Articolo metodologico

Creazione di un modello del roditore del Aneurysm aortico addominale bloccando Adventitial Vasa Vasorum perfusione

DOI:

10.3791/55763

⸱

8 novembre 2017

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1Department of Medical Physiology, Hamamatsu University School of Medicine, 2Division of Vascular Surgery, Second Department of Surgery, Hamamatsu University School of Medicine, 3Department of Applied Biological Chemistry, Graduate School of Agriculture, Kindai University, 4Department of Organ & Tissue Anatomy, Hamamatsu University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Inserimento del catetere in poliuretano nel lumen aortico e legatura del suturare dell'aorta indurre ipossia cronica dovuto il hypoperfusion del vasorum adventitial. Questo articolo descrive un nuovo modello animale di aneurysm aortico addominale (AAA) con caratteristiche simili a quelle di AAA in esseri umani.

Abstract

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Il vasorum adventitial (VV) fornisce ossigeno e nutrimento alla parete aortica. Ipossia nella parete aortica può causare aneurismi dell'aorta addominale allargati (AAAs). Questo articolo presenta e descrive un protocollo standard utilizzato per indurre AAAs attraverso adventitial VV ipoperfusione creato con una combinazione di inserimento del catetere in poliuretano nel lumen aortico e legatura del suturare dell'aorta addominale di infrarenal.

Il protocollo prevede l'utilizzo di ratti maschii pesano 300-400 g, che sono forniti di acqua e cibo ad libitum. Dopo la laparotomia con un'incisione addominale ventrale del midline, esfoliazione dell'aorta viene eseguita, che blocca il flusso di sangue dal tessuto perivascolare. Aortotomy che coinvolge una piccola incisione adiacente ai rami dell'arteria renale viene eseguita, e un catetere in poliuretano viene inserito utilizzando un ago di calibro 18 interiore. Dopo aver riparato l'incisione, stretta legatura della aorta sopra il catetere blocca il flusso di sangue VV dalla direzione prossimale attraverso la parete aortica senza disturbare il flusso sanguigno aortico. Questa tecnica può indurre un AAA con progressiva dilatazione aortica.

Il più grande vantaggio di questo modello è che VV ipoperfusione causa ipossia tissutale e lo sviluppo di un infrarenal AAA, che ha caratteristiche morfologiche e patologiche simili a quelle di un umano AAA.

Introduzione

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L'aorta addominale è composto dei seguenti tre strati: la parete vascolare interna (intima), strato mediale (media) e parete vascolare esterna (adventitia), e di questi, il adventitia ha un unico sangue alimentazione sistema noto come il vasorum (VV). Tessuto aortico è fornito con ossigeno attraverso adventitial VV perfusione e diffusione semplice dell'ossigeno dal flusso sanguigno aortico1. Tuttavia, geograficamente, l'aorta addominale ha la distribuzione almeno di VVs rispetto a quello in altre parti dell'aorta. 2

Uno studio precedente ha riferito su ipossia tissutale in umana di aneurysm aortico addominale pareti (AAA) con spessore intraluminal embolo (ILT)3. Inoltre, è stato dimostrato che un VV adventitial nelle pareti aneurismatiche è occluso con cambiamenti arteriosclerotici ad un tasso significativamente più alto, che è associata con ipossia tissutale in pareti AAA4. Basato su questi risultati, è stato creato un modello di roditore romanzo di AAA inducendo adventitial VV ipoperfusione5. In questo modello, VV ipoperfusione causato ipossia tissutale e lo sviluppo di un infrarenal AAA, che aveva caratteristiche morfologiche e patologiche simili a quelle di un AAA umano6. I principali esempi sono stati la presenza di ILTs e l'accumulo di adipociti hyperplastic6e il potenziale di causare rottura7,8. Questi risultati sono stati raramente osservati nei precedenti modelli del roditore. Di conseguenza, questo modello può contribuire notevolmente ad una più profonda comprensione del meccanismo responsabile della rottura e sviluppo di AAA. Introduciamo e descrivere un protocollo standard utilizzato per indurre AAAs attraverso adventitial VV ipoperfusione, e spieghiamo come indurre ipossia nella parete aortica utilizzando le tecniche chirurgiche.

