Un sistema integrato di attivare remotamente la trasduzione del segnale intracellulare di fotoattivazione Upconversion Nanoparticle-mediata della chinasi

Sommario

In questo protocollo, gabbia della proteina chinasi A (PKA), un bioeffector di trasduzione del segnale cellulare, era immobilizzata su una superficie di nanoparticelle, microiniettata nel cytosol e attivata da upconverted UV luce da irradiazione di vicino infrarosso (NIR), che inducono disintegrazione di fibra a valle dello stress nel citosol.

Abstract

Upconversion delle nanoparticelle (UCNP)-mediata fotoattivazione è un nuovo approccio in remoto il controllo bioeffectors con molto meno fototossicità e con più profonda penetrazione del tessuto. Tuttavia, la strumentazione esistente sul mercato non è facilmente compatibile con upconversion applicazione. Pertanto, modificando lo strumento disponibile in commercio è essenziale per questa ricerca. In questa carta, illustriamo prima le modifiche di un fluorimetro convenzionale e microscopio a fluorescenza per renderli compatibili per gli esperimenti di upconversion di fotone. Descriviamo quindi la sintesi di un vicino-infrarosso (NIR)-attivato in gabbia proteina chinasi A sola subunità catalitica (PKA) immobilizzati su un complesso UCNP. Parametri per microiniezione e NIR fotoattivazione procedure inoltre sono segnalati. Dopo il PKA-UCNP in gabbia è microiniettati in cellule del fibroblasto REF52, l'irradiazione di NIR, che è significativamente superiore all'irradiazione UV convenzionale, attiva in modo efficiente la via di trasduzione del segnale PKA in cellule viventi. Inoltre, esperimenti di controllo positivi e negativi confermano che la via di PKA-indotta che conduce alla disintegrazione delle fibre di stress specificamente è innescata da irradiazione di NIR. Così, l'uso di UCNP proteina-modificato fornisce un approccio innovativo per il controllo remoto esperimenti cellulari luce modulata, in cui l'esposizione diretta ai raggi UV deve essere evitato.

Introduzione

Proteine chimicamente modificati che possono essere fotoattivazione (ad es., proteine PKA in gabbia) sono state sviluppate come campo emergente in biologia chimica non invadente manipolare i processi biochimici intercellulari^{1,2 ,3}. Utilizzando la luce come uno stimolo fornisce un'eccellente risoluzione spazio-temporale durante l'attivazione di questi ingabbiati proteine. Tuttavia, la luce UV può causare indesiderati cambiamenti morfologici, apoptosi e danno del DNA in cellule^4,5. Quindi, recenti sviluppi nella progettazione dei gruppi di photocaging di concentrano sull'attivazione photocleavage lunghezza d'onda o due-fotone eccitazione per ridurre fototossicità, nonché per aumentare la penetrazione dei tessuti profondi^6,7. Attivare gruppi di ingabbiamento che rispondono alla lunghezza d'onda maggiore, permettendoci di scegliere adatto uncaging lunghezze d'onda (cioè, canali) a selettivamente bioeffectors quando due o più gruppi di ingabbiamento sono presenti⁷. Date queste caratteristiche utili, lo sviluppo di nuovi gruppi di luci rosse photocaging è un lavoro molto importante a Monte in fotochimiche metodologie per gli studi biologici che vanno da sondare i meccanismi delle reazioni al controllo di attività cellulari⁸. Tuttavia, un gruppo di ingabbiamento del due-fotone è normalmente troppo idrofobico a causa della struttura fusa anello aromatico, e un gruppo di ingabbiamento di luce visibile è normalmente organometallico, con ligandi aromatici. Questa proprietà idrofobe/aromatico non è adatta quando la bioeffector è una proteina o un enzima, che denatura il sito di attivazione della proteina/enzima e causa la perdita di funzione, anche se la coniugazione e la fotolisi continuano a funzionare a livello chimico^{2 ,9}.

