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Articolo metodologico

In Vitro Polimerizzazione di F-actina su Early Endosomes

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DOI:

10.3791/55829

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28 agosto 2017

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1Department of Biochemistry, University of Geneva, 2Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne

In questo articolo

Sommario

Funzioni di endosoma precoce dipendono dalla polimerizzazione di F-actina. Qui, descriviamo un saggio basato su microscopia in vitro che ricostituisce la nucleazione e la polimerizzazione di F-actina sulle prime membrane endosomal in provette, rendendo questa serie complessa di reazioni suscettibili di biochimica e genetica manipolazioni.

Abstract

Molte funzioni di endosoma precoce, particolarmente carico proteico ordinamento e membrana deformazione, dipendono dalla patch di brevi filamenti di F-actina nucleate sulla membrana endosomal. Abbiamo stabilito un dosaggio basato su microscopia in vitro che ricostituisce la nucleazione e la polimerizzazione di F-actina sulle prime membrane endosomal in provette, rendendo questa serie complessa di reazioni suscettibili di genetica e biochimica manipolazioni. Endosomal frazioni vengono preparate dal galleggiamento in pendenze del saccarosio dalle cellule che esprimono la precoce endosomal proteina GFP-RAB5. Citosoliche frazioni sono preparate da batch distinti delle cellule. Endosomal sia citosoliche frazioni possono essere congelate in azoto liquido, se necessario. Nell'analisi, la endosomal e frazioni citosoliche sono mescolate, e la miscela viene incubata a 37 ° C in condizioni appropriate (ad esempio, forza ionica, riducendo l'ambiente). Al momento desiderato, la miscela di reazione è stato risolto, e la F-actina si rivela con falloidina. Polimerizzazione e nucleazione di actina vengono poi analizzati da microscopia di fluorescenza. Qui, segnaliamo che questa analisi può essere usata per studiare il ruolo di fattori che sono coinvolti sia nella nucleazione di actina sulla membrana, o nel successivo allungamento, ramificazione o reticolazione dei filamenti di F-actina.

Introduzione

Nelle cellule eucariotiche superiori, proteine e lipidi sono interiorizzati in early endosomes dove si verifica l'ordinamento. Alcune proteine e lipidi, che sono destinati ad essere riutilizzati, sono incorporati in tubolare regioni della early endosomes e poi trasportati alla membrana plasmatica o trans-Golgi network (TGN)1,2. Al contrario, altre proteine e lipidi in modo selettivo sono confezionati in regioni della early endosomes che presentano un aspetto multivesicular. Espandere queste regioni e, al momento di distacco dai primi endosomal membrane, finalmente maturo in vescicole di vettore libero endosomal o MVB (ECV/MVB), che sono responsabili di trasporto di merci verso gli endosomi ritardato1, 2.

Actina svolge un ruolo cruciale nel processo di rimodellamento della membrana associato endosomal ordinamento capacità e biogenesi endosoma. Proteina lungo le vie di riciclaggio alla membrana plasmatica o a livello di TGN dipende il retromer complessi e proteine associate. Questo macchinario ordinamento sembra essere accoppiato alla formazione di riciclaggio tubuli tramite interazioni della retromer complessa, con WASP e cicatrice omologo (WASH) complesse e ramificate actina3,4,5 . Al contrario, molecole destinati al degrado, particolarmente attiva segnalazione recettori, sono filtrate in vescicole intraluminal (ILVs) endosomal ordinamento complessi richiesti per trasporto (ESCRT)2,6, 7. Mentre non è noto il ruolo possibile di actina processo di cernita ESCRT-dipendente, F-actina svolge un ruolo importante nella biogenesi di ECV/MVB e nei trasporti oltre early endosomes. In particolare, abbiamo trovato che Annessina A2 Lega regioni colesterolo-arricchita della endosoma precoce e insieme spire1, costituisce la polimerizzazione di F-actina. La formazione della rete ramificata actina osservata su endosomi richiede l'attività di ramificazione della proteina actina-correlate (ARP) 2/3 complesso, così come l'ERM proteina moesina e i leganti l'actina proteina cortactin8,9.

