Un semplice metodo di estrazione frazionata per l'analisi completa dei metaboliti, dei lipidi e delle proteine ​​da un singolo campione

Summary

Viene presentato un protocollo per l'estrazione totale dei lipidi, dei metaboliti e delle proteine ​​dai tessuti biologici utilizzando un campione.

Abstract

La comprensione di sistemi biologici complessi richiede la misura, l'analisi e l'integrazione di più classi composti della cellula vivente, di solito determinate da transcrizioni, proteomiche, metabolomiche e lipidomiche. In questo protocollo, introduciamo un metodo semplice per l'estrazione riproducibile di metaboliti, lipidi e proteine ​​dai tessuti biologici utilizzando una singola aliquota per campione. Il metodo di estrazione è basato su un metodo di metile di terzo - butile: metanolo: acqua per liquido: suddivisione liquida di metaboliti idrofobici e polari in due fasi immiscibili insieme alla precipitazione di proteine ​​e di altre macromolecole come pellet solido. Questo metodo fornisce quindi tre diverse frazioni di composizione molecolare specifica, che sono pienamente compatibili con le tecnologie comuni ad alta trasmissione "omics" come la cromatografia liquida (LC) o la gascromatografia (GC) accoppiata a spettrometri di massa. Anche se il metodo era initSviluppata per l'analisi di diversi campioni di tessuti vegetali, si è dimostrata pienamente compatibile per l'estrazione e l'analisi di campioni biologici provenienti da sistemi diversi come alghe, insetti, tessuti e colture cellulari di mammiferi.

Introduction

La biologia dei sistemi, emersa nella metà del secolo scorso ¹ ed è stata avanzata dall'analisi su larga scala di set di dati genomici e trascrizionali ^{2 , 3} , si è sviluppata in un approccio nuovo e indispensabile per l'analisi di sistemi biologici complessi ^{4 , 5} . L'obiettivo principale della biologia dei sistemi è quello di decifrare le interazioni di componenti e le dipendenze nei sistemi biologici e di colmare il legame tra i genotipi, la loro realizzazione, le trasformazioni molecolari ei fenotipi che ne derivano. Di conseguenza, l'integrazione di set di dati completi, prodotti dai vari approcci analitici su larga scala, quali la genomica, la trascrizione, la metabolomica, la lipidomica e la proteomica e la loro analisi computazionale, è diventata un prerequisito per la descrizione e la comprensione di sistemi biologici complessi.

Bas Sull'enorme diversità chimica e la complessità dei componenti biologici in qualsiasi sistema vivente, la produzione di set di dati "omici" grandi e completi si basa fortemente sulla qualità del metodo di estrazione applicato ⁹ . Oltre alla qualità del metodo di estrazione, l'economia del metodo è importante; Ciò significa che sarebbe auspicabile ottenere tutte le informazioni molecolari dal minor numero possibile di campioni. Spesso gli importi del campione possono limitare e pertanto è estremamente auspicabile far uso di un metodo di estrazione che può derivare tante classi molecolari da una singola estrazione di un determinato campione. Ciò significa che, invece di utilizzare diversi metodi di estrazione specializzati per l'estrazione di diverse classi composto da diverse aliquote di campione dello stesso campione, viene utilizzato un metodo di estrazione sequenziale che fraziona i costituenti molecolari di una singola aliquota in frazioni molecolari differenti.

Il metodo comune impiegato per questi metodi di estrazione frazionati si basa sul metodo di estrazione lipidica a due fasi di Folch et al. Sviluppato nel 195710. Questo metodo si basa su una suddivisione di cloroformio: metanolo / acqua di metaboliti polari e idrofobici ed è stata Con l'evoluzione della biologia dei sistemi multi-omici, il metodo Folch è stato ulteriormente gradualmente migliorato usandolo per il partizionamento del campione di proteine ​​e metaboliti polari e lipidi per Le metabolomiche a base di gas e liquido e le lipidomiche dei composti polari e idrofobici, oltre alla proteomica a base di cromatografia a liquido ^{11 , 12 , 13 , 14.} Purtroppo, tutti questi metodi si basano su un metodo di estrazione a base di cloroformi che non solo Porta al fo non desideratoRmation del pellet proteico come interfaase tra la polare e la fase lipidica, ma che è anche un solvente indesiderato da una prospettiva chimica verde ^{15 , 16} . Tuttavia, il solvente metil tert- butil etere (MTBE) supera entrambi questi problemi e rappresenta un adeguato sostituto per il cloroformio. Sulla base di questi requisiti, abbiamo deciso di stabilire un metodo di estrazione MTBE: metanolo: a base di acqua, che soddisfa tutte le specifiche di cui sopra e quindi funge da punto di partenza ideale per un'analisi completa multi-omics ¹⁶ .