Protocollo

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cura degli animali e gli esperimenti sono stati effettuati conformemente agli orientamenti di Hamamatsu University School di medicina animale cura Comitato presso il centro per la cura degli animali.

1. procedura chirurgica per la creazione del modello

Nota: inserire gli strumenti chirurgici in uno sterilizzatore perlina per 10 s preoperatively. Utilizzare guanti sterili intraoperatively.

  1. Ratti maschii di uso pesano 300-400 g. consentire i ratti accesso al cibo e acqua ad libitum.
  2. Anestetizzare il topo con inalazione isoflurane (2.0-3.0 mL/L). Confermare il corretto amputate di pizzico di punta.
  3. La barba capelli sull'addome con un rasoio elettrico e macchia l'addome con alcool e una soluzione povidone-iodio.
  4. Inserire il topo in posizione supina sul tavolo operatorio. Usare pomata veterinario il ratto ' gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
  5. Eseguire una laparotomia con un'incisione addominale ventrale del midline usando un paio di forbici. Per proteggere un campo chiaro chirurgico, imballare il contenuto addominale all'interno della cavità addominale con garza sterile utilizzando un riavvolgitore ferita.
  6. Per staccare l'aorta dal tessuto perivascolare, delicatamente pick up e strappare il retroperitoneum con le pinzette per esporre la parete aortica ed esfoliare l'aorta di infrarenal nello spazio retroperitoneal dal livello della vena renale sinistra alla biforcazione dalla tessuto perivascolare ( Figura 1A).
  7. Legano i vasi diramazione dall'aorta addominale con una stringa di seta 5-0 a sangue blocco di alimentazione in un punto lontano dell'aorta che non restringono il lume aortico.
  8. Per bloccare il flusso sanguigno aortico, inserire clip vascolari appena sotto l'arteria renale e appena sopra la biforcazione dell'aorta.
    Nota: La dimensione delle clip deve essere maggiore del diametro aortico di bloccare completamente il flusso di sangue. Un temporaneo legatura seta stringa 5-0 è anche sufficiente per il blocco del flusso sanguigno invece le clip.
  9. Simile alla creazione di un'emorragia di punti sulla superficie della parete aortica, tagliata la parete aortica anteriore utilizzando un micro-forbici 5 mm distalmente dalla clip aortica, adiacente ai rami dell'arteria renale, per inserire un catetere in poliuretano.
  10. Inserire un catetere in poliuretano (0.55 mm, diametro interno diametro esterno 0,37 mm) con un calibro 24 insito l'ago che digrada dolcemente attraverso l'incisione per lavare via il sangue nell'aorta con acqua. Amministrare una siringa 1 mL riempita con acqua nel catetere in poliuretano e lavare via il sangue rimanente nell'aorta con acqua. Dopo irrigazione, rimuovere il catetere dall'aorta.
  11. Prima di inserire un catetere in poliuretano (diametro esterno 1,20 mm, diametro interno mm 0,94) utilizzando un ago di calibro 18 interiore, tagliare il catetere in poliuretano a 10 mm di lunghezza ( Figura 1B).
    1. Inserire il taglio pezzo del catetere in poliuretano nel lume aortico dall'incisione effettuata nel passaggio 1,9. Completamente posizionare il catetere di 10 mm nel lume aortico e riposizionare il punto centrale del catetere alla posizione dell'incisione (cioè, coprire l'incisione con il catetere).
  12. Riparare l'incisione con i suturare interrotti utilizzando una stringa di 8-0 monofilamento ( Figura 1).
  13. Legare l'aorta addominale utilizzando una combinazione di 5-0 laccio in seta e il catetere in poliuretano ( Figura 1).
    Nota: Il lume aortico può essere mantenuto il catetere. Legare l'aorta saldamente per evitare disallineati la posizione del catetere. Il chirurgo ' nodo s è raccomandato, perché aggiunge un tocco in più quando legando il primo tiro del nodo, formando un doppio nodo semplice, e un turno aggiuntivo fornisce più attrito e può ridurre allentamento.
  14. Dopo la legatura, rimuovere la clip vascolare alla biforcazione aortica e quindi rimuovere la clip vascolare sotto l'arteria renale per ripristinare il flusso di sangue anterogrado. Confermare lordo pulsazione aortica.
  15. Chiudere l'incisione addominale in due strati, il peritoneo e altri strati, con una sutura in polipropilene 4-0. Strettamente suturare l'incisione per evitare un organo sporta.
  16. Applicare lidocaina topica l'incisione addominale. Posizionare il ratto su un rilievo di riscaldamento fino al ritorno di coscienza. Non lasciare incustodito un ratto fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Non restituiscono un ratto che ha subito l'operazione per la compagnia di altri ratti fino a quando non ha pienamente recuperato.
  17. Monitorare attentamente il ratto dopo l'operazione. Iniettare un bolo di soluzione salina sterile (1.0-2.0 mL) per via sottocutanea, se un ratto Mostra segni di perdita di peso di angoscia o corpo.
  18. Postoperatorio, osservare lo sviluppo di corso di tempo dell'aorta allargata su un ecogramma di ultrasuono. Misura il diametro massimo dall'interno del bordo al bordo esterno dell'aorta addominale come descritto 5.