UCNPs sono efficaci trasduttori che convertono la luce di eccitazione di NIR a UV. Questa proprietà unica e affascinante di UCNPs ha offerto risoluzioni realistici per affrontare le sfide associate fotoattivazione e attivato il rilascio controllato di piccole molecole, tra cui l'acido folico¹⁰, cisplatino derivati¹¹ , DNA/siRNA¹², copolimero vescicole¹³e particelle cava¹⁴. Tuttavia, al meglio della nostra conoscenza, il UCNP-assistita fotoattivazione di enzimi o proteine è non stato testato finora. Perché non esiste nessun caso di successo dell'utilizzo di luce rossa o NIR per fotoattivi un enzima, ci hanno richiesto di eseguire l'attivazione di un costrutto di proteine/enzimi composto da complessi di chimicamente modificati degli enzimi in gabbia con un silice rivestite, NIR-innescato drogato con lantanidi UCNP¹⁵. In questo studio, il UCNP è stato coniugato con una reazione rapida chinasi di trasduzione di segnale sotto forma di PKA in gabbia. PKA controlla la sintesi del glicogeno e regolazione del citoscheletro che risponde agli stimoli esterni tramite regolamento di fosfato (accampamento) adenosina ciclica nel cytosol¹⁶. Abbiamo studiato la fattibilità di attivazione enzimatica in maniere temporale e spaziale in un esperimento cellulare dopo irradiazione di NIR. Questa piattaforma di fotoattivazione assistita da UCNP è una nuova metodologia per photoactivate un enzima utilizzando NIR ed evita la risposta di trasduzione del segnale indesiderato dalle cellule causata da convenzionale UV irradiazione^2,4.

È molto difficile traslocano nel grande bioeffectors (ad es., proteine) attraverso la membrana cellulare per controllare l'attività cellulare. Sebbene immobilizzata particella proteina potrebbe essere più semplice traslocano tramite endocitosi nel cytosol, endocitosi possono essere danneggiati o deteriorati via endosomal allettamento e il conseguente degradazione lisosomiale^2,4. Anche se la proteina in gabbia è ancora funzionante dopo traslocazione di membrana, gli importi spostati potrebbero non essere sufficiente a innescare la risposta cellulare^2,17. In netto contrasto, microiniezione è un approccio diretto e quantitativo per offrire grande bioeffectors nel citoplasma della cellula. Inoltre, bioeffector UCNP-immobilizzata richiede luce upconverted da attivare. Pertanto, la strumentazione ottica richiede ulteriori modifiche per misurare, visualizzare e utilizzare la luce upconversion. In questo lavoro, la consegna di un complesso di PKA-UCNP in gabbia per una cella mediante microiniezione e le seguenti modifiche essenziali di spettroscopia e microscopia per NIR fotoattivazione descriveremo in dettaglio.

Protocollo

Nota: il protocollo descrive una modifica di strumentazione dettagliata per fotoattivazione assistita upconversion, una procedura sintetica per generare in gabbia PKA-UCNP, microscopia elettronica di trasmissione (TEM) della UCNP rivestite con silice e in gabbia PKA-UCNP esempi, installazione di fotolisi UV e NIR, preparazione delle cellule, microiniezione di PKA-UCNP, uno studio di fotoattivazione e la colorazione della fibra lo stress delle cellule di REF52.

1. Setup fluorimetro per Upconversion spettro misura

1. installare un 4 X obiettivo obiettivo accanto al titolare del cuvetta dello spettrometro di fluorescenza in modo che il laser è focalizzato sulla metà della cuvetta.
2. Inserire un diodo laser sintonizzabile di 980 nm 0,5 - 8 W 90° contro la lente obiettiva.
   Attenzione: L'operatore deve avere conoscenza di sicurezza laser e indossare occhiali laser NIR.
3. Installare uno specchio completo riflettanza nell'intersezione percorso della luce di laser e la lente dell'obiettivo. Collocare una lastra di metallo anodizzata nero per bloccare la finestra di eccitazione di spettroscopia e per proteggere le parti interne.
4. Disponga la provetta della soluzione UCNP rivestite con silice (0,2 - 0,6 mg/mL) nel supporto per cuvette affinché un fascio luminoso upconversion può essere visualizzato e può essere utilizzato per regolare l'allineamento di luce migliore per installazione specchio.
5. Passare la spettroscopia alla modalità di luminescenza con impostazione di tensione minima PMT (regolare ad un livello superiore, se il segnale è troppo debole). Regolare lo specchietto per l'allineamento migliore, dove il fascio è al centro della provetta e la PMT preleva il segnale più forte.
6. Misurare lo spettro di upconversion, dopo l'allineamento, con l'impostazione desiderata. Utilizzare un misuratore di potenza termica mucchio per costruire una curva di calibrazione della potenza del laser contro la lettura corrente elettrica sull'alimentazione elettrica del laser. Controllare costantemente le prestazioni del laser per assicurarsi che le prestazioni sono all'interno della gamma calibrata.