Qui, descriviamo un saggio basato su microscopia in vitro che ricostituisce la nucleazione e la polimerizzazione di F-actina sulle prime membrane endosomal in provette. Questo test è stato utilizzato in precedenza per studiare il ruolo di Annessina A2 nella nucleazione di F-actina e moesin e cortactin nella formazione di endosomal actina reti8,9. Con questo protocollo in vitro , la complessa serie di reazioni che si verificano in endosomi durante la polimerizzazione dell'actina diventano suscettibile di analisi biochimica e molecolare dei passaggi sequenziali del processo, compresa la nucleazione di actina, lineare polimerizzazione, rami e reticolazione.

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Protocollo

1. soluzioni e preparazioni

Nota: tutti i buffer e soluzioni devono essere preparati in bidistillata (dd) H 2 O. Poiché lo stato di idratazione di saccarosio varia, la concentrazione finale di tutte le soluzioni di saccarosio deve essere determinata utilizzando un rifrattometro.

Soluzione tampone fosfato e
  1. preparare senza cationi bivalenti (PBS-): 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4 e 6,5 mM Na 2 HPO 4. Regolare il pH a 7.4. Sterilizzare in autoclave (1 ciclo a 121 ° C per 15 min) e conservare a temperatura ambiente.
  2. Preparare la soluzione di riserva di imidazolo 300mm: 0,204 g di imidazolo in 10 mL di ddH 2 O.Adjust il pH 7.4 a 4 ° C, utilizzando utilizzando un 0.22 μm a sterilizzare HCl. filtro filtro di dimensione del poro e conservare a 4 ° C.
    3. Buffer di
  3. Prepare omogeneizzazione (HB; preparare circa 100 mL): saccarosio 250 mM in imidazolo di 3 mM. Regolare il pH a 7,4 a 4 ° C, utilizzando un pH-metro. Filtro-sterilizzare utilizzando un filtro di dimensione dei pori di 0.22 μm e conservare a 4 ° C. complemento l'HB appena prima dell'uso con un cocktail di inibitori della proteasi alle concentrazioni finali corrispondenti a leupeptina 10 mM, 1 mM pepstatina A e 10 ng/mL aprotinina.
  4. Per le pendenze di galleggiamento di passaggio, preparare 62%, 39% e 35% di saccarosio soluzioni in imidazolo di 3 mM, pH 7.4, come descritto di seguito. Determinare con precisione la concentrazione finale di tutte le soluzioni di saccarosio usando un rifrattometro.
    1. Preparare 100 mL di soluzione di saccarosio di 62% in imidazolo di 3 mM, pH 7.4. Sciogliere agitando 80,4 g di saccarosio in ddH 2 O pre-riscaldato a 35 ° C. aggiungere 1 mL di soluzione madre di imidazolo di 300 mM e riempimento a 100 mL con ddH 2 O. Adjust il pH 7.4 a 4 ° C. filtro-sterilizzare usando un 0,22 μm filtrante di porosità e archivio a 4 ° C.
    2. Preparare 100 mL di soluzione di saccarosio del 35% in imidazolo di 3 mM, pH 7.4. Sciogliere mescolando 40,6 g di saccarosio in ddH 2 O. aggiungere 1 mL di soluzione di riserva di 300 mM imidazolo e riempire a 100 mL con ddH 2 O. regolare il pH a 7,4 a 4 ° C. filtro-sterilizzare usando un 0.22 μm filtro di dimensione del poro e conservare a 4 ° C.
    3. Preparare 50 mL di saccarosio al 39% in imidazolo di 3 mM, pH 7.4. Diluire la soluzione di saccarosio 62% con la soluzione di saccarosio del 35%. Conservare a 4 ° C.
  5. Sciogliere 3 g di paraformaldeide (PFA) in 100 mL di PBS-pre-warmed a 60 ° C, mentre l'aggiunta di 1 M NaOH goccia a goccia agitando; regolare il pH finale 7.4 usando NaOH. Filtro-sterilizzare utilizzando un filtro di dimensione dei pori di 0.22 μm e conservare a -20 ° C.
    Attenzione: 3% PFA è un reagente tossico.
  6. Soluzione di riserva di preparare 1 M KCl. Sciogliere 3,73 g di KCl per agitazione in 50 mL di ddH 2 utilizzando un filtro di dimensione dei pori di 0.22 μm O. filtro-sterilizzare e conservare a temperatura ambiente.
  7. Soluzione di riserva di preparare 50 X concentrato contenente 0,625 M Hepes pH 7.0 e 75 mm MgOAc 2 di ddH 2 parte aliquota O. e negozio a -20 ° C.
  8. Preparare mezzo di montaggio. Mescolare agitando 2,4 g di poly(vinyl alcohol) M w ~ 31.000 (PVA) con 6 g di glicerolo. Aggiungere 6 mL di ddH 2 O e lasciare per almeno 2 ore a temperatura ambiente. Aggiungere 12 mL di 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) e calore a circa 53 ° C con agitazione occasionale fino a sciolta il PVA.
  9. Chiarire la soluzione mediante centrifugazione a 5.000 x g per 20 min a temperatura ambiente. Raccogliere il surnatante e aggiungere 2,5% (p/v) 1,4 - diazabiciclo-[2.2.2] ottano (DABCO) per evitare il photobleaching durante la rilevazione della fluorescenza. Vortice per circa 30 s a dissolversi. Aliquotare in tubi di plastica da 1,5 mL e conservare a -20 ° C.

