è l'agente etiologico del colera della malattia gastrointestinale infettiva. A causa della prevalenza e gravità globali di questa malattia, V. Il colera è stato ampiamente studiato sia in ambito ambientale che in laboratorio, che richiede una corretta manutenzione e tecniche di coltura. Classici e El Tor sono due biotipi principali che compongono il V. Colerae O1, ognuno dei quali presenta caratteristiche uniche genotipiche e fenotipiche che forniscono meccanismi affidabili per la caratterizzazione del biotipo e richiedono condizioni distintive di coltura che inducono la virulenza. Indipendentemente dal biotipo del ceppo causale per qualsiasi infezione o focolaio, il trattamento standard per la malattia comprende terapia di reidratazione integrata con un regime di antibiotici. Tuttavia, la classificazione di biotipo può essere necessaria per studi di laboratorio e può avere impatti più ampi nel campo biomedico.Nei primi anni 2000 sono stati identificati isolati clinici che presentano tratti genotipici e fenotipici sia dai biotipi classici che da El Tor. Gli ibridi di nuova identificazione, chiamati El Tor, hanno causato l'identificazione clinica e ambientale del biotipo di isolamento a diventare più complessi rispetto ai precedenti protocolli tradizionali di identificazione singola. Oltre a descrivere V. Le tecniche di mantenimento e tecniche di coltura del colerae, questo manoscritto descrive una serie di schermati genetici basati su PCR basati su gene ( ctxB e tcpA ) e saggi fenotipici (resistenza alla polimicina B, metabolismo citrato, attività proteolitica, attività emolitica, motilità e metabolismo del glucosio tramite Voges- Proskauer) utilizzati collettivamente per caratterizzare e / o distinguere tra biotipi classici e El Tor. Insieme, questi dosaggi forniscono un approccio sistematico efficiente da utilizzare come alternativa o, in aggiunta, a costosi esercizi di intensità lavorativa nella caratterizzazioneDi V. Cholerae isolati clinici (e ambientali).

Introduzione

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Il colera è una malattia dell'intestino tenue distale causata dal consumo di alimenti contaminati o di acqua contenente il batterio Gram-negativo acquatico Vibrio cholerae . I sintomi del colera includono vomito e diarrea acquosa incontrollabile, portando ad una grave disidratazione che, se non trattata correttamente, provocherà la morte. V. Il colerae può essere diviso in oltre 200 serogruppi basati sulla struttura del lipopolysaccharide O-antigene della superficie cellulare. Tuttavia, solo 2 serogruppi, O1 e O139, hanno mostrato potenziale epidemico o pandemico 1 , 2 . Inoltre, il serogroup O139 è stato principalmente isolato per l'Asia sud-orientale 3 , 4 , mentre il sierogruppo O1 è distribuito in tutto il mondo. Inoltre, il serogroupo O1 può essere diviso in 2 biotipi principali: classici e El Tor. Il biotipo classico era responsabile delle prime 6 pandemie del coleraTra il 1817 e il 1923. La peggiorata settima pandemia è il risultato del biotipo El Tor, che ha spostato globalmente il biotipo classico nell'ambiente 5 , 6 , 7 . Sono stati recentemente presentati ceppi che contengono caratteristiche distintive di biotipi classici e El Tor 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 e da allora sono stati denominati varianti El Tor 13 , 17 . Alcune varianti di El Tor hanno dimostrato elevate capacità di virulenza con una progressione più rapida e grave della malattia rispetto a quanto precedentemente osservato, sottolineandoLa necessità di un approccio più completo all'identificazione degli agenti e alla prevenzione e trattamento delle malattie 8 , 9 , 18 . Mentre l'identificazione del biotipo non impone immediatamente il trattamento, ulteriori progressi nello sviluppo del vaccino e nei futuri agenti terapeutici possono beneficiare della distinzione tra biotipo.