Questo protocollo guida l'utente passo-passo attraverso il flusso di lavoro semplice, rapido e riproducibile della preparazione del campione, compresa la risoluzione dei problemi comunemente osservati. Inoltre, illustreremo brevemente dati analitici esemplari da cromatografia liquida a ultrasuoni a spettrometria di massa (UPLC-MS) -basI lipidomi, la metabolomica e la proteomica da campioni di tessuti vegetali. Anche se gli esempi sono stati derivati ​​da 50 mg di un campione di tessuti a foglia Arabidopsis thaliana , questo protocollo è stato utilizzato per diversi altri campioni e tessuti biologici, tra cui le alghe ^{17 , 18} , gli insetti ¹⁹ e le cellule dei mammiferi, gli organi e i tessuti ^{20 , 21 , 22} . L'ambito del protocollo di estrazione presentato è quello di fornire una descrizione chiara e dettagliata del trattamento dei campioni di pre-estrazione e della stessa procedura di estrazione. Anche se forniamo tre brevi esempi di applicazione analitica, informazioni dettagliate sul trattamento dei dati pre- e post-analitico possono essere ottenute dalle nostre precedenti pubblicazioni ^{16 , 23 , 24 ,} 25 ^{, 26} .

Protocol

Attenzione : Metanolo (MeOH) e metil tert- butil etere (MTBE), utilizzati durante l'estrazione, sono infiammabili e possono avere irritazioni respiratorie, oculari o cutanee in caso di esposizione e / o contatto prolungato. Si prega di trattare con cura solo in un cappuccio e utilizzare le procedure di sicurezza appropriate durante l'estrazione (cappotto di laboratorio, occhiali di protezione, guanti, ecc. ). L'azoto liquido e il ghiaccio secco, utilizzati in varie fasi di questo protocollo, possono causare gravi ustioni da contatto prolungato della pelle. Si prega di trattare con cura con guanti e occhiali protettivi. Gli utenti possono utilizzare diversi prodotti chimici, reagenti o standard interni per l'analisi del campione, alcuni dei quali possono essere tossici. Si prega di esaminare le schede tecniche di sicurezza chimiche per tutti i materiali utilizzati.

1. Raccolta e raccolta di campioni biologici

1. Preparare i tubi di raccolta etichettati.
   NOTA: Qui raccogliere campioni biologici in etichetta, 2 mL, rotondo, sicuro, locK tubi di microcentrifuga contenenti due diametri di 5 mm, sfere metalliche per l'omogeneizzatore tissutale.
2. Preparare un dewar di azoto liquido riempito.
3. Raccogliere il campione biologico e bloccare il tessuto in azoto liquido. Eseguire questo passo nel più breve tempo possibile in pochi secondi per evitare le alterazioni metaboliche indotte da ferite.
   Nota: Per scopi dimostrativi, utilizzare foglie di rosette da Arabidopsis thaliana (Col-0) di 30 giorni di selvaggina, coltivate nel terreno in condizioni di lunga giornata.
4. Conservare i campioni raccolti su ghiaccio secco per interruzioni brevi o conservarle a -80 ° C per periodi più lunghi.

2. Rettifica e disturbi del tessuto

1. Pre-raffreddare i contenitori del tubo dell'omogenizzatore tissutale in azoto liquido per almeno 10 min. Se non è disponibile un omogeneizzatore di tessuti, utilizzare malte e pestelli puliti e pre-raffreddati.
2. Prendete i campioni dall'azoto liquido, dal ghiaccio secco o dal congelatore -80 ° C e posizionateli nel pre-raffreddatoPorta tubi.
3. Posizionare rapidamente i porta tubi nell'indoganizzatore tissutale.
4. Macinare il materiale biologico in una polvere fine e omogenea. Utilizzare 20 Hz per 1 min per le foglie.
   Nota; Il tempo e la velocità di omogeneizzazione possono essere variati a seconda del tessuto, assicurarsi che il campione sia omogeneizzato in una polvere fine e che questa polvere sia mantenuta congelata ad ogni passo dell'omogeneizzazione.
5. Prendete i campioni biologici dai porta tubi e tenerli congelati fino all'estrazione.