2. Coltura di cellule

  1. cellule HeLa di cultura in Dulbecco ' s Modified Eagle Medium supplementato con 10% siero fetale del vitello, 10% non essenziali aminoacidi, 10% L-Glutammina e 1% di penicillina-streptomicina. Mantenerli a 37 ° C in un incubatore di 5% CO 2.
  2. Transfect le cellule 24 h prima dell'esperimento con GFP-RAB5 10, utilizzando il reagente di transfezione commerciale secondo il produttore ' istruzioni s.
  3. Quando necessario, preparare le frazioni endosomal e citosol dalle cellule impoverito di una proteina di interesse (cioè, tramite RNAi o CRISPR/Cas9) e/o che overexpressing forma wildtype o mutante della proteina di interesse.

3. Endosomal frazione preparazione

Nota: il presente protocollo descrive la preparazione semplice di frazioni subcellulari contenente gli endosomi ed altre membrane di luce. Se necessario, le frazioni purificate endosoma possono anche essere usato 11. Preparare 2 piastre di Petri (diametro esterno di 10 cm; 57 cm 2) di cellule confluenti che esprimono GFP-RAB5 come materiale di partenza. Il numero totale di cellule HeLa confluenti in 2 capsule di Petri corrisponde approssimativamente a 2.5 x 10 7 cellule. Quando necessario, gli endosomi può anche essere preparati dalle cellule impoverite di una proteina di interesse (cioè, tramite RNAi o CRISPR/Cas9) e/o che overexpressing forma wildtype o mutante della proteina di interesse, sempre che esprimono GFP-RAB5.

Attenzione: tutti i passaggi del protocollo frazionamento devono essere eseguiti su Ice.