La prima serie di protocolli elencati qui consentirà agli investigatori di mantenere correttamente V. Ceppi di colera in un ambiente di laboratorio. La coerenza e l'analisi successiva richiedono la preparazione e la crescita degli stock di isolati, che non dipendono dal biotipo. Tuttavia, per indurre in modo ottimale l'espressione genica di virulenza, sono necessarie tecniche indipendenti di coltura biotipo 19 . Inoltre, la preparazione per diversi dosaggi genetici e biochimici è descritta in questo manoscritto.

Tossina del colera (CT) e la tossina co-re(TCP) sono due principali fattori di virulenza controllati dal regolatore master ToxT in entrambi i biotipi del V. Il colerae O1 sierogruppo 20 . CT è una tossina bipartita composta da cinque CtxB Subunità che circondano una singola subunità CtxA ed è responsabile della rapida perdita di elettroliti associata al colera. Il TCP è un pilone di tipo IV codificato dal tcp operon ( tcpABQCRDSTEF ) ed è coinvolto nell'attaccamento e nella colonizzazione dell'intestino tenue distale. TcpA è il primo gene dell'operone tcp che codifica le singole subunità piline essenziali per la costruzione del pilus 8 . La sequenza genica per ctxA è completamente conservata tra biotipi classici e El Tor, mentre ctxB e tcpA si differenziano tra i due biotipi ma sono conservati all'interno di ciascun biotipo 8 . CtxB è completamente conservato tra i biotipi ad eccezione di due posi base(115 e 203). Nel biotipo El Tor, la timina risiede nelle posizioni base 115 e 203, mentre il biotipo classico contiene citosina a queste basi. TcpA è completamente conservato all'interno di ogni biotipo, ma differisce da molteplici basi tra biotipi. Queste distinzioni genetiche servono come marcatori di identificazione biotipo primari, e dopo la sequenza del prodotto di amplificazione della reazione di polimerasi (PCR), inclusi questi siti, le sequenze di isolamento possono essere confrontate con il classico O395 o WT El Tor N16961 di tipo wild (WT) per determinare lo sfondo del biotipo Di CT e TCP rispettivamente, in un dato isolamento di V. cholerae .

Numerosi protocolli sono stati sviluppati per caratterizzare le distinzioni fenotipiche tra i biotipi classici e El Tor 21 , 22 , 23 . Polimicina B è un antibiotico peptidico che compromette l'integrità della membrana cellulare esterna in bacTeria e la resistenza alla polimicina B possono essere visualizzati attraverso il saggio di resistenza della polimigina B 21 . Il citrato è un substrato primario del ciclo di Kreb, e la capacità di metabolizzare il citrato come fonte di carbonio unica può essere determinata usando il saggio del metabolismo citrato 22 . HapR codifica un regolatore globale e il regolatore di sensori quorum master in V. cholerae, HapR, che si lega a varie regioni del promotore e regola l'espressione del gene e dell'operone 24 . Alcuni ceppi patogeni di V. cholerae hanno una mutazione in movimento naturale nel gene hapR che ha causato la perdita di questa regolazione dipendente dalla densità dell'espressione genetica di virulenza 24 , 25 . La misurazione dell'attività di proteasi regolata da HapR utilizzando il supporto agarico del latte permette al ricercatore di identificare se un particolare isolato contiene un HapR 23 funzionale. IlI test di hemolysis per una capacità del ceppo di secernere enzimi emolitici che lissano i globuli rossi; Il grado di emolisi può essere visualizzato sulle piastre di agar sangue 23 . La motilità è spesso associata alla virulenza di V. cholerae e può essere analizzata usando le piastre agarico agar 23 . Il test Voges-Proskauer esamina la capacità di uno strain di fermentare il glucosio come una sola fonte di carbonio e produrre l'acetoina sottoprodotto 21 . Con l'emergere di varianti di El Tor, è difficile prevedere i risultati di un determinato dosaggio fenotipico senza estesa screening genotipica e prima di dedurre lo sfondo biotipo di V. Isolati di colerae, si raccomanda di eseguire questo insieme di dosaggi 23 e confrontare i risultati con i ceppi di riferimento come nella tabella 2 .