3. Pesatura di tessuti

1. Utilizzare un equilibrio analitico con precisione sufficiente per gli importi richiesti del campione.
2. Preparare un tubo di microcentrifuga sicuro a bloccaggio a 2 millimetri di etichetta.
3. Pre-raffreddare i tubi e spatole in azoto liquido.
4. Aliquota la quantità richiesta di polvere di tessuto nel tubo di microcentrifuga da 2 mL sicuro.
   Attenzione: Evitate eventuali sbrinamenti del materiale vegetale riducendo al minimo il tempo necessario a wI campioni.
5. Riportare i campioni aliquotati immediatamente dopo la pesatura in azoto liquido.
6. Registrare per ogni campione il peso esatto. Utilizzare 10-50 mg ± 10% per la maggior parte dei tessuti vegetali.
7. Conservare i campioni aliquotati a -80 ° C fino all'estrazione.

4. Configurazione del reagente

1. Utilizzare una miscela di estrazione di metil tert- butil etere (MTBE) / metanolo (MeOH).
   1. Per la preparazione di 100 mL di solvente di estrazione, aggiungere 75 mL di MTBE a 25 mL di MeOH per ottenere una miscela di MTBE: MeOH (3: 1, vol / vol).
   2. Aggiungere standard interni per la normalizzazione post analisi secondo le esigenze analitiche. Tipicamente si aggiunge 50 μl di 1,2-diheptadecanoil- sn -glicero-3-foscololina (1 mg / ml in cloroformio) come standard interno per l'analisi lipidica a base UPLC-MS, aggiungendo 50 μl di ¹³ C sorbitolo 1 mg / mL in acqua) come standard interni per l'analisi del primario GC-MSmetaboliti. Gli standard interni per l'analisi del metabolita UPLC-MS sono 50 μL di corticosterone (1 mg / ml in metanolo) e 25 μL di ampicillina (1 mg / ml in metanolo).
   3. Trasferire il solvente in una bottiglia di vetro pulita che è stata lavata con miscela MTBE: MeOH.
   4. Conservare la miscela di estrazione fino a 1 settimana a 4 ° C.
      NOTA: Non conservare la miscela di estrazione per periodi più lunghi per mantenere risultati riproducibili.
2. Per indurre la separazione di fase, utilizzare acqua (H ₂ O) / metanolo (MeOH).
   1. Per la preparazione di 100 ml di H ₂ O: MeOH aggiungere 75 ml di H ₂ O a 25 ml di MeOH per ottenere H ₂ O: MeOH (3: 1, vol / vol).
   2. Trasferire il solvente in una bottiglia di vetro pulita che è stata lavata con miscela di H ₂ O: MeOH. Questo solvente può essere conservato per diverse settimane a temperatura ambiente.

5. Estrazione dei campioni

1. Pre-raffreddare l'estrazione m(MTBE: MeOH, 3: 1, vol / vol) a -20 ° C utilizzando un sistema di raffreddamento liquido o un congelatore a -20 ° C.
2. Togliere i campioni aliquotati uno ad uno e aggiungere 1 ml della miscela di estrazione pre-raffreddata ad ogni tubo di campione. Attenzione: eseguire rapidamente questo passo a causa della bassa viscosità di MTBE.
3. Mescolare immediatamente su un miscelatore vortex finché il tessuto è ben omogeneizzato all'interno della miscela di estrazione.
   NOTA: Questo passo è molto importante, poiché è necessario precipitare le proteine ​​e inattivare le loro attività enzimatiche.
4. Incubare tutti i campioni su un agitatore orbitale a 100 giri / min per 45 minuti a 4 ° C.
5. Sonicare i campioni per 15 minuti in un bagno di sonicazione raffreddato al ghiaccio.

6. Frazionamento per separazione di fase

1. Aggiungere a ciascun tubo di campione 650 μl di H ₂ O: MeOH (3: 1, vol / vol).
2. Mescolare bene vortexando per 1 minuto.
3. Centrifugare i campioni ad una velocità di 20.000 x g per 5 minuti a 4 ° C.
   NOTA: Dopo questo passaggio, ci sono due fasi liquide immiscibili con un solido pellet nella parte inferiore del tubo.
   Attenzione: Maneggiare con cura i tubi per evitare di mescolare le due fasi liquide e evitare di interrompere il pellet precipitato.