2. Installazione di microscopio

Nota: l'impostazione seguente funziona per microscopi dotate del percorso ottico a due livelli. Qualora l'utente intenda installare un interruttore di sorgente luminosa di eccitazione nella porta posteriore per rendere il laser NIR e la lampada di alogenuro di condividere la stessa porta, il collimatore in porta posteriore significativamente bloccherà il NIR perché è progettato per ridurre il riscaldamento del campione. L'utente deve fare una scelta difficile: mantenere il collimatore e soffrono di efficienza molto bassa upconversion, o rimuovere il collimatore e sacrificare l'intensità della luce per l'epifluorescenza eccitazione.

Nota: un diagramma di cutaway Mostra lo schema di percorso della luce per una spettrofluorimetro modificata, la microscopia per upconversion luminescenza e modalità di fotolisi NIR e per epifluorescenza e modalità di fotolisi UV e la messa a punto sperimentale usato per questo esperimento sono illustrati nella Figura 2.

Guida

1. dotare il microscopio a fluorescenza con un luce ad alogenuri metallici, diretto nella parte posteriore porta.
   Nota: In questo percorso di luce di livello superiore dove c'è una torretta di cubo, un cubo posizione deve essere vuota per consentire NIR provenienti dal percorso della luce. livello inferiore
2. Installare un diodo laser nm di 980 W 0.5 a 8.0 sintonizzabile nella porta destra, con il collimatore di porta laterale aperta.
   Nota: Questo allarga il laser luce spot per circa 500 µm di diametro, quando viene utilizzato un obiettivo obiettivo 10x. Rimuovendo questo collimatore si traduce in una macchia luminosa di gamma di micrometro e rende impraticabile l'irradiazione delle cellule NIR. Questo collimatore è NIR-trasparente.
3. Installare uno specchio dicroico (passaggio breve 850 nm) e un filtro di eccitazione (950 nm long-pass) nel percorso della basso-livello luce.
4. Utilizzare una soluzione UCNP per visualizzare il punto luce NIR. Regolare la posizione del laser per centrare il fascio di luce NIR nel campo visivo per completare l'allineamento.