  1. Posizionare le piastre Petri su un di piastra metallico bagnato in un secchio di ghiaccio piatto e lavare immediatamente le cellule due volte con 5 mL di PBS ghiacciata-.
  2. Rimuovere tutti PBS - dall'ultimo lavaggio e aggiungere 3 mL di PBS ghiacciata-per ogni piatto. Le cellule non dovrebbero asciugarsi durante la manipolazione: se necessario, posizionare il secchio di ghiaccio su una piattaforma a dondolo per coprire adeguatamente le cellule con fluido.
  3. Rimuovere meccanicamente le cellule in PBS dai piatti Petri utilizzando un poliziotto di gomma flessibile (cioè, ruspa spianatrice di cella fatti in casa). Raschiare le cellule fuori i piatti in primo luogo in un rapido movimento circolare intorno alla parte esterna del piatto, seguito da un movimento verso il basso al centro del piatto. Raschiare delicatamente per ottenere " fogli " di cellule allegate. Trasferire delicatamente le celle utilizzando una pipetta di Pasteur plastica con un'ampia apertura per un tubo in polipropilene conico di 15 mL su Ice.
  4. Centrifugare per 5 min a 175 x g a 4 ° C.
  5. Delicatamente rimuovere il supernatante (SN) e aggiungere 1-3 mL di HB al pellet. Utilizzando una pipetta di Pasteur plastica con un'ampia apertura, delicatamente Pipettare su e giù una volta per risospendere le cellule.
  6. Centrifuga per 7-10 min a 1.355 x g e 4 ° C. delicatamente togliere il SN.
  7. Eseguire omogeneizzazione cell.
    Nota: Le condizioni dovrebbero essere delicate affinché le membrane plasmatiche delle cellule sono rotte ma gli endosomi rimangono intatti.
    1. Aggiungi un volume noto di HB con inibitori della proteasi sul pellet ogni cella (circa 100 μL a pellet cellulare). Utilizzando una micropipetta di 1.000-µ l, delicatamente Pipettare su e giù fino a quando le cellule sono risospese. Non introdurre bolle d'aria.
    2. Preparare una siringa per tubercolina 1 mL con ago 22G pre-risciacquato con HB e privo di aria o bolle.
    3. Riempire la siringa con la sospensione cellulare relativamente lentamente (per evitare di creare bolle d'aria), posizionare la punta smussata dell'ago contro la parete del tubo ed espellere la sospensione cellulare rapidamente al taglio fuori le membrane plasmatiche delle cellule allegate.
    4. Prendere una piccola aliquota dell'omogenato (circa 3 µ l) e diluirlo in 50 µ l di HB su un vetrino. Mix e coprire con un vetrino coprioggetti. Ispezionare l'omogenato sotto un microscopio a contrasto di fase con un 20x o obiettivo 40x.
      Nota: In condizioni ottimali, la maggior parte delle cellule sono rotta, ma i nuclei, che appaiono come grigio scuro e rotondo strutture, non sono ( Figura 1).
    5. Ripetere il punto 3.7.3 e 3.7.4 fino alla maggior parte delle cellule sono rotti; di solito, sono necessari 3-6 colpi alti e bassi attraverso l'ago. Mantenere una piccola aliquota (10-30 µ l) dell'omogenato per la determinazione della proteina.
  8. Centrifuga omogeneato per 7 min a 1.355 x g e 4 ° C.
    Nota: dopo la centrifugazione, il pellet (definito come la pallina nucleare; NP) contiene i nuclei e il surnatante (definito come il surnatante postnuclear; PNS) contiene il citosol e gli organelli rilasciati all'omogeneizzazione e in libera sospensione.
  9. Raccogliere con cura il PNS. Tenere piccole aliquote (10-30 µ l) del PNS e NP per la determinazione della proteina e scartare il NP.
  10. Regolare il PNS al 40,6% saccarosio diluendo la soluzione di saccarosio 62% con PNS utilizzando un rapporto di 1:1.1 di PNS:62% di saccarosio. Mescolare delicatamente ma a fondo, senza creare bolle d'aria. Controllare la concentrazione di saccarosio utilizzando il rifrattometro.
  11. Posto il PNS a 40,6% saccarosio nella parte inferiore di un tubo di ultracentrifugazione. Overlay attentamente con 2,5 mL di soluzione di saccarosio al 35% e riempire la provetta da centrifuga con HB.
    Nota: Le soluzioni di saccarosio devono essere stratificate affinché le interfacce sono chiaramente visibili.
  12. Ultracentrifuga i gradienti per 1 h a ̴165, 000 x g e 4 ° C.
  13. Rimuovere con attenzione lo strato bianco di lipidi sopra il gradiente. Successivamente, raccogliere l'interfaccia contenente gli endosomi, tra la HB e 35% di saccarosio, utilizzando una micropipetta 200 μL con un taglio punta.
    Nota: Le frazioni di endosomal può essere utilizzate direttamente nell'analisi della polimerizzazione dell'actina in vitro o può essere aliquotati sul ghiaccio, flash-congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C.
  14. Determinare la concentrazione di proteina delle frazioni PNS ed endosomal.
    Nota: Questa concentrazione deve essere almeno 100 µ g/mL. Circa 2,5 x 10 7 cellule sviluppate in 2 capsule di Petri sono necessari per ottenere un PNS con almeno 100 µ g/mL (vedere la nota riportata sopra).