In questo contesto, abbiamo avanzato una serie di protocolli, utilizzando collettivamente l'aforemeI test genotipici e fenotipici per un approccio più completo alla caratterizzazione di V. Biotipi di colera. Inoltre, abbiamo descritto le distinzioni genotipiche e fenotipiche del V noto. Varianti del colerae El Tor (MQ1795 e BAA-2163), rispetto ai ceppi di riferimento di biotipo comunemente usati (WT classico O395, WT El Tor C6706 e WT El Tor N16961, Tabella 1 ). L'emergere di varianti El Tor ha presentato sfide all'affidabilità dei protocolli di individuazione biotipo di singolo dosaggio precedentemente impiegati; Tuttavia, questo sistema di identificazione multipla consentirà una caratterizzazione più affidabile dei criteri clinici e ambientali. Isolati di colera .

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Protocollo

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Nota: le considerazioni di tempo per ogni dosaggio devono essere effettuate poiché le singole preparazioni per i supporti richiedono tempi diversi. Ad esempio, i supporti a lastre di agarro solido devono essere abbassati e asciugati (1-2 giorni). Ulteriori considerazioni di tempo ( cioè la colonia singola e la crescita della coltura durante la notte) sono specificate in ciascun protocollo e si trovano nella tabella 2 .

1. Preparazione dei supporti

  1. 1x salina a tampone fosfato (PBS)
    1. Pesare 4,0 g NaCl, 0,1 g KCl, 0,72 g Na 2 HPO 4 e 0,12 g KH 2 PO 4 . Combinare i costituenti in un pallone Erlenmeyer da 1 L, regolare il volume a 500 mL con acqua deionizzata, regolare il pH a 7,2 utilizzando un misuratore di pH e aggiungere HCl in goccia alla soluzione e sterilizzare con autoclave o filtro usando un filtro da 0,22 μm. 1x PBS può essere conservato a temperatura ambiente a tempo indeterminato.
      ATTENZIONE: HCl è un acido concentrato e deve essere manipolato secondoAlle norme istituzionali, locali, statali e federali. Per le linee guida appropriate per la manipolazione fare riferimento alla scheda di dati di sicurezza fornita dal produttore.
  2. Luria-Bertani (LB) brodo
    1. Pesare 5,0 g di tryptone, 2,5 g di estratto di lievito e 2,5 g di NaCl. Combinare i componenti in una bottiglia da 1 L, regolare il volume a 500 mL con acqua deionizzata, autoclave e conservare a temperatura ambiente fino a 6 mesi. Per le condizioni indotte da virulenza classica biotipo, regolare il pH a 6,5 ​​con HCl prima dell'autoclavamento.
  3. AKI Medium contenente 0,03% (w / v) NaHCO 3
    1. Per il componente 1 (medium AKI): pesare 7,5 g di peptone, 2,0 g di estratto di lievito e 2,5 g di NaCl. Combinare i componenti in una bottiglia da 1 L, regolare il volume a 450 mL con acqua deionizzata e autoclave. Il mezzo AKI può essere conservato a temperatura ambiente fino a 6 mesi.
    2. Per il componente 2 (NaHCO 3 ): pesare 1,5 g di NaHCO 3 e regolare il volumeA 50 mL con acqua deionizzata in una vescicola sterile. Filtro sterilizzare NaHCO 3 utilizzando un filtro da 0,22 μm. NaHCO3 deve essere preparato immediatamente prima dell'uso.
    3. Asepticamente combinare i due componenti creando un rapporto 1:10 filtrando il componente 2 nella componente 1 prima dell'uso.
  4. Luria-Bertani (LB) piatti di agar
    1. Pesare 5,0 g di tryptone, 2,5 g di estratto di lievito, 2,5 g di NaCl e 7,5 g di agar. Combinare i componenti in un pallone Erlenmeyer da 1 L, regolare il volume a 500 mL con acqua deionizzata, autoclave e preparare in piatti standard Petri di 100 mm x 15 mm sterili. I supporti placcati possono essere immagazzinati in plastica per un massimo di 6 mesi, con coperchio fino a 4 ° C.
  5. LB Agar Piatti Supplementati con Polymyxin B
    1. Per il componente 1 (agar LB): pesare 5,0 g di tryptone, 2,5 g di estratto di lievito, 2,5 g di NaCl e 7,5 g di agar. Combinare i costituenti in un pallone Erlenmeyer da 1 L, regolare il volume a 500 mL wiL'acqua deionizzata e l'autoclave.
    2. Per il componente 2 (polimicina B): sciogliere la polimicina B in acqua deionizzata in un tubo sterile di microcentrifuga da 2 ml a una concentrazione di 50.000 UI / μl e sterilizzare con filtro utilizzando un filtro da 0,22 μm.