3. Preparazione e caratterizzazione di PKA-UCNP in gabbia costruire

1. Incubare ricombinante PKA (9 µM) con 0,5 mM 2-nitrobenzylbromide (NBB) in ingabbiamento buffer (20 mM Tris-HCl, NaCl 100 mM e 10 mM MgCl ₂; pH 8,5) per 1-2 h a 25 ° C. Quench La NBB in eccesso con 10 mM dthiothreitol (DTT) e poi Dializzare contro 4-(2-idrossietil) tampone acido piperazina-1-etansolfonico (HEPES) (10 mM, pH 7.5) per rimuovere i reagenti in eccesso e sali.
   Nota: Il pH della soluzione messa in gabbia è abbassato da 8,5 a 7.5 durante la dialisi con pH HEPES 7.5 per la reazione successiva immobilizzazione.
2. Mix i lantanidi sali-Y(CH₃CO₂) ₃ idrato (99,9%, 0,4527 g, 1,38 mmol), Yb (CH ₃ CO ₂) ₃ idrato (99,9%, 0,2533 g, 0.60 mmol) e Tm (CH ₃ CO ₂) ₃ idrato (99,9%, 0,0168 g, 0.02 mmol)-in octadecene (30 mL) e l'acido oleico (12 mL), scaldare la miscela a 115 ° C per 30 min e li raffreddare a 50 ° C. Successivamente, sciogliere la miscela di reazione in una soluzione metanolica (20 mL) con 0,2 g (5,0 mmol) di NaOH pellet e 0,2964 g (8 mmol) di fluoruro di ammonio di sonicazione per 15 min. di aumentare la temperatura di reazione a 300 ° C per ottenere il nucleo UCNP (β-Sorbetto_limone ₄ : 1.0% Tm ^{3 +} / 30% Yb ^{3 +}) nanoparticelle.
3. Sciogliere le nanoparticelle core (25 mg) con CO-520 (0,5 mL) in cicloesano (10 mL). Aggiungere ammoniaca (wt 30% v/v, 0,08 mL) e tetraethylorthosilicate (TEOS, 0,04 mL) e applicare sotto costante agitazione per 12 h a temperatura ambiente per ottenere il rivestite con silice β-Sorbetto_limone ₄: 1.0%Tm ^{3 +} /30%Yb ^{3 +} nanoparticelle core.
4. Incubare la PKA (6 nmol) o in gabbia PKA (6 nmol) con UCNP (1 mg) ¹⁵ in tampone HEPES (10 mM, pH 7.5) a 4 ° C per 3 h immobilizzare la PKA su rivestite con silice UCNP tramite interazioni elettrostatiche.
5. Filtrare la miscela utilizzando filtro PVDF (0,45 µm), centrifuga a 17.000 x g per 10 min a 4 ° C e redisperse il pellet in HEPES (50 µ l, 10 mM, pH 7.5) contenente 0,1% proteina stabilizzante per ottenere il complesso di PKA-UCNP purificato. Centrifugare a 17.000 x g per 10 min a 4 ° C e raccogliere il surnatante per un'analisi di Bradford in una provetta da 1,5 mL.
6. Analizzare la PKA illimitata nel surnatante salvati dal passaggio 3.5 con un'analisi di Bradford per retro-calcolare il livello di sostituzione di PKA sulle particelle UCNP, che normalmente hanno un livello di sostituzione di ~ 4,5 nmol di PKA per mg di particella.
   Nota: L'analisi di Bradford rivela un forte colore blu il pellet, che suggerisce un'immobilizzazione ad alta percentuale proteica piana e stabile senza desorbimento, mentre in gabbia il surnatante di PKA-UCNP soluzione Mostra un colore simile al (tampone HEPES Figura 4 c-4e).

4. Caratterizzazione

Nota: l'analisi della chinasi è utilizzata per quantificare l'attività specifica della chinasi del piruvato. In breve, la fosforilazione del peptide, che è accoppiato alla chinasi del piruvato e del lattato deidrogenasi, provoca l'ossidazione del NADH. Formazione di quest'ultimo viene monitorata misurando la diminuzione di assorbanza del NADH a 340 nm.

1. Determinare l'attività della PKA e PKA-UCNP in un volume totale di 60 µ l di miscela di analisi contenente acido 4-morpholinepropanesulfonic (MOPS, 100 mM, pH 7.5), KCl (100 mM), fosfoenolpiruvato (PEP, 1mm), trifosfato di adenosina (trifosfato di adenosina, 1mm), β - nicotinammide adenina dinucleotide, ridotto forma (NADH, 0,8 mM), cloruro di magnesio (MgCl ₂, 1mm), kemptide (0,4 mM) e una miscela di piruvato chinasi/lattato deidrogenasi (30/40 unità di PK/LDH).
2. Misurare la diminuzione di assorbanza del NADH nel tempo dopo l'aggiunta della soluzione PKA (2 µ l) per la miscela di analisi. Calcolare la pendenza della linea per riflettere direttamente l'attività della chinasi misurate.
3. Misurare l'attività della PKA-UCNP ¹⁵ e l'attività complessiva, che dovrebbe essere ben abbinato con il prodotto della moltiplicazione del nativo PKA-specifici di attività e l'importo calcolato di superficie-rivestito di PKA.