4. Cytosol preparazione

Nota: preparare 2 capsule di Petri (diametro di 10 cm; 57 cm 2) delle cellule HeLa confluenti come materiale di partenza. Quando necessario, il citosol possono essere preparati anche da cellule impoverite di una proteina di interesse (cioè, tramite RNAi o CRISPR/Cas9) e/o che overexpressing una wildtype o la forma mutata della proteina di interesse. Per quanto riguarda il protocollo di frazionamento endosoma, tutti i passaggi devono essere eseguiti su Ice.

  1. Ripetere i passaggi da 3.1-3.8.
  2. Mettere il PNS in una provetta da centrifuga e ultracentrifuga per 45 min a ̴250, 000 x g e 4 ° C.
  3. Attentamente rimuovere lo strato bianco sulla parte superiore e raccogliere la SN (frazione di cytosol) senza disturbare il pellet del microsoma. Mantenere un'aliquota della frazione cytosol per la determinazione della proteina.
    Nota: Il citosol può essere utilizzato direttamente nell'analisi della polimerizzazione dell'actina in vitro o può essere aliquotati sul ghiaccio, flash-congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C.
  4. Determinare la concentrazione di proteine del citosol.
    Nota: Dovrebbe essere almeno 3 mg/mL.

5. Analisi di misurazione endosoma dipendente dalla polimerizzazione dell'actina In Vitro

Nota: polimerizzazione dell'actina Endosome-dipendente può essere eseguita utilizzando due approcci alternativi. Nel primo approccio, i materiali sono mescolati in una provetta, fisso e trasferiti a un vetrino coprioggetto e analizzati. Nel secondo approccio, descritto qui, il dosaggio può essere effettuato direttamente nella camera di imaging e può essere risolto e analizzato senza perturbazione meccanica ( Figura 2). In questo secondo approccio, la miscela di analisi non viene trasferita da una provetta di un vetrino coprioggetto e così rimane imperturbata, diminuendo il pericolo delle reti di F-actina fisicamente essere perturbato durante il trasferimento. Inoltre, questo secondo approccio è compatibile con un'analisi time-lapse di polimerizzazione di F-actina. Va notato che nessuna differenza nell'analisi della polimerizzazione di F-actina è stata osservata con entrambi gli approcci.
Nota: Uso tagliata punte in tutto il protocollo.