    3. Una volta che il componente 1 è fresco al tocco, ma non ancora solidificato, aggiungere asetticamente 500 μL di componente 2 al componente 1 creando una concentrazione finale di 50 UI / μL e mescolare accuratamente. Preparare piatti standard Petri di 100 mm x 15 mm versando agar mischiati nei piatti di Petri. I supporti placcati possono essere immagazzinati in plastica per un massimo di 3 mesi, con coperchio fino a 4 ° C.
  6. Piatti minimi di agar di citrato
    1. Per il componente 1 (agar con blu bromotimolo): pesare 7,5 g di agar e 0,02 g di bromotimolo blu. Combinare i costituenti in un pallone Erlenmeyer da 1 L, regolare il volume a 450 mL con acqua deionizzata e autoclave la miscela.
    2. Per il componente 2 (10x VBMM): pesare 10,1 g di MgSO 4 7H 2 O, 10,0 g di acido citrico acido H 2 O, 50,0 g di K 2 HPO 4 anidro e 17,5 g di NaNH 4 HPO 4 4 H 2 O. Combinare i costituenti in un pallone Erlenmeyer da 1 L, regolare il volume a 500 ml Con acqua deionizzata e sterilizzazione autoclave o filtro usando un filtro da 0,22 μm. 10x VBMM può essere conservato a temperatura ambiente fino a 6 mesi.
    3. Aggiungere 50 ml di componente 2 al componente 1 e preparare in piatti standard Petri da 100 mm x 15 mm versando agar mischiati nei piatti di Petri. I supporti placcati possono essere immagazzinati in plastica per un massimo di 6 mesi, con coperchio fino a 4 ° C.
  7. Piatti di Agar Milk
    1. Per il componente 1 (latte): pesare 8,0 g di latte secco non grasso istantaneo in un pallone Erlenmeyer da 1 L, regolare il volume a 200 ml con acqua deionizzata e autoclave.
    2. Per il componente 2 (agar con infusione cerebrale-cuore): pesare 3,68 g di infusione cerebrale-cuore e 6,0 g di agar. Combina il conIn un pallone Erlenmeyer da 500 mL, regolare il volume a 200 mL con acqua deionizzata e autoclave.
    3. Combinate i due componenti versando il componente 2 nella componente 1, dopo aver autoclavato e mescolato accuratamente. Preparare in piatti di Petri sterili da 150 mm x 15 mm. Le piastre di latte possono essere conservate fino a una settimana avvolte in plastica, con coperchio verso il basso a 4 ° C. Preparare in piatti di Petri sterili da 150 mm x 15 mm versando agar mischiati nei piatti di Petri.
  8. Piastre di agaricità
    1. Per il componente 1 (LB agar): pesare 5,0 g di tryptone, 2,5 g di estratto di lievito, 2,5 g di NaCl e 2,0 g di agar. Combinare i costituenti in un pallone Erlenmeyer da 1 L, regolare il volume a 500 mL con acqua deionizzata e autoclave.
    2. Per il componente 2 (1% (w / v) cloruro di trifeniltetrazolium; TTC): pesare 0,25 g di TTC. Regolare il volume a 25 ml con acqua deionizzata in una vescicola sterile e sterilizzare con filtro utilizzando un filtro da 0,22 μm. Conservare fino a 6 mesi a temperatura ambiente avvoltoIn foglio per minimizzare l'esposizione alla luce.
    3. Aggiungere 2,5 ml di 1% (w / v) TTC sterile ai supporti autoclavati.
    4. Versare il mezzo più spesso possibile (≥50 mL / piastra) in grandi piatti di Petri sterili 150 mm x 15 mm. I supporti placcati possono essere immagazzinati in plastica fino a una settimana, con coperchio fino a 4 ° C. Preparare in piatti di Petri sterili da 150 mm x 15 mm versando agar mischiati nei piatti di Petri.
  9. Voges-Proskauer (VP)
    1. Per il componente 1 (Methyl Red-Voges-Proskauer broth; MR-VP): pesare 1,7 g di supporto MR-VP in un pallone Erlenmeyer da 500 ml, regolare il volume a 100 ml con acqua deionizzata e autoclave. Il brodo sterile MR-VP può essere conservato a temperatura ambiente fino a 6 mesi.
    2. Per il componente 2 (5% (w / v) alfa (α) naphtolo): pesare 1,0 g di α-naftolo in una vescicola sterile e regolare il volume a 20 ml con 95% etanolo. L'α-naftolo può essere conservato a temperatura ambiente fino a 1 settimana avvolto in fogli per ridurre al minimo la luceosure.
    3. Per il componente 3 (40% (w / v) idrossido di potassio; KOH): pesare 20,0 g di KOH in una vescicola sterile, regolare il volume a 50 ml con acqua sterile deionizzata. KOH può essere conservato fino a 6 mesi a temperatura ambiente in un recipiente di plastica.