7. Aliquotazione delle frazioni polari e idrofobiche

1. Trasferire 500 μL del solvente dalla fase superiore contenente lipidi in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml etichettato.
   NOTA: I campioni lipidici aliquotati possono essere direttamente concentrati per l'analisi UPLC-MS immediata (fase 8.1) o conservati per diverse settimane a -80 ° C.
2. Una volta rimossi i 500 μL dal campione, rimuovere la restante fase lipidica usando una pipetta da 200 μL.
3. Trasferire 400 μL del solvente dalla fase inferiore (polarità e semipolarità) in un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml etichettato. I campioni polari aliquotati possono essere direttamente concentrati per l'immediata analisi UPLC-MS (fase 8.2) o memorizzatiR settimane a -80 ° C.
4. Prendere un'aliquota aggiuntiva di 200 μL per eseguire ulteriori analisi, ad esempio l'analisi del metabolita a base di gas cromatografica come descritto in modo preciso ¹⁶ .
5. Rimuovere il resto della fase acquosa pipettando fuori il volume in eccesso.
6. Lavare la proteina ottenuta, l'amido, il pellet di parete cellulare con 500 μl di metanolo accuratamente vortexandolo per 1 minuto.
7. Centrifugare i campioni ad una velocità di 10.000 x g per 5 minuti a 4 ° C.
8. Eseguire l'estrazione e la digestione proteica (fase 11) o l'analisi della parete di amido / cellula come descritto in precedenza ¹⁶ .
   NOTA: Se non vengono utilizzati immediatamente, questi pellet possono essere conservati per diverse settimane a -80 ° C.

8. Concentrazione e conservazione delle frazioni

1. Evaporare il solvente dai campioni lipidici (dal punto 7.1) in un concentratore a vuoto senza riscaldamento (per 1-2 ore) o preferibilmente utilizzare un nitrOgen flusso evaporatore per evitare modificazioni ossidative dei lipidi.
   NOTA: I campioni seccati devono essere analizzati immediatamente. Per la conservazione, lasciare campioni in soluzione MTBE, idealmente in flaconi di vetro (passo 7.1).
2. Evaporare il solvente dai campioni acquosi (dal punto 7.3 o da 7.4) per notte in un concentratore di vuoto senza riscaldamento. NOTA: i campioni secchi possono essere conservati per diverse settimane a -80 ° C prima dell'analisi.

9. Analisi dei lipidi usando UPLC-MS ²⁴

1. Riposizionare le frazioni lipidiche secche (dal punto 8.1) in 400 μl di acetonitrile: 2-propanolo (7: 3, vol / vol).
2. Portare liquido sufficiente a flaconcini di vetro e tappo stretto.
3. Mettere le fiale di vetro in un autosampler raffreddato (4 ° C).
4. Iniettare 2 μL per campione e separare i lipidi su una colonna Reverse Phase (RP) C ₈ mantenuta a 60 ° C utilizzando un sistema UPLC in esecuzione a una portata di 400 μL / min.
5. Usa il cellulareFasi descritte nella tabella 1 per la separazione cromatografica.
6. Acquisisci gli spettri di massa in modalità di ionizzazione positiva e negativa usando uno strumento MS appropriato che copre la gamma di massa tra 150 e 1.500 m / z.

10. Analisi di metadati polari e semi-polari usando UPLC-MS ²⁵ .

1. Riposizionare la fase polare (dal punto 8.2) in 200 μl di metanolo UPLC: acqua (1: 1, vol / vol).
2. Portare liquido sufficiente a flaconcini di vetro e tappo stretto.
3. Mettere le fiale di vetro in un autosampler raffreddato (4 ° C).
4. Iniettare 2 μL da ogni campione e separare i metaboliti su una colonna RP C ₁₈ mantenuta a 40 ° C utilizzando un sistema UPLC in esecuzione a una portata di 400 μL / min.
5. Utilizzare le fasi mobili per la separazione cromatografica con i parametri indicati nella tabella 2 .
6. Acquisiti spettri di massa di scansione completa in modalità di ionizzazione positiva e negativaUno spettrometro di massa adatto che copre una fascia di massa compresa tra 50 e 1.500 m / z.

