Articolo metodologico

Analisi dei Macrofagi Microglia e dei Monociti dal Sistema Nervoso Centrale dalla Citometria del Flusso

DOI:

10.3791/55781

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22 giugno 2017

 ,  ,  , 
1Inserm U 1227, CNRS UMR 7225, 2Sorbonne Universités, UPMC, University of Paris, 3Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, 4AP-HP, Hôpital de la Pitié Salpêtrière;

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo fornisce un'analisi delle subpopulazioni del macrofage nel sistema nervoso centrale del mouse adulto mediante citometria a flusso ed è utile per lo studio di marcatori multipli espressi da queste cellule.

Abstract

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Numerosi studi hanno dimostrato il ruolo delle cellule immunitarie, in particolare dei macrofagi, nelle patologie del sistema nervoso centrale (CNS). Esistono due principali popolazioni di macrofagi nel CNS: (i) la microglia, che sono i macrofagi residenti del CNS e sono derivate da progenitori di sacchi di tuorlo durante l'embriogenesi e (ii) i macrofagi derivanti da monociti (MDM), che possono infiltrarsi Il CNS durante la malattia e sono derivate da progenitori del midollo osseo. I ruoli di ciascuna sottopopolazione dei macrofagi variano a seconda della patologia studiata. Inoltre, non esiste un consenso sui marcatori istologici o sui criteri distintivi utilizzati per queste sottopopolazioni macrofagi. Tuttavia, l'analisi dei profili di espressione dei marker CD11b e CD45 mediante citometria a flusso ci consente di distinguere la microglia (CD11b + CD45 med ) dall' MDM (CD11b + CD45 alta ). In questo protocollo mostriamo che la centrifugazione di gradiente di densitàE l'analisi della citometria a flusso può essere utilizzata per caratterizzare queste subpopulazioni del macrofago del CNS e per studiare diversi marcatori di interesse espressi da queste cellule come abbiamo recentemente pubblicato. Così, questa tecnica può ulteriormente comprendere il ruolo dei macrofagi nei modelli di topi di malattie neurologiche e può anche essere usato per valutare gli effetti della droga su queste cellule.

Introduzione

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La microglia sono i macrofagi del tissue-residuo parenchimale del sistema nervoso centrale (CNS). Essi svolgono due ruoli funzionali chiave: difesa immunitaria e mantenimento dell'omeostasi CNS. In contrasto con l'MDM, che vengono continuamente rinnovate dalle cellule staminali ematopoietiche nel midollo osseo, le cellule microgliali si differenziano dalle cellule progenitrici primitive ematopoietiche originate dal sacco di tuorlo (YS) che colonizzarono il cervello durante lo sviluppo embrionale 1 , 2 , 3 . Nei roditori il fattore di trascrizione Myb svolge un ruolo ....

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Protocollo

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Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Istituto ICM e dal Comitato per gli animali etnici di Darwin, e sono trattati con il protocollo 01407.02.

1. Preparazione

  1. Preparare il cocktail di digestione in un tubo da 1,5 ml combinando le seguenti forme per ogni topo: 1 mL di fosfato bucidato salina (PBS); 123 μL di enzima di digestione (vedere tabella dei materiali) a 13 wunsch / mL (soluzione di riserva), concentrazione finale 1,6 wunsch / mL; E 5 μL DNasi I (vedere tabella dei materiali) a 100 mg / ml (soluzione di scorta), concentrazione final....

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Risultati

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Dopo la centrifugazione di gradiente di densità e la colorazione degli anticorpi, le cellule sono state acquisite su un citometro di flusso e analizzate utilizzando una strategia di gating morfologica come segue. Un primo cancello è stato definito nella zona di puntamento di Forward-Spattered-Area (FSC-A) rispetto alla Forward-Spattered-Height (FSC-H) per discriminare singole celle da dublets ( Figura 3A ). Le singole cellule sono state quindi gated.......

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Discussione

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È stato dimostrato che la microglia e l'MDM hanno funzioni e fenotipi diversi nel CNS e quindi l'identificazione e l'analisi di queste subpopulazioni macrofagi sono essenziali per meglio capire le malattie neurologiche 9 , 18 , 25 . L'analisi della citometria a flusso utilizzando due marcatori (CD11b e CD45) consente la distinzione tra ciascuna sottopopolazione ( Figura 3C ). Questa.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Agenzia Nazionale per la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), l'Associazione Francia Alzheimer e Bpifrance. Il nostro laboratorio è anche supportato da Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie Curie e il programma "Investigations d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Vorremmo ringraziare l'assistenza della centrale CELIS per la coltura delle cellule.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Topi di 5 mesiJanvierC57BL/6J
Liberase TL Research GradeSigma-Aldrich5401020001Enzima di digestione
Deossiribonucleasi I dal pancreas bovinoSigma-AldrichDN25
PercollGE Healthcare Life Sciences17-0891-01Gradiente di densità medio
Filtro cellulare dimensione 70 &; m NylonCorning731751
Venofix 25 GBRAUN4056370
Siringa a pistone 10 mLTerumoSS+10ES1
Pipetta Pasteur 230 mmDustcher20420
Provetta da 1,5 mLEppendorf0030 123.328
Provetta da 15 mLTPP91015
Provetta da 50 mLTPP91050
5 mL tubo fondo tondo in polistireneBD Falcon352054
D-PBS (1x) senza Ca2+/Mg2+Thermo Fisher Scientific14190-094
D-PBS (10x) senza Ca2+/Mg2+Thermo Fisher Scientific14200-067
Siero fetale bovinoThermo Fisher Scientific10270-106
EDTASigma-AldrichE4884
Siero bovino Soluzione di albumina 30%Sigma-AldrichA7284
Paraformaldeide 32% Soluzionedi microscopia elettronicaScienze 15714-SAttenzione -Saponina tossica
Sigma-AldrichS2002
Azide di sodioSigma-Aldrich47036
PerCPCy5.5 Anti-topo di ratto CD11b (clone M1/70)eBioscience45-0112
Controllo dell'isotipo K IgG2b di ratto PerCP-Cianina5.5eBioscience45-4031
BV421 Anti-topo di ratto CD45 (clone 30-F11)BD Biosciences563890
BV421 IgG2b di ratto, κ Controllo isotipo RUOBD Biosciences562603
Coniglio anti-topo TMEM119 (clone28 - 3)Abcamab209064
AlexaFluor 647 Asino anti-coniglio IgGLife TechnologiesA31573
Anti-topo CD16/CD32 PurificatoeBioscience14-0161Mouse Fc Block
Kit di colorazione di cellule morte riparabiliInvitrogenL34969
Anticorpo coniugato APC CCR2 di topoR& DFAB5538A
R& controllo isotipo coniugato APC IgG2B di ratto DIC013A
Anticorpo coniugato PE di topo CX3CR1R& DFAB5825P
IgG di capra PE-coniugato AnticorpoR& DIC108P
CentrifugaEppendorf5804R
Analizzatore cellulareBD BiosciencesBD FACSVERSE
Software di analisi datiFlowJo LLCFlowJo
Forbici finiF.S.T14090-11
Forcipe modello standardF.S.T11000-13
Forbici MayoF.S.T14010-15
Dumont #5 PinzeF.S.T11251-20

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. Origin and differentiation of microglia. Front Cell Neurosci. 7

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Macrofagi della microgliamacrofagi del SNCcentrifugazione in gradiente di densitmarcatori CD11b CD45isolamento cellulareanalisi mediante citometria a flussocellule immunitarie del SNCespressione dei marcatori

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