2. Manutenzione e crescita di V. Ceppi di colera

  1. Preparazione e utilizzo di colture congelate
    1. Pellet 1.8 ml di coltura di notte per 2 min per centrifugazione (≥8.600 xg) in un tubo sterile di microcentrifuga da 2 ml, rimuovere il surnatante e riposizionare il pellet cellulare in 900 μL di brodo fresco di LB pipettando.
    2. Aggiungere 900 μL di glicerolo sterile al 60% (v / v) alla coltura e mescolare mediante vortexing.
    3. Trasferire la miscela in un tubo criogenico sterile da 2 ml e conservare a tempo indeterminato a -80 ° C.
    4. Per utilizzare, rimuovere una piccola quantità di stock congelata usando un ciclo inoculatore sterile e una striscia per singole colonie su LB agAr. Immediatamente rimettere a magazzino congelato a -80 ° C dopo l'uso per evitare che le culture si scongiurino completamente. Incubare le piastre con il coperchio lungo il basso per 12 a 16 ore a 37 ° C.
  2. Crescita di culture di overnight in liquido medio
    1. Striature per colonie singole (secondo la sezione 2.1.4) da scorte surgelate su piastre LB agar. Incubare le piastre con il coperchio laterale per 12 a 16 ore a 37 ° C.
    2. Inoculare 4 ml di liquido LB liquido in un tubo di coltura sterile da 10 ml con una singola colonia toccando la superficie della singola colonia con un bastone applicatore sterile e trasferendo la colonia nel brodo liquido.
    3. Incubare con aerazione in un incubatore a scuotitore a 225 giri / min per 12 a 16 h a 37 ° C.
  3. Curva di crescita
    1. Preparare la coltura durante la notte in brodo LB liquido come precedentemente indicato nel protocollo 2.2.
    2. Fai una diluizione 1: 100 di coltura durante la notte trasferendo 250 μL di coltura overnight a 25 ml di brodo fresco di LB in un pallone Erlenmeyer da 250 ml sterile.
    3. Misurare la densità ottica delle colture liquide a 600 nm (OD 600 ) ogni ora a partire dall'inoculazione (T 0 ).
    4. Incubare una diluizione 1: 100 di coltura durante la notte con aerazione in un incubatore a scuotitore a 225 giri / min fino a 30 h a 37 ° C o fino a raggiungere la massima densità della coltura.
    5. Grafico OD 600 vs. tempo e utilizzare regressione lineare per determinare il tempo di raddoppio approssimativo per ogni ceppo.
  4. El Tor Biotipo Virulenza Induzione delle Condizioni
    1. Striata per singole colonie da scorta congelata su piastre LB agar. Incubare le piastre verso il basso con coperchio, per 12 a 16 ore a 37 ° C.
    2. Inoculare 10 mL di mezzo AKI contenente 0,03% (w / v) NaHCO 3 con una sola colonia.
    3. Incubare la coltura senza aerazione a 37 ° C per 3,5 ore.
    4. Rimuovere 7 mL di coltura e incubare le restanti 3 mL di cultuCon aerazione in un incubatore a scuotitore a 225 giri / min per altri 4 h.
  5. Condizioni di inducimento della virulenza di biotipo classico
    1. Striata per singole colonie da scorta congelata su piastre LB agar. Incubare le piastre con il coperchio laterale per 12 a 16 ore a 37 ° C.
    2. Inoculare 4 mL di liquido LB liquido (pH 6,5) con una singola colonia.
    3. Incubare con aerazione in un incubatore a scuotitore a 225 giri / min per 12 a 16 h a 30 ° C.
  6. Pellet cella di lavaggio in 1x PBS
    1. Pellet 1.8 ml di coltura durante la notte per 2 min per centrifugazione (≥8.600 xg) in un tubo sterile di microcentrifuga da 2 ml e rimuovere il surnatante usando una pipetta. Riposizionare il pellet di cellula in 1,8 ml di 1x PBS pipettando.
    2. Ripetere la procedura di lavaggio tre volte seguita da una resuspensione finale in 1,8 mL di 1x PBS.