11. Estrazione proteica, digestione e analisi ¹⁶

1. Riassemblare la pellicola lavata della proteina / amido / cellulare (dal punto 7.8) in 200 μl del tampone di estrazione proteica di scelta. Nota: Usiamo buffer urea / tiourea (5 M urea, 2 mM tiourea, 15 mM DTT, 2% CHAPS e proteasi e inibitori della fosfatasi) ²⁷ .
2. Sonicare i campioni per 10 minuti in un bagno sonico raffreddato al ghiaccio.
3. Incubare i campioni per 30 minuti su un agitatore orbitale (100 rpm) a temperatura ambiente.
4. Centrifugare le proteine ​​disciolte a 10.000 x g per 5 min.
5. Raccogliere il surnatante proteico in un nuovo tubo.
6. Determinare la concentrazione proteica dal supernatante raccolto ²⁸ .
7. Digest 50 μg di proteina in soluzione con un protocollo di scelta. Tipicamente, utilizzare il mix di mix Trypsin / Lys-CIl manuale di istruzioni.
8. Dopo la digestione, eseguire la discioltazione dei peptidi prima della spettrometria di massa usando le punte C ₁₈ e eluire i peptidi digeriti ²⁹ .
9. Concentrare i campioni in prossimità di secchezza in un concentratore di vuoto senza riscaldamento.
10. Riassemblare i campioni in un appropriato tampone di carico (es. 5% acetonitrile, 0,5% acido formico) e analizzare le miscele peptide mediante LC-MS / MS utilizzando uno spettrometro di massa ad alta risoluzione collegato ad un sistema nano LC.
    NOTA: nell'esempio di set di dati proteomici presentati in questo protocollo, abbiamo utilizzato un gradiente come descritto nella tabella 3 .
11. Impostare lo spettrometro di massa utilizzando una strategia di top 15, in cui una scansione completa (FS) è stata seguita da fino a 15 scansioni MS / MS dipendenti dai dati, ai seguenti parametri: Il FS era nella gamma di massa 200-2000 m / z Una risoluzione di 70.000 con un valore target di 3x10 ⁶ ioni. Ottieni le scansioni MS / MS dipendenti dai dati da un livello superioreLa dissociazione collettiva (HCD). Impostare i valori di destinazione per MS / MS a 1e ⁵ ioni, con un tempo di riempimento ioni massimo massimo di 50 ms, una finestra di isolamento di 4,0 m / z, energia di collisione normalizzata (NCE) del 30% e un rapporto di riempimento dell'1%. Misura gli ioni MS / MS ad una risoluzione 17.500 e l'esclusione dinamica è stata impostata a 60 s.

Results

I set di dati multi-omici completi sono preziosi per la comprensione di sistemi biologici complessi. La strategia di un esperimento biologico riuscito inizia normalmente da un design sperimentale, da un set-up e da una serie di esperimenti, seguito da raccolta di campioni, estrazione, acquisizione di dati analitici, elaborazione dei dati grezzi, analisi dei dati statistici, identificazione del metabolismo rilevante e interpretazione dei dati biologici Tra cui la mappatura e la visualizzazione del percorso ( Figura 1 ).

Nel protocollo di estrazione introdotto qui, ci concentriamo sui passaggi di raccolta, di gestione e di estrazione del campione, che sono rappresentati nella panoramica dettagliata del flusso di lavoro in Figura 2 . Per scopi dimostrativi, è stato selezionato 50 mg di tessuto a foglie Arabidopsis. Questo materiale è stato raccolto, macinato e estratto prima di sottoporlo a trePiattaforme UPLC-MS analitiche esemplari, che forniscono dati che possono essere utilizzati per l'analisi lipidomica, metabolomica e proteomica mirata e non mirata. Le figure 2 e 6 comprendono inoltre immagini rappresentative di come, in condizioni standard, il solvente di estrazione dovrebbe essere simile. Inoltre, sono mostrati esempi di campioni contenenti quantità eccessive di macromolecole precipitate (proteine ​​e amido) e campioni con omogeneizzazione del campione inadeguato ( Figura 3 ). La risoluzione dei problemi per questi due problemi comuni è riportata in breve nella Figura 3, ma è anche discussa più in dettaglio nella nostra precedente pubblicazione ¹⁶ .

Le figure 4 e 5 illustrano esempi di tre cromatogrammi analitici derivanti dal lipido, il polare / semMetaboliti ipolari e analisi proteica. I lipidi, prelevati dalla fase MTBE superiore ( Figura 2 ), sono stati analizzati mediante cromatografia liquida di ultrasuoni a fase inversa (RP) C ₈ accoppiata a spettrometria di massa ad alta risoluzione. I lipidi possono essere acquisiti utilizzando modalità di ionizzazione positive e negative ( Figura 4 , pannello superiore) ^{16 , 24} .

Polar e semipolari metabolici primari e secondari sono stati analizzati dalla fase polare (acqua / metanolo) ( figura 2 ) per fase reversa (RP) C ₁₈ UPLC-MS ²⁵ . Il metodo illustrato, utilizzando la cromatografia in fase inversa, è altamente compatibile con l'analisi dei metaboliti semipolari (ossia metaboliti del metabolismo secondario vegetale), che possono essere analizzati utilizzando modalità di ionizzazione positive e negative nella MS( Figura 4 , pannello inferiore) ¹⁶ . Altri metaboliti idrofili di questa frazione (zuccheri, amminoacidi polari ecc.) Che non mostrano una buona ritenzione sul materiale di fase inversa possono essere analizzati con altri metodi analitici quali GC-MS ¹⁶ o cromatografia liquida di interazione idrofile ³⁰ .

Le proteine, prelevate dalla pellet solida nella parte inferiore del tubo di estrazione ( Figura 2 ), sono state digerite e analizzate in soluzione utilizzando la pistola LC-MS ( Figura 5 ), mentre il protocollo di estrazione di amido e parete cellulare Il materiale può essere ottenuto dal nostro protocollo ¹⁶ precedentemente pubblicato.