2. Raccolta, fissaggio ed Elastica-van Gieson (EVG) colorazione

  1. ventotto giorni postoperatorio, amministrare sodio pentobarbital ≥ 100 mg/kg per via intraperitoneale per eutanasia ratti.
  2. Taglio aperto ratto ' cavità addominale s ventralmente. Effettuare l'incisione iniziale usando un bisturi. Raccogliere il aneurysm utilizzando forbici e posizionare le aorte raccolte in formalina 10% neutra tamponata per 24-48 h.
    Nota: Il chirurgo deve essere attento evitare lesioni dell'aorta ed altri organi quando esponendo l'aneurisma. Un organo addominale elevato dovrebbe essere osservato, che indica la formazione di AAA. la figura 2 Mostra un immagine in vivo ed ex vivo immagine; Questo campione rappresentativo di AAAs non è rotto.
  3. EVG macchiatura 9
    1. Soluzione preparazione
      1. preparare Verhoeff ' ematossilina s mescolando i seguenti nell'ordine indicato: ematossilina alcolica 20 mL, 10% di cloruro ferrico 8,0 mL, e Lugol ' iodio s 8 mL. Miscelare la soluzione tra ogni aggiunta. Questa soluzione può essere preparata fresco q.b..
      2. Preparare Van Gieson ' s soluzione mescolando Fucsina acida 1% 1 mL e satura di acido picrico 45 mL. Lasciare riposare per una notte e mescolare bene. Questa soluzione è stabile per 2 settimane.
      3. Preparare soluzione differenziante (2% di cloruro ferrico) mescolando 10% FeCl 3 10ml in 40 mL di acqua distillata. Questa soluzione può essere preparata fresco q.b..
      4. Preparare 5% IPO sciogliendo 5,0 g tiosolfato di sodio in 100 mL di acqua distillata. Questa soluzione è stabile per 1 anno.
    2. Procedura di macchiatura
      Nota: Vedi riferimento 9 per ulteriori dettagli.
      1. Brevemente, idratare le sezioni di paraffina fisso di aorte raccolte in acqua distillata per 10 min posto aorte in Verhoeff ' ematossilina di s per 25 min, lavare con acqua e dip 10 - 30 volte nella differenziazione soluzione (2% FeCl 3). Sciacquare in acqua. Posto a 5% IPO per 1 min. lavare in acqua. Posto in Van Gieson ' s soluzione per 5 min.
      2. Disidratare in alcool nel seguente ordine: alcool di 75%, 90%, 95%, 100% e 100% per 30 s ciascuno. Quindi deselezionare in xilene per 5 min, due volte. Posto su un vetrino coprioggetto con mezzo di montaggio resinoso.
        Nota: fibre elastiche appaiono blu-nero al nero; nuclei: blu di blaCK; collagene: rosso; e altri elementi del tessuto: giallo.