5. Installazione di fotolisi

1. MeasUre tutta la potenza della luce fonti utilizzando un sensore termico mucchio e calcolare la densità di potenza (PD = potenza (W) / Area (cm ²)) ¹⁸ basato sulla zona spot luce.
2. Eseguire in vitro UV fotolisi esperimenti su un sistema commerciale con un LED (200 mW/cm ²) di 365 nm ¹⁵.
3. UV per fotoattivazione sulla fase di microscopio, illuminare la soluzione di PKA-UCNP con la luce di eccitazione filtrato da un commerciale cubo ¹⁵.
   Nota: La densità di potenza è ~ 15 mW/cm ², senza messa a fuoco dell'obiettivo.
4. Per in vitro NIR fotoattivazione sulla fase di microscopio, illuminare la soluzione di PKA-UCNP utilizzando un laser a 980 nm con le impostazioni di filtro/specchio upconversion personalizzato installate nel percorso della luce di livello inferiore, uno specchio dicroico (850 nm breve-pass), e un filtro di eccitazione (950 nm long-pass).
   Nota: La densità di potenza di uscita è 5 W/cm ² prima messa a fuoco dell'obiettivo 4 X. La densità di potenza è stimato pari a ~ 68 W/cm ² dopo 4 X messa a fuoco dell'obiettivo.

6. Preparazione del campione e microiniezione di PKA-UCNP complessi delle cellule

1. pre-filtro i campioni attraverso un filtro da 0,45 µm dopo immobilizzazione PKA (punto 3.5).
2. Incubare le cellule nel 10% siero bovino fetale (FBS) che contiene il L-15 media durante il periodo di microiniezione per controllo pH stabile all'esterno dell'incubatrice.
   Nota: per confermare il completamento di microiniezione, co-iniettare il nativo PKA-UCNP, PKA-UCNP in gabbia o PEGylated UCNP (7,5 mg/mL) ¹⁵ con 5 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) (10 µM) in cellule.
3. Regolare la concentrazione delle particelle PKA-UCNP tale che, dopo la microiniezione, la concentrazione citosolica è 1-3 μM PKA - una gamma di concentrazione fisiologica per PKA in una cella, con il presupposto che il volume di iniezione è 1/10 del volume cellulare .
4. Eseguire la microiniezione nelle cellule (punto 6.2) utilizzando un dispositivo di microinjector accoppiato con un micromanipolatore idraulico di un asse ( Figura 3).
5. Utilizzare un manometro digitale per monitorare la pressione esercitata dalla microinjector è nel campo di funzionamento (~ 50-200 hPa) e sigillare la valvola dell'erogatore in una camera di pressurizzazione su misura per fornire pressione di compensazione per il microinjection. Tirare indietro l'ago con l'estrattore.
6. Mantenere la pressione di iniezione tra 50 e 75 hPa, con un tempo di iniezione di 200-300 ms e la pressione di compensazione alle 15 hPa per impedire il riflusso del mezzo di coltura nell'ago per capillarità.
7. Esaminare le aperture di punta degli aghi per garantire che essi hanno un diametro esterno compreso tra 1,3 e 1,5 µm, che può essere confermato prendendo immagini utilizzando un obiettivo 40x.
8. Lavare le cellule con 2 mL di mezzo di L-15 contenente 10% FBS dopo la microiniezione. Osservare l'imaging di fluorescenza cellulare da 5 (6) - carboxytetramethyl - rodamina (TAMRA) per confermare il completamento di microiniezione.