  1. In una provetta
    1. delicatamente mix ghiacciata purificata GFP-RAB5 endosomi (passaggio 3) con citosol (passaggio 4) con un rapporto di 01:10 (concentrazione proteica) in una provetta conica ghiacciata 1,5 mL.
      Nota: Un tipico esperimento effettuato con circa 40-50 µ l.
    2. Regolare la miscela di reazione ghiacciata a concentrazioni finali di 125 mM KCl (utilizzando la soluzione di riserva del KCl 1m), 12,5 mM Hepes e 1,5 mM MgOAc 2 (utilizzando il 50 x soluzione di riserva). Quindi, regolare la miscela con gli inibitori di proteasi a concentrazioni finali di 10 mM leupeptina e pepstatina 1 mM A 10 ng/mL aprotinina. Mescolare delicatamente tutti i componenti.
    3. Mettere la provetta contenente la miscela di reazione a 37 ° C, senza agitarli e incubare per il tempo desiderato.
      Nota: In genere, ci vorranno circa 3 minuti per rilevare la polimerizzazione dell'actina su endosomes e 30 min per la formazione di una vasta rete.
    4. Al momento desiderato (cioè, 3 min o 30 min), fermare la reazione ponendo la provetta sul ghiaccio e aggiungere 1/10 (soluzioni) della soluzione PFA 3% preraffreddata.
    5. Aggiungere 0.3:10 (soluzioni) di 200 unità/mL (~6.6 μM) falloidina coniugata di colorante rosso-arancione per l'actina polimerizzata.
    6. Posto 12 µ l della miscela sul 12 μL di mezzo di montaggio PVA su un vetrino micro. Mettere un piano in coverslipon vetro 2 18x18 mm.
    7. Analizzare il campione con microscopia confocal.
  2. Nella camera di imaging
    1. per rendere microscopico imaging chambers, utilizzare plasma pulitore per 1 min per pulire un vetrino coprioggetto rotondo diametro 18 mm e un diametro tondo 35 mm dotato di un fondo di vetro di 20 mm di Petri (0.16-0.19 mm).
    2. Incubare le superfici pulite con 1% β-caseina per 20 min per ridurre al minimo il legame alle proteine al vetro. Lavare due volte con imidazolo di 3 mM.
    3. Aggiungi endosoma e citosol, nello stesso dosaggio miscela come nei passaggi 5.1.1 e 5.1.2, in una provetta da 1,5 mL preraffreddato e completano la miscela di analisi con 0,1 μg/μL rodamina-actina.
    4. Regolare l'indice di rifrazione finale della miscela di 1.375 (26,5% saccarosio) utilizzando la soluzione di saccarosio al 39%.
      Nota: In genere, il volume stesso viene aggiunto; Tuttavia, questo deve essere empiricamente ri-regolato a seconda della concentrazione di saccarosio della frazione raccolta, determinata utilizzando un refractomer, poiché la concentrazione di saccarosio può variare leggermente da esperimento a esperimento.
    5. Mettere il composto sul piatto da 35 mm pretrattato (punto 5.2.1) e coprirlo con il coprioggetto 18 mm pretrattato (punto 5.2.1).
    6. Posizionare la camera a 37 ° C, senza agitarli.
    7. Analizzare il campione mediante microscopia confocale a fluorescenza.

6. Immagine Acl'acquisizione e analisi di actina rete

  1. acquisizione immagine
    1. acquisire le immagini su un microscopio confocale scansione invertito.
      Nota: Le impostazioni di acquisizione di immagine sono state ottimizzate per un microscopio confocale scansione invertito con un obiettivo di olio NA 63 X 1,25. Regolare la potenza del laser (solitamente intorno 50%) per ottenere un buon rapporto segnale-rumore.
  2. Quantificazione della rete actina
    1. analizzare le micrografie fluorescente. Utilizzare il software opensource CellProfiler (v 2.1.1) 12 per misurare la quantità di actina per endosoma (software alternativo può essere utilizzato).
      1. In primo luogo, identificare gli endosomi come oggetto primario utilizzando il segnale di GFP-RAB5. Quindi, quantificare la F-actina associato con gli endosomi individuali utilizzando la propagazione del segnale dell'actina (rosso-arancio colorante coniugato falloidina) come un oggetto secondario.
      2. Medio e normalizzare il numero del materiale associato per ogni oggetto per la condizione di controllo.

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Risultati

Per approfondire la formazione di patch di F-actina sulle membrane endosoma precoce, abbiamo seguito il protocollo descritto nella Figura 2. Brevemente, le cellule sono state trasfettate con GFP-RAB5 e quindi gli endosomi precoce sono stati preparati da frazionamento subcellulare. Questi purificato endosomi precoce sono stati incubati con citosol al fine di fornire l'actina stessa, nonché altri fattori probabilmente coinvolti nella reazione. Alla fine del per...