Risultati

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Le tecniche operative descritte creare un nuovo modello animale di un aneurysm aortico cronico di indotta da ipossia utilizzando una combinazione di inserzione del catetere in poliuretano e la sutura legatura dell'aorta addominale di infrarenal in ratti. I ratti descritti nella sezione protocollo sono stati eutanasizzati 28 giorni dopo la procedura. Le aorte sono state raccolte e imaging per visualizzare la formazione di aneurismi. La figura 2 Mostra lo sviluppo del AAA fusiforme. L'estremità superiore e inferiore dell'aorta in ex vivo hanno un diametro normale senza dilatazione. Diametri aortici sono stati misurati usando l'ecografia transaddominale (Figura 3). Il diametro generalmente raggiunge la dimensione massima a circa 14 giorni dopo la procedura; da allora in poi, esso rimane invariato o aumenta leggermente. La figura 4 Mostra l'immagine istopatologica del aneurysm diametro massimo dopo colorazione EVG. L'immagine del tessuto il giorno 28 (aneurisma) ha mostrato prominente degradazione delle fibre elastiche rispetto a quello il giorno 0.

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Figura 1: Procedure chirurgiche per indurre un aneurysm aortico addominale (AAA).
(A) l'aorta di infrarenal è espansa dal tessuto circostante. (B) un catetere in poliuretano 10 mm di lunghezza di taglio viene inserito attraverso una piccola incisione nell'aorta. (C) l'incisione è riparata con una sutura monofilamento di 8-0 e flusso sanguigno è ripristinato. (D) l'aorta è legato con una sutura in seta 5-0 sul catetere inserito. Barra della scala = 5 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Risultati rappresentativi postoperatori.
Vista macroscopico sullo sviluppo visualizzando giorno postoperatorio 28 dei aneurysms aortici addominali fusiforme. Il margine elevato del retroperitoneum corrisponde al bordo esterno del aneurysm (linee spezzate; sinistra). L'estremità superiore e inferiore dell'aorta in ex vivo sono normali (a destra). Barra della scala = 3 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Diametri di aortico massimo misurati usando l'ecografia transaddominale.
Il diametro aortico aumentato costantemente in questo modello di ratto. Diametro aortico è presentati come media ± deviazione standard (n = 12). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Immagini rappresentative del tessuto aneurismatico con Elastica van Gieson macchiatura.
Valutazione istologica con EVG macchiatura mostrando la lamina elastica degenerativa nei media e formazione di un trombo intraluminale 28 giorni dopo la procedura (a destra). Frammentazione di fibra elastica nei media aortici e della fibra collagene tipo sparse nel adventitia aortica sono osservati il giorno 28. Giorno 0 è prima della procedura (a sinistra). Barra della scala = 500 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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In condizioni fisiologiche, gli strati interni della parete aortica sono nutriti di diffusione dal flusso sanguigno luminal, mentre gli strati esterni e centrali sono alimentati da VV, che penetrano da adventitia mediale VV1. Flusso sanguigno VV nella parete aortica addominale può provenire dalle seguenti tre direzioni/aree: (1) la direzione prossimale attraverso la parete aortica, senso (2) distale attraverso la parete aortica e (3) perivascolare tessuti10. In precedenza, la nostra analisi istologica dei tessuti umani identificato significativa stenosi o l'occlusione di VV nel muro AAA, suggerendo che il flusso sanguigno VV nella parete aortica addominale può essere ridotto4. È un punto estremamente importante in questo protocollo che un infrarenal AAA è stato causato da una combinazione di inserzione del catetere in poliuretano e la sutura legatura dell'aorta addominale di infrarenal. Per attentamente esfoliare lo strato di tessuto, chirurghi devono inserire senza problemi un catetere in poliuretano in aorta e legare saldamente l'aorta per causare ipossia cronica dovuto il hypoperfusion del adventitial VV e formazione di aneurismi. Usando queste tecniche, di conseguenza il flusso sanguigno nella parete aortica è diminuito, e un ambiente ipossico locale è indotto. La riduzione del flusso di sangue e aneurisma indotta da ipossia formazione indica che il flusso sanguigno VV nella parete aortica addominale svolge un ruolo nella patogenesi della formazione di AAA.