7. Fotoattivazione di Caged PKA-UCNP usando UV o luce NIR in cellule viventi

1. UV per fotoattivazione dopo la microiniezione di PKA-UCNP, crescere le cellule REF52 su un piatto da 3,5 µm, metterli sul tavolino del microscopio e li irradiare con luce UV filtrata per il cubo per 3 min senza messa a fuoco dell'obiettivo.
   Nota: REF52 le cellule sono state mantenute in DMEM contenente 10% FBS a 37 ° C in un incubatore a CO ₂ 5% e le cellule sono state subcoltivate quando il confluency raggiunto al 90% ogni 2-3 giorni.
2. Per NIR fotoattivazione dopo microiniezione PKA-UCNP, illuminare le cellule su un laser a 980 nm da impostazioni di livello inferiore filtro/specchio, come descritto al punto 5.4.
   Nota: L'uscita di densità di potenza è 5 W/cm ² prima 10 X messa a fuoco dell'obiettivo ed è stimata in 300 W/cm ² dopo 10 x messa a fuoco dell'obiettivo. Upconversion è un processo che richiede una densità di fotoni ad alta, soprattutto quando è necessario un cambiamento di anti-Stoke più grande. Quindi, messa a fuoco è necessaria durante la fotoattivazione.
3. Quando è necessario un più grande luce spot (650 µm x 520 µm), irradiare queste cellule con NIR focalizzato da una lente dell'obiettivo 10x con un collimatore per 15 min. Consenti per un intervallo di 5 min scuro dopo irradiazione ogni 5 min per evitare riscaldamento.
   Nota: Quando un'alta risoluzione spaziale (punto luminoso subcellulare) è necessario utilizzare la lente dell'obiettivo X 40 con un foro stenopeico installato all'estremità di uscita della luce guida per generare un punto luminoso subcellulare-dimensione (5 µm x 4 µm). In questo caso, 1 s di irradiazione è abbastanza per fotoattivazione NIR grazie all'elevato flusso di fotoni.
4. Fotolisi UV dopo o NIR, permettono alle cellule di recuperare in un 5% CO ₂ incubatore a 37 ° C per 1 h in terreno completo per generare risposte cellulari. Successivamente, correggerli in 1 mL di 4% paraformaldeide /-soluzione tampone fosfato salino (PBS) per 20 min prima della ulteriore colorazione.
   Attenzione: Paraformaldeide è altamente tossico; evitare il contatto con pelle, occhi o mucose. Evitare di inalare la polvere durante la misurazione e la preparazione.

8. Visualizzazione di disintegrazione di fibra lo Stress causato da NIR fotoattivazione

1. dopo la fissazione, utilizzare Alexa 594-falloidina (aggiungere 5 µ l di soluzione madre di 6,6 µM a 200 µ l di PBS per la macchiatura; Incubare per 25 min a temperatura ambiente) a macchiare e visualizzare le fibre di stress. Visualizzare le immagini di Alexa 594-falloidina (Ex 581 nm/Em 609 nm) utilizzando un set di filtri.
2. Incubare le cellule per 5 min in 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) a temperatura ambiente. Dopo la colorazione, lavare i campioni con PBS e prendere separatamente immagini fluorescenti delle fibre di sforzo e nuclei.

Risultati

Il design del costrutto in gabbia enzima-UCNP è illustrato nella Figura 1. L'enzima PKA in primo luogo è stato reagito con il bromuro di 2-nitrobenzyl per generare un'inattiva della PKA in gabbia, e si era quindi elettrostaticamente immobilizzato sulla superficie del UCNP. UCNPs emettono la luce di upconverted e di conseguenza photolytically fendere i gruppi o-nitrobenzyl su 199 Cys e Cys 343, generando la PKA attivata. Immagini TEM e analisi di Bradford ha c...