In sintesi, più di 200 specie lipidiche, 50 metaboliti semipolari annotati e diverse migliaia di proteiNs possono essere identificati abitualmente da campioni del tipo utilizzato nel nostro esempio. Inoltre, il metodo ha mostrato un'ampia applicabilità utilizzando diversi tessuti, organi e materiale di coltura cellulare ( Figura 6 ).

Figura 1: Flusso di lavoro generale per analisi di Omics non targetizzati in scala larga. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Flusso di lavoro di preparazione e estrazione del campione per l'analisi dei lipidi, dei metaboliti e delle proteine ​​da un singolo aliquota di un campione biologico.Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Esempi illustrativi di problemi comunemente osservati che utilizzano protocolli di estrazione a partizione a due fasi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Chromatogrammi rappresentativi di metaboliti lipidici e semipolari da estratti di foglie Arabidopsis thaliana . Cromatogramma di picco baseS di lipidi (pannello superiore) e metaboliti semipolari (pannello inferiore) analizzati in modalità di ionizzazione positiva ¹⁶ . I grafici a torta nell'angolo in alto a destra di ciascun cromatogramma mostrano il numero di lipidi e metaboliti identificati assegnati a diverse classi chimiche. Chl, clorofille; DAG, diacilgliceride; DGDG, digalactosyldiacylglycerol; FA, acido grasso; LysoPC, lisofosfatidilcolina; MGDG, monogalactosyldiacylglycerol; PC, fosfatidilcolina; PE, fosfatidiletanolamina; PG, fosfatidilglicerolo; PI, fosfatidilinositolo; PS, fosfatidilcerina; SP, sphingolipide; SQDG, sulfoquinovosyldiacylglycerol; TAG, tricilgliceride. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 Trong>: Cromatogramma di picco base rappresentativo dei peptidi da estratto di foglie di Arabidopsis thaliana .
Il grafico a torta mostra nell'angolo superiore destro indica il numero di proteine ​​identificate assegnate a diversi processi biologici ¹⁶ . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6 : Esempi rappresentativi di estrazione di diversi tipi di tessuti da Arabidopsis thaliana di tipo selvaggio .
Tutti i campioni sono stati estratti utilizzando 50 mg di peso fresco dai tessuti indicati."> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tempo (min)	% Buffer A al Buffer B
Da 0 a 1 min	45% A	Tampone A: 1% 1M NH4-Acetato, 0,1% acido acetico in UPLC MS di grado acqua
Da 1 a 4 min	Gradiente lineare dal 45% A al 25% A	Buffer B: 1% 1M NH4-Acetato, 0,1% acido acetico in acetonitrile / isopropanolo 7: 3, (v: v)
4 a 12 min	Gradiente lineare dal 25% A all'11% A	Portata 400 μL / min
12 a 15 min	Gradiente lineare da 11% A a 0% A	Volume di iniezione 2 μL
Da 15 a 19,5 min	Lavare la colonna per 4,5 min con 0% A
19,50 a 19,51 min	Ritornare al 45% A
19,51 a 24 min	Equilibrare con il 45% A

Tabella 1: Parametri di gradiente per la separazione dei lipidi RP-UPLC. RP, fase inversa. UPLC, cromatografia liquida a ultrasuoni.

Tempo (min)	% Buffer A al Buffer B
Da 0 a 1 min	99% A	Tampone A: 0,1% acido formico nell'acqua UPLC
Da 1 a 11 min	Gradiente lineare dal 99% A al 60% A	Tampone B: 0,1% acido formico in acetonitrile di UPLC grad
11 a 13 min	Gradiente lineare dal 60% A al 30% A	Portata 4001; L / min
Da 13 a 15 min	Gradiente lineare dal 30% A al 1% A	Volume di iniezione 2 μL
15 a 16 min	Lavare la colonna per 1 min con 1% A
16 a 17 min	Gradiente lineare da1% A a 99% A
Da 17 a 20 min	Equilibrare per 3 min al 99% A

Tabella 2: Parametri di gradiente per la separazione RP-UPLC di metaboli polari e semipolari. RP, fase inversa. UPLC, cromatografia liquida a ultrasuoni.