In particolare, un modello di aneurysm aortico dovrà soddisfare le seguenti condizioni: un aumento di 1,5 volte il diametro vascolare rispetto al basale, degenerazione della tunica media e l'infiammazione della parete aortica. I più popolari modelli animali sono stati costruiti inducendo risposte infiammatorie, uso di sostanze, come ad esempio CaCl211, elastasi12e angiotensina II13. Questi modelli possono avere un'elevata riproducibilità e ovviamente il cambiamento patologico, e sono stati comunemente utilizzati in studi di ricerca. Nel nostro modello, abbiamo valutato il diametro aortico usando l'ecografia ogni 7 giorni da prima che la procedura è stata eseguita fino al 28 ° giorno dopo la procedura (Figura 3). Risultati hanno mostrato che il diametro aortico moderatamente aumentato sopra i 28 giorni, indicando che questo cambiamento di diametro è simile a quella nei precedenti modelli del roditore. Lordo osservazione della forma vascolare indicato una forma fusiforme liscia (Figura 2). Il giorno 28, abbiamo sacrificato i ratti ed abbiamo effettuato l'analisi istopatologica del tessuto aortico che è stato recuperato. Lo strappo e la scomparsa delle fibre elastiche e collagene della tunica media e avventizia sono stati osservati (Figura 4). Inoltre, le cellule infiammatorie, quali i macrofagi, erano presenti dal adventitia di tunica per la tunica media.

Attualmente, le opzioni di trattamento disponibili per AAAs sono limitate alla riparazione chirurgica e innesto stent di endovascular, con tassi di mortalità del 30-50% in pazienti con AAA rottura14. Tuttavia, nessun farmaco è stato approvato per uso clinico per il trattamento di AAAs. Non c'è dibattito che vi sono differenze nei risultati patologici tra esseri umani e affermati modelli animali utilizzati nella ricerca di AAA. Somiglianze nella patogenesi tra modelli animali AAA e AAA umano sono essenziali per lo sviluppo di trattamenti farmacologici. Per quanto riguarda l'efficacia dei modelli del roditore, il nostro modello di ratto sono morfologicamente simile agli esseri umani in termini di intraluminal embolo5 e adipogenesis8. Inoltre, circa il 20% dei ratti in questo studio ha avuto rottura AAA ed è morto entro 28 giorni dopo la procedura. Anche se la rottura di aneurysm aortico è l'evento più critico per questa malattia, la rottura è rara con modelli sperimentali consolidati di AAA, e il meccanismo non è stata ancora chiarito. Pertanto, questo modello è utile per la comprensione del meccanismo della dilatazione del diametro aortico e della rottura dell'aneurisma.

La creazione di questo modello è necessaria per alcune procedure chirurgiche. Di conseguenza, i ricercatori devono mettere in pratica la creazione di questo modello, che è una limitazione di questo modello. In futuro, vorremmo creare un modello del roditore in cui possiamo ridurre il flusso sanguigno da ispessimento gradualmente le pareti VV, conseguente spontanea di aneurysm aortico.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato da localizzativi per scientifico il Research (B) (20291958) per N.U.; Localizzativi per giovani scienziati (A) (25713024) in N.Z.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
rattoGiappone SLC. IncSlc:SD ratSprague– Soluzione di
iodio povidoneLibatape Pharmaceutical Co., Ltd.
5-0 corda di setaAkiyama Medical MFG. CO., LTDJIS No.1
clip vascolariNatsume Seisakusho Co., Ltd.C-42-S-2
(ago a permanenza calibro 24)MEDIKIT24GSupercath Z4VTM, catetere in poliuretano con ago a permanenza calibro 24
(ago a permanenza calibro 18)MEDIKIT18GSupercath Z3VTM, ago a permanenza calibro 18
corda monofilamento 8-0Sutura Ethiconc-42-S-2PROLENE Sutura in polipropilene, Riparare l'incisione con la sutura
Dawley ratTM 4987335 111457Catetere in poliuretano

Riferimenti

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