Visualizzazione del modello di proiezione Axonal dei motoni embrionali in Drosophila

Summary

Questo lavoro descrive un metodo immunohistochemistico standard per visualizzare le proiezioni dei neuroni motori degli embrioni di Drosophila melanogaster a tarda fase 16. La preparazione filettata di embrioni fissi macchiati con FasII anticorpo fornisce un potente strumento per caratterizzare i geni richiesti per la ricerca del percorso dell'assone motore e il riconoscimento del bersaglio durante lo sviluppo neurale.

Abstract

La creazione di circuiti neuromuscolari funzionali si basa su precisi collegamenti tra assoni motori in sviluppo e muscoli target. I neuroni motori estendono i coni di crescita per navigare lungo percorsi specifici rispondendo a un gran numero di segnali di guida dell'assone che emanano dall'ambiente extracellulare circostante. Il riconoscimento del bersaglio di cono di crescita inoltre svolge un ruolo fondamentale nella specificità neuromuscolare. Questo lavoro presenta un protocollo immunohistochemistico standard per visualizzare le proiezioni dei neuroni motori degli embrioni di Drosophila melanogaster a tarda fase 16. Questo protocollo comprende alcuni passaggi chiave, tra cui una procedura di genotipizzazione, per ordinare gli embrioni mutanti desiderati; Una procedura di immunostaining, per etichettare gli embrioni con l'anticorpo fasciclin II (FasII); E una procedura di dissezione, per generare preparazioni filettate da embrioni fissi. Le proiezioni dell'assone motorio e le forme muscolari della periferia sono molto meglio visualizzate in preparazioni piatte di embrioni di filetti che in whOle-mount embrioni. Pertanto, la preparazione filettata di embrioni fissi macchiati con FasII anticorpo fornisce un potente strumento per caratterizzare i geni richiesti per la ricerca del percorso dell'assone motore e il riconoscimento del bersaglio e può anche essere applicato sia a schermi genetici di perdita di funzionalità e di guadagno di funzionalità .

Introduction

Collegamenti precisi e selettivi tra gli assi del motore e i muscoli target durante lo sviluppo embrionale sono essenziali per la normale locomozione nelle larve Drosophila . Il pattern embrionale di 30 fibre muscolari in ciascuno dei due emisegmenti addominali A2-A7 è stabilito dalla fase 16 ¹ . I 36 neuroni motori generati nel cavo del nervo ventrale estendono gli assoni nella periferia per innervare i muscoli specifici ² . Il percorso dell'assonamento del motore e il riconoscimento del bersaglio possono essere visualizzati mediante immunohistochemistry con un anticorpo (anticorpo monoclonale del mouse 1D....

Protocol

1. Preparazione

1. Preparare 500 ml di soluzione fisiologica tamponata (PBS) con la soluzione di t-Octilfenossipolietossietanolo (PBT) aggiungendo 0,5 g di albumina bovina serum (BSA) e 0,5 ml di t-Octilfenossipolietossietanolo (vedere tabella dei materiali) a 500 ml di 1X PBS E mescolando per almeno 30 minuti. Conservare a 4 ° C. Utilizzare quando è relativamente fresco e conservare la soluzione in una bottiglia pulita.
2. Preparare 10 ml di 4% di paraformaldeide aggiungendo 2,5 ml di soluzione di paraformaldeide di riserva del 16% e 1 ml di 10 volte PBS a 6,5 ​​ml di acqua deionizzata. Conservare a 4 ° C e utilizzare entro una settimana.
   ATTEN....

Results

Le connessioni precise tra gli assi del motore e i muscoli del bersaglio durante lo sviluppo neurale dipendono dalla repulsione selettiva dell'assone-axone e dal riconoscimento dei bersagli in punti specifici ⁴ . In Drosophila , la repulsione selettiva tra gli assoni motori è parzialmente regolata dall'azione combinata dei semafori di classe 1 e 2 (Semas), inclusi Sema-1a, Sema-2a e Sema-2b ^{8 , 14}.......

Discussion

I dettagli dei difetti di guida dell'assone motorico sono segnati più velocemente e con maggiore precisione dalla preparazione filettata di embrioni macchiati da DAB che dalla scansione laser di microscopia confocale di etichette fluorescenti. Pertanto, la preparazione filettata di embrioni fissi e 1D4 è più adatta per la caratterizzazione funzionale delle molecole di cue di guida. Quattro grandi classi di indici di orientamento, compresi i netrini, i fessure, i semafori (Semas) e le efrine e i loro recettori cognat.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumina sierica bovina	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-Ottilfenossipolietossietossietanolo
16% Soluzione di paraformaldeide	Ted Pella	18505
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S5886
Cloruro di potassio	Sigma-Aldrich	P5405
Fosfato di sodio bibasico	Sigma-Aldrich	30435
Fosfato di sodio Monobasico	Sigma-Aldrich	71500
X-Gal Substrato	US Biological	X1000	X-GAL (5-Bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galattoside galattopiranoside)
Dimetil solfossido	Sigma-Aldrich	D4540
Cloruro di magnesio	Sigma-Aldrich	M8266
Esacianoferrato di potassio (II) triidrato	Sigma-Aldrich	P9387
Esacianoferrato di potassio (III)	Sigma-Aldrich	244023
Perossido di idrogeno	Sigma-Aldrich	216763
3,3'-diaminobenzidina Tetracloridrato	Sigma-Aldrich	D5905
Agar	US Biological	A0930
Saccarosio	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (Methy 4-idrossibenzoato)	Sigma-Aldrich	H5501
Piatto di coltura (60 mm)	Corning	430166
Bicchiere Tricon	Simport	B700-100	Questo viene utilizzato per realizzare una gabbia di plastica per la raccolta di embrioni.
Lievito	Société Industrielle Lesaffre	Saf Lievito istantaneo
(Cotone a punta singola in legno PK100)	VWR	14220-263
Eppendorf Tube (1,5 ml)	Sarstedt	#72.690
Candeggina	The Clorox Company	Clorox
Heptane	Sigma-Aldrich	246654
Metanolo	J.T. Baker	UN1230
Normal Goat Serum	Life Technologies	16210-064
Anticorpi anti-FasciculinII	Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi	1D4 Anti-Fasciclin II
di capra Anticorpo anti-topo-HRP	Jackson Immunoresearch	115-006-068	AffiniPure F(ab')2 Frammento di capra Anti-topo IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glicerolo	Sigma-Aldrich	G9012
Vetrino Duran	Gruppo	235501403
Vetrino coprioggetti	Duran Gruppo	235503104	18 x 18 mm
1 ml Siringa	Becton Dickinson Medical(s)301321
Ago di tungsteno	Ted Pella	#27-11	Filo di tungsteno, ø 0,13 mm/6,1 m (ø. 005"/20 piedi)
Nutator (Mini twister)	Scienza coreana	KO. VS-96TWS	In alternativa, BD Clay Adams marca Nutator (BD 421125)