3. Caratterizzazione V. Biotipi del colera

  1. PSchermate genetiche basate su CR utilizzando ctxB e tcpA
    1. Progettare un insieme di primer, che annealizzano circa 50-70 bp a monte ea valle degli start e stop di traslazione di ctxB e tcpA.
    2. Preparare la coltura durante la notte in brodo LB liquido come precedentemente indicato nel protocollo 2.2.
    3. Isolare il DNA cromosomico utilizzando un kit commercialmente disponibile per i batteri Gram-negativi. Il DNA cromosomico purificato può essere immagazzinato indefinitamente a -20 ° C. L'isolamento cromosomico del DNA usando i kit disponibili in commercio richiede generalmente circa 4 h.
    4. Utilizzare un spettrofotometro a micro-volume per assicurare che il campione del DNA cromosomico sia di alta qualità (A 260/280 > 1,8).
    5. Per ciascun isolamento cromosomico del DNA, preparare le reazioni di polimerasi (PCR) su ghiaccio nel tubo sterile di 200 μl di PCR e amplificare le regioni di ctxB e tcpA usando componenti standard PCR: Taq polimerasi e buFfer (o equivalenti), soluzione dNTP e primer avanti / indietro. Utilizzare parametri standard PCR (~ 3 h). Ad esempio, utilizzare il seguente protocollo:
      1. Denatura iniziale a 95 ° C per 120 s.
      2. Denatura a 95 ° C per 60 s.
      3. Applicare primer a 60 ° C per 45 s.
      4. Estendere a 72 ° C per 90 s.
      5. Ripetere i passaggi da 3.1.5.2 a 3.1.5.4 per 34 cicli.
      6. Estensione finale 72 ° C per 600 s.
      7. Tenuta infinita a 4 ° C.
    6. Dye 5 μL di rispettivi prodotti PCR usando un colorante di caricamento a gel di DNA standard 6x e caricare circa 10 μL di scala 1 kb e 10 μL di prodotto PCR su un gel agarosico al 1% in 1x Tris-Borato-EDTA (TBE) buffer.
    7. Eseguire l'elettroforesi a gel a 130 V finché il frontale del colorante non raggiunge la fine, ma non fuori, del gel (circa 90 minuti). Si consiglia di monitorare costantemente come tensione e tempi di funzionamento possono variare a seconda dell'apparecchiatura.
    8. Alla verifica delUna amplificazione PCR di successo alla dimensione prevista, purificare il restante 45 μl di prodotto PCR usando un kit di pulizia e concentratore del DNA disponibili in commercio.
    9. Sequenza di prodotti PCR puliti utilizzando gli stessi primer utilizzati per l'amplificazione PCR e prepararsi secondo le linee guida locali di sequenziamento.
    10. Confronta il formato FASTA di sequenze di gene da ogni isolato alla sequenza pubblicata disponibile sul sito NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/), cercando i seguenti numeri di accesso nella casella della query di ricerca.