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Discussione

Actina svolge un ruolo cruciale nell'endosoma membrana dinamica4,14. Precedentemente abbiamo segnalato che la polimerizzazione e actina nucleazione verificarsi su early endosomes, formando piccole patch di F-actina o reti. Queste reti di F-actina sono assolutamente necessari per il trasporto di membrana oltre early endosomes lungo la via di degradazione. Interferire in ogni fase di questo processo di nucleazione e polimerizzazione previene endosoma maturazione e ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

Supporto è stato ricevuto da Swiss National Science Foundation; il programma svizzero Sinergia; il polacco-Swiss ricerca programma (PSPB-094/2010); il PRN in biologia chimica; e LipidX dall'iniziativa Svizzera SystemsX.ch, valutati da Swiss National Science Foundation (di J. G.). O. M. è stato sostenuto da una borsa di studio a lungo termine dell'EMBO (ALTF-516-2012).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
NaClSigma-Aldrich71380
KClAcros Organics196770010
KH2PO4AppliChemA1042
Na2HPO4Acros Organics424370025
HepesAppliChemA3724
Magnesiun acetato tetraidratoFluka63047
Ditiotreitolo (DTT)AppliChemA2948
ImidazoleSigma-Aldrich10125
NaOHFluka71690
SaccarosioMerck Millipore107687
LeupeptinRoche11017101001
PepstatinaRoche10253286001
AprotininaRoche10236624001
ParaformaldehidePolysciences. Inc380
Alexa Fluor 555 falloidinaSonde molecolariA34055
Actina rodaminaCitoscheletro. IncAPHR-A
Mowiol 4-88Sigma-Aldrich81381poli(alcool vinilico), Mw ~31 000
DABCOSigma-AldrichD-2522
Tris-HClAppliChemA1086
β-caseinaSigma-AldrichC6905
Filtro 0.22 μ mMillexSL6V033RS
Piastre rotonde da 10 cm per colture cellulariThermo Fisher Scientific150350
Pipetta Pasteur in plasticaAssistent569/3 40569003
Provetta in polipropilene da 15 mlTPP91015
Ago ipodermico 22G Nero 30mmBD Microlance300900
Siringhe Luer-slip sterili da 1 ml senza agoBD Plastipak300013
Micro vetriniAssistent2406
vetrino coprioggetti in vetro 18 x 18 mm ProvvistaAssistent1000/1818
SW60ColtroBeckman 344062
Provetta da centrifuga TLS-55Coltro Beckman343778
200-μ L punta giallaStarlabS1111-0706
1.000-μ L Punta graduata bluStarlabS1111-6801
Provetta da 1,5 mlAxygenMCT-175-C 311-04-051
Vetrino coprioggetti rotondo da 18 mm di diametroAssistent1001/18
Piatto rotondo da 35 mm di diametro con fondo in vetro da 20 mm (0,16 - 0,19 mm)Rifrattometro in vitro ScientificD35-20-1,5-N
Carl Zeiss79729
Pulitore al plasmaHarrick PlasmaPDC-32G
Sorvall WX80 UltracentrifugaThermo Fisher Scientific46900
Ultracentrifuga da tavoloColtro BeckmanTL-100
SW60 rotoreColtro Beckman335649
rotore TLS-55Coltro Beckman346936
Microscopia confocaleCarl ZeissLSM-780
Fugene HD reagente di trasfezionePromegaE2311
Reagente per il dosaggio delle proteine ABio-Rad500-0113
Reagente per il dosaggio delle proteine BBio-Rad500-0114
Reagente per il dosaggio delle proteine SBio-Rad500-0115
Raschietto cellularefatto in casaPezzo di gomma siliconica di circa 2 cm, tagliato ad angolo molto acuto e fissato ad una barra metallica o tenuto con una pinza
RifrattometroCarl Zeiss
Minimum Essential Medium Eagle (MEM)Sigma-AldrichM0643
FCSThermo Fisher Scientific10270-106
MEM Aminoacidi Non Essenziali (NEAA)Thermo Fisher Scientific11140-035
L-GlutamminaThermo Fisher Scientific25030-024
Penicillina-StreptomicinaThermo Fisher Scientific15140-122
Misuratore di pH 691Metrohm
ImageJ softwareNIH, Bethesda MD
da centrifuga

Riferimenti

  1. Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).
  2. Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
  3. Puthenveedu, M. A., et al. Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains. Cell. 143 (5), 761-773 (2010).
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