Articolo metodologico
* These authors contributed equally
Le cellule stromali del midollo (MSC) con potenziale neurale esistono all'interno del midollo osseo. Il nostro protocollo arricchisce questa popolazione di cellule attraverso precondizionamento ipossico e poi li indirizza a diventare cellule Schwann mature.
Questo manoscritto descrive un mezzo per arricchire i progenitori neurali dalla popolazione delle cellule stromali del midollo (MSC) e quindi di indirizzarli al destino cellulare di Schwann. Abbiamo sottoposto a MSC topi e umani situazioni ipossiche transitorie (ossigeno 1% per 16 h) seguito da espansione come neurosfere su substrato di basso affinamento con fattore di crescita epidermica (EGF) / fattore di crescita fibroblastico base (bFGF). Le neurosfere sono state seminate in plastica di coltura tissutale rivestita con poli-D-lisina e laminina e coltivate in un cocktail gliogenico contenente β-Heregulin, bFGF e fattore di crescita derivato da piastrine (PDGF) per generare cellule simili a cellule Schwann (SCLC). Gli SCLC sono stati indirizzati verso l'impegno di destino mediante cocultura per 2 settimane con neuroni gangliali radici dorsali purificati (DRG) ottenuti da E14-15 ratti incinte Sprague Dawley. Le cellule Schwann mature dimostrano persistenza nell'espressione S100β / p75 e possono formare segmenti di mielina. Le celle generate in questo modo hanno potenziale aPplicazioni nel trapianto di cellule autologhe dopo lesioni del midollo spinale, così come nella modellazione delle malattie.
Il trapianto di progenitori neurali e dei loro derivati dimostra la promessa come strategia di trattamento a seguito di lesioni traumatiche 1 e 2 e neurodegenerazione 3 , 4 . Prima dell'applicazione clinica, è essenziale assicurare: i) un metodo per accedere e espandere ad una fonte autologa di cellule staminali / progenitori e ii) un mezzo per indirizzarli a tipi di cellule mature, rilevanti 3 . Il nostro interesse per la terapia cellulare per lesioni del midollo spinale ci ha portato a cercare una fonte di cellule autol....
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Tutte le procedure relative agli animali sono state eseguite in stretta conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e approvata dal comitato per l'uso degli animali vivi per l'insegnamento e la ricerca, Li Ka Shing Facoltà di Medicina dell'Università di Hong Kong. I campioni di midollo osseo umano sono stati ottenuti dalla cresta iliaca di donatori sani dopo aver ottenuto il consenso informato. I protocolli sono stati approvati dal consiglio di revisione istituzionale, l'Università di Hong Kong.
1. Preparazione delle Culture MSC di Rat
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Una panoramica delle tappe chiave del nostro protocollo è illustrata nella Figura 1 . In sintesi, MSC ratto e umano sono selezionati per aderenza alla plastica della coltura tissutale. I MSC espanditi sono precondizionati con ipossia e sono quindi soggetti a condizioni di formazione della neurosfera. Le neurosfere sono placcate e consentite di differenziarsi in SCLC. Le SCLC vengono coculturate con i neuroni DRG purificati per generare cellule Schwann impegn.......
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È fondamentale preservare la "gamba" dei MSC prima dell'arricchimento dei progenitori neurali attraverso precondizionamento ipossico e cultura della neurosfera. Dalla nostra esperienza, MSC multipotenti possono essere identificati in modo affidabile dalla loro morfologia simile a fibroblasti. Al contrario, i MSC che hanno adottato una morfologia piu 'appiattita e quadrangolare, con fibre di stress sospettose prominenti, non adottano facilmente i destini delle cellule neurali e vanno scartate. In genera.......
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Tutti gli autori di questo manoscritto non hanno dichiarazioni da dichiarare.
Gli autori vorrebbero riconoscere il dottor Nai-Sum Wong per aver fornito l'apparato della camera di ipossia e la signora Alice Lui per il supporto tecnico.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| &alfa; MEM | Sigmaaldrich | M4526 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher scientific | 12400-024 | |
| Terreno neurobasale | Thermofisher scientific | 21103-049 | |
| FBS | Biosera | FB-1280/500 | |
| B27 | Thermofisher scientific | 17504-001 | |
| Fattore di crescita epidermico (EGF) | Thermofisher scientific | ||
| Fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF) | Peprotech | 100-18B/100UG | |
| Fattore di crescita nervoso (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Fattore di crescita derivato dalle piastrine-AA (PDGF-AA) | Peprotech | 100-13A | |
| Heregulin beta-3, dominio EGF (β-Her) | Millipore | 01-201 | |
| Uridina | Sigmaaldrich | U3003 | |
| 5-Fluro-2' - deossiuridina (FDU) | Sigmaaldrich | F0503 | |
| Poli-D-lisina (PDL) | Sigmaaldrich | P7886-1G | |
| Laminin | Thermofisher scientific | 23017015 | |
| GlutaMAX | Thermofisher scientific | 35050061 | |
| Penicillina / streptomicina (P/S) | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| TrypLE Express | Thermofisher Scientific | 12604-013 | |
| Piastra da 10 cm per coltura | aderenteTPP | 93100 | Utilizzato per la selezione di MSC mediante aderenza alla coltura tissutale Piastra |
| 6 pozzetti per coltura aderente | TPP | 92006 | Utilizzato per l'espansione delle MSC dopo il passaggio |
| Piastra UltraLow a 6 pozzetti per coltura non aderente | Corning | 3471 | Utilizzato per l'arricchimento dei progenitori neurali |
| anti-umano CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 555593 | |
| anti-umano CD73 | BD Biosciences | 550256 | |
| STRO-1 R | & D Systems | MAB1038 | |
| la nestina umana | D Systems | MAB1259 | |
| anti-umano CD45 | BD Biosciences | 555480 | |
| anti-ratto CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 554895 | |
| anti-ratto CD73 | BD Biosciences | 551123 | |
| anti-ratto nestina | BD Biosciences | MAB1259 | |
| anti-ratto CD45 | BD Biosciences | 554875 | |
| Anti-S100β | Dako | Z031101 | |
| Anti-p75 | Millipore | MAB5386 | |
| Anti-GFAP | Sigmaaldrich | G3893 | |
| Anti-Classe III-beta tubulina (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| Nuclei anti-umani | Millipore | MAB1281 | |
| Camera di ipossia | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| HEPES tampone | Sigmaaldrich | H4034-100G |
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