    11. CtxB : regione (classica) tra VC0395_A1059 a VC0395_A1060 (El Tor) VC_1456
    12. TcpA : (classico) VC0395_A0353 (El Tor) VC_0828
  2. Analisi fenotipiche per la classificazione di biotipo mediante spotting
    1. Preparare la coltura durante la notte in brodo LB liquido come precedentemente indicato nel protocollo 2.2.
    2. Lavare le pellicole di cellule come specificato nel protocollo 2.6.
    3. Usare una pipetta aSpot 1 μl di coltura lavata in corrispondente mezzo. Per le specifiche di selezione e incubazione medio, fare riferimento alla Tabella 2.
  3. Analisi della carenza
    1. Preparare la coltura durante la notte in brodo LB liquido come precedentemente indicato nel protocollo 2.2.
    2. Lavare le pellicole di cellule come specificato nel protocollo 2.6.
    3. Inoculare le piastre di agarità agarico inserendo l'inoculazione dello straccio nella coltura liquida lavata e "pungere" verticalmente nei supporti. In mezzo a ogni inoculazione, sterilizzare il coltello con un bruciatore di Bunsen e, quando pigiate l'agar, assicurati che il pungo inoculato non si piega, in quanto ciò può alterare i risultati.
    4. Incubare le piastre con il coperchio verso l'alto per 14 a 24 ore a 37 ° C. Dopo 14 ore, controllare le piastre di movimento per evitare la crescita eccessiva di culture.
  4. Analisi Voges-Proskauer (VP)
    1. Preparare la coltura durante la notte in brodo LB liquido come precedentemente indicato nel protocollo 2.2.
    2. Inoculare 4Ml di Voges-Proskauer rosso o rosso di metile, o brodo MR-VP, pipettando 10 μL di coltura overnight in precedenza preparata in 4 mL di brodo MR-VP in un tubo di coltura sterile e incubato con aerazione in un incubatore a scuotitore a 225 giri / min per 12 a 16 H a 37 ° C.
    3. Aggiungere 150 μl di α-naftolo al 5% (w / v) e 50 μl 40% (w / v) KOH in 1 ml aliquote di coltura overnight di MR-VP in tubi di coltura sterile rispettivamente.
    4. Brevemente vortice e lasciate stare a temperatura ambiente fino a 4 h fino a quando non cambia colore.

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Risultati

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Per una corretta manutenzione e l'uso di qualsiasi ceppo batterico, è consigliabile conoscere il tempo di raddoppiamento dei ceppi di interesse. Qui, i tassi di crescita variabili dei V comunemente usati. I ceppi del colerae sono stati dimostrati attraverso una curva di crescita e sono stati calcolati approssimativi tempi di raddoppio utilizzando la regressione lineare. Il WT El Tor N16961 e la variante El Tor MQ1795 hanno dimostrato tempi di raddoppio più brevi (~ 1 h ...