Tempo (min)	% Buffer B al Buffer A
Da 0 a 5 min	Gradiente lineare da 0 a 10%	Tampone A: 0,1% acido formico nell'acqua UPLC
Da 5 a 80 min	Gradiente lineare dal 10% al 40%	Tampone B: 0,1% acido formico in acetonitrile di grado UPLC del 60%
80 a 85 min	Gradiente lineare dal 40% al 60%	Portata 300 nL / min
85 a 86 min	Gradiente lineare dal 60 al 95%	Volume di iniezione 5 μL
Da 86 a 91 min	Lavare la colonna per 5 min con il 95%
91 a 92 min	Gradiente lineare dal 95% allo 0%
Da 93 a 110 min	Equilibrare la colonna per 17 minuti allo 0%

Tabella 3: Parametri di gradiente per la separazione dei peptidi Nano-LC. LC, cromatografia liquida.

Discussion

In questo articolo descriviamo e illustriamo un semplice e estremamente applicabile protocollo di estrazione per una completa analisi lipidomica, metabolomica e proteomica da un singolo campione di foglie da 50 mg. Il metodo è stato precedentemente utilizzato in diversi studi, che sono stati pubblicati in diversi articoli ^{17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37} E dimostrato, oltre al suo diretto avanzamentoFlusso di lavoro e alta applicabilità per essere robusti e riproducibili.

Le applicazioni qui fornite mostrano alcuni metodi di routine per lo screening iniziale di un campione biologico complesso. Questi set di dati metabolomici e lipidomi su larga scala illustrati possono fornire informazioni complete sulle variazioni ampie o specifiche del metabolismo del sistema biologico analizzato, mentre i dati ottenuti dall'analisi delle proteine ​​forniscono approfondimenti sulle quantità (abbondanti) e qualitative (modifiche ) Cambiamenti di enzimi, proteine ​​strutturali o fattori di trascrizione (TFs) che controllano funzioni cellulari e macchinari. Di conseguenza, i dati omic integrativi hanno il potenziale per rivelare le informazioni iniziali su possibili cambiamenti indotti da perturbazioni genetiche o biotiche e / o abiotiche di un sistema biologico, illustrando i cambiamenti molecolari di molecole diverse associate a percorsi metabolici specifici o processi cellulari.

Ovviamente, A lungo termine, è abbastanza essenziale per un'analisi della biologia dei sistemi di successo per massimizzare il numero di entità molecolari analizzate e annotate, permettendo il più possibile il monitoraggio delle funzioni e delle attività cellulari. A tal fine, le frazioni ottenute possono essere applicate in aggiunta a metodi analitici diversi, mirando a ulteriori composti o classi composti ( Figura 4 ).

Detto questo, va ricordato che la strategia di analisi globale dei dati ottenuti può essere seguita da due diverse strategie: da un lato abbiamo sottolineato la spiegazione delle funzioni cellulari mediante la quantificazione di composti noti. D'altra parte, molti dei metaboliti misurati ei lipidi non sono ancora noti o annotati. Queste, tuttavia, le misurazioni composte non annotate contengono anche molte informazioni significative, che possono essere utilizzate con metodi statistici per la classificazione o discriminazione bTra gruppi o trattamenti ^{20 , 21 , 22} .

Tuttavia, questi composti sconosciuti, in particolare quelli rilevanti per la classificazione del gruppo o che servono come biomarcatori, devono essere identificati. Questo processo di identificazione è purtroppo abbastanza noioso e non può essere raggiunto senza ulteriori misurazioni analitiche o strategie ³⁸ . Come si può vedere dalla figura 4 , il numero di composti non annotati è abbastanza elevato (in realtà la stragrande maggioranza). Tuttavia, come sopra ricordato, questi picchi cromatografici possono essere gestiti all'interno dell'analisi dei dati e quindi le entità significativamente interessate possono essere chiarite e sottoposte a ulteriori strategie di identificazione.

In sintesi, possiamo concludere che il protocollo qui introdotto offre diversi vantaggi per la biologia dei sistemi sperimentali e per applicazioni statistiche classichezioni.

In primo luogo, poiché tutte le frazioni vengono estratte da un singolo campione, la variazione tra i diversi set di dati sperimentali (lipidi, metaboliti, proteine) è significativamente ridotta poiché ogni set di dati è derivato dalla stessa aliquota del campione. Ciò porta chiaramente alla maggiore comparabilità dei risultati ottenuti.

In secondo luogo, il metodo è facilmente scalabile e lo rende quindi altamente compatibile con quantità di campioni da piccole a grandi dimensioni. Utilizziamo regolarmente 10-100 mg di campioni di tessuti, ma sono stati eseguiti anche studi lipidomiali su un numero di soli 20 semi di Arabidopsis ³¹ . Soprattutto la compatibilità con piccole quantità di campioni rende questo metodo applicabile se sono disponibili quantità limitate di tessuti o campioni biologici. Tuttavia, anche se è sufficiente un materiale sufficiente per il campione, il metodo qui presentato offre il vantaggio di utilizzare questi campioni in un numero maggiore di replicazioni sperimentali anziché uLi canta per diverse procedure di estrazione. Ciò consente un'analisi statistica migliore e raffinata dei dati statistici.