Discussione

In precedenza, Hofmann e colleghe trovano che drammatici cambiamenti morfologici sono stati osservati in cellule REF52 dopo la microiniezione del libero PKA¹⁹. In un altro studio, il gruppo di Lawrence ha dimostrato che la PKA in gabbia può essere attivata in vivo, portando a cambiamenti morfologici e la disintegrazione delle fibre di stress quando sottoposti a fotolisi UV²⁰. Precedenti rapporti sullo sfruttamento upconverted UV luce per fotoattivazione ha mostrato...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagente
Tris(idrossimetil)amminometano	Sigma	154563
Cloruro di magnesio esaidrato	Sigma	M9272
MOPS	Sigma	M1254
HEPES	Sigma	H4034
Cloruro di sodio	Sigma	31434
Cloruro di potassio	Sigma	12636
Acetato di ittrio idrato	Sigma	326046	Y(C2H3CO2)3 · xH2O
Tulium(III) acetato idrato	Alfa Aesar	14582	Tm(CH3CO2)3 · xH2O Acetato
itterbio(III) tetraidrato	Sigma	326011	Yb(C2H3O2)3 · 4H2O
1-Octadecene	Sigma	O806
Acido oleico	Sigma	364525
Metanolo	macron	304168
Idrossido di sodio	Sigma	30620
Fluoruro di ammonio	J.T.Baker	69804
IGEPAL  CO-520	Sigma	238643
Cicloesano	J.T.Baker	920601
Idrossido di ammonio (28% - 30%)	J.T.Baker	972101	Ammoniaca
Ortosilicato tetraetile (TEOS)	Sigma	8658
DL-Ditiotreitolo (DTT)	Sigma	D0632
N-idrossimaleimmide (NHM)	Sigma	226351	PKA reagente bloccante l'attività
Soluzione stabilizzante proteica Prionex da collagene di maiale	Sigma	81662	Soluzione stabilizzante proteica
2-nitrobenzil bromuro (NBB)	Sigma	107794	PKA reagente per gabbia
8-(4-clorofeniltio)adenosina 3′,5′-monofosfato ciclico sale sodico	Sigma	C3912	8-CPT-cAMP
piruvato chinasi/deidrogenasi lattica enzimi dal muscolo di coniglio	Sigma	P0294	PK/LDH
Adenosina 5'-trifosfato disodico	Sigma	A2387	ATP
β-NADH ridotto da dipotassio	Sigma	N4505
Fosfoenolpiruvato	Sigma	P7127
PEP Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL	Thermo Scientific	23200	Bradford assay reagente
proteina chinasi cAMP-dipendente	Promega	V5161	Controllo dell'attività PKA
pET15b-PKACAT plasmide	Addgene	#14921
pKaede-MC1 plasmide	CoralHue	AM-V0012
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7.4	Thermo Scientific	10010023
DMEM, glucosio alto, piruvato	Gibco	12800-017	Cell terreno di coltura
Leibovitz L-15 Medium	Biological Industries	01-115-1A	Terreno di coltura cellulare
Fetale Siero bovino fetale	Biological Industries	04-001-1A
Paraformaldeide	ACROS	416785000
DAPI	Invitrogen	D1306	Colorante per colorazione del nucleo
Alexa 594-falloidina	Invitrogen	A12381	Colorante per colorazione F-actina
5(6)-Carbossitetrametilrodammina	Novabiochem	8.51030.9999
Kit per il dosaggio delle proteine Pierce Coomassie (Bradford)	Thermo Scientific	23200
CelluSep T4 Tubi/Valore nominale del filtro MWCO 12.000 - 14.000 Da	Membrane Filtration Products, Inc.	1430-33	Membrana per dialisi
Millex-HV Unità filtro per siringa, 0,45 &; micro; m, PVDF, 13 mm, sterilizzato a raggi gamma	EMD Milipore	SLHVX13NL
Equipment
Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS	Malvern	M104
Microscopio elettronico a trasmissione	JEOL	JEM-1400
Spettrofotometro a fluorescenza	Agilent Technologies	10075200	Cary Eclipse
Spettrofotometro UV-Vis	Agilent Technologies	10068900	Cary 50
Microscopio a fluorescenza	Olympus	IX-71
950 nm filtro passa-lungo	Thorlabs	FEL0950
850 nm specchio dicroico passa-corto	Chroma	NC265609
RT3 sistema CCD a colori	SPOT	RT2520
Illuminazione a fluorescenza	PRIOR	Lumen 200
980 nm Laser a diodi infrarossi	CNI	MDL-N-980-8W
UV LED Sorgente luminosa	spot UVATA UVATA-UPS412		Con un LED UPH-056-365 nm a 200 mW/cm2
Sensore termico a pila	OPHIR	12A-V1-ROHS
Picospritzer III	Parker Hannifin	052-0500-900	Sistemi di dispensazione per microiniezione intracellulare
PC-10 Estrattore per aghi	Narishige	PC-10
MANOMETRO Manometro digitale	Lutron	PM-9100
Monoasse Centrifuga oleodinamica	Narishige	MMO-220A
Heraeus Fresco 17, refrigerata	Thermo Scientific	75002421