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Discussione

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Dei oltre 200 identificati V. Colerae, solo O1 e O139 hanno un potenziale epidemico. Il serogroup di O1 può essere suddiviso in due biotipi: classici e El Tor. Tuttavia, sono emersi i ceppi ibridi, denominati varianti El Tor 13 , 17 , che possiedono il background Biotipo El Tor e le caratteristiche classiche del porto 8 , 9 , 10 , 1...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

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Ricerca sostenuta da New Hampshire-INBRE attraverso un Premio di Sviluppo Istituzionale (IDeA), P20GM103506, presso l'Istituto Nazionale delle Scienze Mediche Generali del NIH.

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1 kb Scala del DNANew England BiolabsN3232Shttps://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder
60% GliceroloCalbiochem356352http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352
AgarBecto, Dickinson e Co.214030
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Anidro K2HPO4Fisher ScientificP288-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID
Piastre di agar sangueRemelR01200Conservare a 4 gradi C;  http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar
Acido BoricoFisher ScientificA73-500https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID
Bromotimolo BluFisher ScientificB388-10https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID
Acido cirtrico · Kit di soluzioni H2OFisher ScientificS72836-3https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363
Deossinucleotide (dNTP) NewEngland BiolabsN0446SConservare a -20 ° C;  https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset
disodico EDTAFisher ScientificS311-500https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID
DNA pulito e Concentratore&commercio; -25 KitZymo ResearchD4007http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit
GelGreen Colorazione Acido NucleicoBiotium41005https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/
Spettrofotometro Genesys 10SUV-VISThermo Scientific840-208100https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100
Gentra Puregene Lievito/Bact. KitQiagen158567 https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation
HClFisher ScientificA144-212Corrosivo;   https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID
KClFisher ScientificP217-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID
KH< sub>2PO4Fisher ScientificP285-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID
KOHFisher ScientificP250-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID
Le LoopDecon Labs Inc.MP190-25http://deconlabs.com/products/leloop/
Le StabDecon Labs Inc.MP186-5http://deconlabs.com/products/lestab/
MgSO4· 7H2OFisher ScientificM63-500https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID
Mini-Sub Cell GT Sistema di elettroforesi orizzontaleBio Rad Labs1704406http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373
MR-VP BrodoDifco216300http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch
Na2HPO4Fisher ScientificS374-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID
NaClFisher ScientificS271-10https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID
NaHCO3Fisher ScientificS233-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID
NaNH4HPO4· 4H2OFisher Scientific
Spettroptometro https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID NanoDrop LiteThermo ScientificND-LITE-PRhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR
Latte scremato in polvereNestlé GarofanoN/AN/A
PeptoneBecto, Dickinson and Co.211677http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch
Piastre di Petri (100 mm x 15 mm)Fisher ScientificFB0875712https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712
Piastre di Petri (150 mm x 15 mm)Fisher ScientificFB0875714https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID
Sale solfato di polimixina BSigma-AldrichP1004-10MUConservare a 2-4 gradi C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en®ion=US
Taq DNA polimerasiNew England BiolabsM0273SNegozio a -20 gradi; C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
Taq Buffer di reazioneNew England BiolabsM0273SNegozio a -20 gradi; C;  https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
Termociclatore Bio-Rad C1000 Touch™  Bio Rad Labs1840148http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME
Cloruro di trifeniltetrazolioAlfa AesarA10870https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/
Tris BaseFisher ScientificBP152-1https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID
TriptoneBecto, Dickinson e Co.211705http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch
Estratto di lievitoBecto, Dickinson e Co.212750http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch
&alfa;-naftoloMP Biomedicals204189http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189

Riferimenti

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