In terzo luogo, dal momento che il metodo si basa su una frazionamento liquido-liquido di molecole polari e non polari, esso fornisce, in contrasto con semplici metodi di estrazione di una fase ( es. Estrazioni di metanolo), un significativo processo di decompletamento nella procedura. Questo decompletamento efficiente del campione porta ad una purificazione parziale delle singole frazioni a causa della separazione delle molecole interferenti chimicamente l'una dall'altra. Di conseguenza, il processo di partizione chimica non solo fornisce un vantaggio pratico per l'aliquota sistematica dei campioni estratti in classi chimiche diverse ma migliora anche le singole misurazioni analitiche, in quanto rimuove i composti contaminanti dalle diverse frazioni. Chiaramente, possiamo notare che soprattutto i lipidi, che sono partizionati alla fase organica e che di solito influenzano negativamente ilL'analisi cromatografica dei composti polari sarà quasi assente dalla frazione polare. Lo stesso vale per l'analisi dei lipidi idrofobici, che saranno esauriti dai composti polari. Oltre alla purificazione di composti polari e non polari l'uno dall'altro, esauriremo e raccogliamo proteine ​​e altre macro-molecole dal campione, che non solo fornisce una frazione separata che può essere utilizzata per l'analisi della proteina, dell'amido e della parete cellulare ¹⁶ ma anche Porta ad un campione più pulito all'interno delle singole frazioni. Ciò è particolarmente rilevante, poiché è noto che la presenza di grandi macromolecole porta a danni oa vita di almeno la durata delle colonne analitiche.

Ultimo ma non meno importante, il metodo di estrazione MTBE descritto, che si basa sul solvente di sostituzione cloroformio meno rischioso ¹⁵ , è già stato dimostrato da diversi studi del nostro gruppo, per essere ampiamente applPer i campioni biologici diversi dalle piante ¹⁶ , le alghe ^{17 , 18} , le mosche ^19, ma anche diversi tessuti, organi o cellule di mammiferi ^{20 , 21 , 22} .

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagenti e standard
Ampicillina	Sigma Aldrich	A9393-5G	Standard interno per metaboliti
Corticosterone	Sigma Aldrich	27840-500MG	Standard interno per metaboliti, grado HPLC
13C Sorbitolo	Sigma Aldrich	605514	Standard interno per metaboliti, ISOTEC®   Isotopi stabili
1,2-dieptadecanoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (17:0 PC)	Avanti Polar Lipids	850360P	Standard interno per lipidi
Metanolo (MeOH)	Biosolve Chemicals	13684102	acqua di grado ULC-MS
	Biosolve Chemicals	23214102	di grado ULC-MS
(MTBE)	Biosolve Chemicals	13890602	di grado HPLC
	Promega	V5072	Digestione enzimatica delle proteine
Equipment
Balance	Sartorius Corporation	14 557 572
Mulino miscelatore per la macinazione dei tessuti	Retsch, Vibromulino MM 300	20.746.0001
Mortaio e pestello	Sigma Aldrich	Z247464-1EA
Miscelatore a vortice	Vortex-Genie 2, Modello G560	SI-0236
Concentratore sottovuoto	Velocità di scansione Maxi Vac Alpha Evaporatori	7.008.500.002
Provette per microcentrifuga Safe-lock da 2 mL	Eppendorf	30120094	Utilizzato per l'estrazione di campioni
Provette per microcentrifuga da 1,5 mL con blocco sicuro	Eppendorf	30120086	utilizzato per l'agitatore di frazioni
	Eppendorf Thermomixer 5436	2050-100-05
Sonicator	USC 300 TH	142-0084
Microcentrifuga refrigerata	Eppendorf, modello 5427R	22620701
sistema UPLC	Sistema Waters Acquity UPLC (Waters, Machester, Regno Unito)
Sistema MS	Exactive, tipo Orbitrap, MS (Exactive, Thermo-Fisher, Brema, Germania).
Colonna C8 ibrida etilica a ponte (BEH) a fase inversa (RP) (100 mm & volte; 2,1 mm contenente 1,7 μ Acque	, Machester, Regno Unito	186002878	Analisi dei lipidi
RP High Strength Silica (HSS) colonna T3 (100 mm × 2,1 mm contenente 1,8 μ particelle di diametro m)	Waters, Machester, Regno Unito	186003539	Analisi dei metaboliti
Q Spettrometro di massa ad alta risoluzione ExactivePlus collegato ad un sistema EASY-nLC 1000.	Thermo-Fisher, Brema, Germania		Analisi dei peptidi