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Articolo metodologico

In Vitro Dosaggio di bioluminescenza per caratterizzare il ritmo circadiano in cellule epiteliali mammarie

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DOI:

10.3791/55832

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28 settembre 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental and Occupational Health, School of Public Health, NIEHS Center for Environmental Exposures and Disease, Environmental and Occupational Health Sciences Institute, Rutgers University, 2Veterinary Drugs & Biologics Division, Animal and Plant Quarantine Agency

In questo articolo

Sommario

Un'analisi di bioluminescenza in vitro per determinare il ritmo circadiano cellulare in cellule epiteliali mammarie è presentata. Questo metodo utilizza plasmidi di reporter di cellule di mammifero che esprimono destabilizzato luciferasi sotto il controllo del promotore del gene di periodo 2 . Può essere adattato ad altri tipi di cella per valutare gli effetti di organo-specific il ritmo circadiano.

Abstract

Il ritmo circadiano è un processo fisiologico fondamentale presente in tutti gli organismi che regola i processi biologici che vanno dall'espressione genica di dormire comportamento. Nei vertebrati, ritmo circadiano è controllato da un oscillatore molecolare che funziona sia nel nucleo soprachiasmatico (SCN; centrale dello stimolatore cardiaco) e singole celle che comprende tessuti più periferici. Più importante, la rottura del ritmo circadiano di esposizione alla luce di notte, fattori di stress ambientale e/o sostanze tossiche è associata a un aumentato rischio di malattie croniche e l'invecchiamento. La capacità di identificare gli agenti che possono interferire con orologi biologici centrali e/o periferici e gli agenti che possono impedire o attenuare gli effetti della perturbazione circadiana, ha implicazioni significative per la prevenzione delle malattie croniche. Anche se i modelli del roditore possono essere utilizzati per identificare le esposizioni e gli agenti che inducono o prevenire/ridurre la rottura circadiana, questi esperimenti richiedono un numero elevato di animali. In vivo gli studi inoltre richiedono infrastrutture e risorse significative e i ricercatori a lavorare tutta la notte. Così, c'è un urgente bisogno di un sistema appropriato in vitro di cellula-tipo di schermo per ambientali interferenti circadiani e rinforzatori in tipi cellulari da diversi organi e Stati di malattia. Abbiamo costruito un vettore che guida la trascrizione della luciferasi destabilizzato in cellule eucariotiche, sotto il controllo del promotore del gene umano di periodo 2 . Questa costruzione del reporter circadiano era trasfettata stabilmente in cellule epiteliali mammarie umane e cellule circadiano reattivo reporter sono state selezionate per sviluppare il saggio in vitro bioluminescenza. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per stabilire e convalidare il dosaggio. Forniamo ulteriori dettagli per prova degli esperimenti di concetto che dimostra la capacità della nostra analisi in vitro di ricapitolare gli effetti in vivo di vari prodotti chimici sul cellulare orologio biologico. I risultati indicano che il dosaggio può essere adattato ad una varietà di tipi cellulari per lo screening sia ambientali interferenti e chemopreventive esaltatori di orologi circadiani.

Introduzione

L'orologio circadiano regola una vasta gamma di processi biologici da diurni espressione dei geni per dormire il comportamento in un ritmo prevedibile con una periodicità di circa 24 h. epidemiologico gli studi suggeriscono fortemente che rottura cronica del circadiano ritmo aumenta il rischio di cancro al seno e alla prostata nei turnisti, tra cui gli infermieri e gli equipaggi di volo1,2,3. Questi risultati sono confermati dagli studi del roditore, che dimostrano che l'esposizione a cicli di luce di notte, o luce di luce costante, che imitano il jet lag aumento l'incidenza del tumore e accelera la crescita del tumore4,5. Basato su dati provenienti da studi sia umani e del roditore, l'Agenzia internazionale per ricerca sul cancro classificati turni di lavoro come agente cancerogeno umano probabile (tipo 2A) in 20106.

Precedentemente, abbiamo dimostrato che una singola dose cancerogena dell'agente cancerogeno specifico tumore mammario, N- nitroso-N- methylurea (NMU), interrotto l'espressione circadiana dei principali geni circadiani (CGs) (ad es., periodo 2 , Per2) e parecchi geni circadiani controllato (GCC), tra cui chiave reattivo il danno del DNA e ripristino geni (DDRR) nella ghiandola mammaria di destinazione (ma non nel fegato). Inoltre, reimpostare l'espressione circadiana dei geni sia Per2 e DDRR verso il normale da un regime chemopreventive dell'alimentari L-metil-selenocisteina (MSC) ha ridotto l'incidenza del tumore del 63%. Questi risultati sono stati i primi a mostrare un collegamento meccanicistico tra ritmo circadiano, carcinogenesi chimica e chemoprevention7,8. Esposizioni verso altri tossici ambientali indicate per interrompere gene circadiano espressione in vivo inoltre sono associate con un rischio aumentato di malattie ambientali9,10. La comprensione dei meccanismi che collegano la rottura circadiana di tossici ambientali e patogenesi può portare a meccanicistico approcci alla prevenzione della malattia. Tuttavia, gli studi volti a definire le interazioni tra le esposizioni e ritmo circadiano sono di solito eseguite in vivo. Un tipico in vivo esperimento studiando che l'impatto sul ritmo circadiano richiede grandi quantità di animali, tessuti da almeno tre di controllo e tre animali esposti devono essere raccolti ogni 3-4 ore su un periodo di 24 o 48 h. Sviluppo di un sistema convalidato in vitro che ricapitola in vivo osservazioni e meccanismi sarebbe quindi non solo riducono il numero di animali necessari, ma anche drasticamente ridurre i costi sperimentali e il requisito che i ricercatori lavorano continuativamente per un periodo di 24-48 h. Inoltre, un sistema convalidato in vitro potrebbe essere usato per screening su vasta scala di composti e/o alterazioni genetiche che influenzano il ritmo circadiano, o la sua risposta a fattori di stress ambientale o sostanze tossiche. Pertanto, la combinazione strategica di modelli in vitro e in vivo e gli esperimenti sono necessari per ottenere diverse intuizioni con diversa attenzione.

Nei mammiferi, oscillatori circadiani esistano non solo nei neuroni specializzati del SCN, ma anche in diversi tipi di cellule più periferiche. Questi orologi molecolari sono simili a quelli nelle linee cellulari stabilite del fibroblasto e nei fibroblasti primari da embrioni o animali adulti; Tuttavia, c'è una necessità per tessuto modelli cellulari di tipo-specific11. Di conseguenza, gli studi tradizionali di attività locomotrice in vivo, SCN espianti ex vivoe saggi basati su cellule in vitro in cellule immortalizzate del fibroblasto sono ampiamente usati per studiare i difetti circadiani cella-autonoma. Tuttavia, non ci sono prove che indicano che un in vitro dei fibroblasti basati su cellule test può ricapitolare meccanismi circadiani e risposte presentano in cellule di altri organi periferici in vivo. Diversi tipi di cellule possono avere modelli distinti di espressione genica, metabolismo xenobiotico e DDRR, e i legami tra tossicità ed espressione genica circadiana possono essere cellula-tipo specifico e/o modulata da diversi parametri fisiologici. Inoltre, oscillatori circadiani nei sistemi basati su fibroblasti non sono stati completamente valutati per risposte a tossici ambientali, fattori di stress e agenti preventivi che collegano le esposizioni ai meccanismi di prevenzione e lo sviluppo della malattia. Così, c'è una necessità per facile, convalidato cellula-tipo specifico, le analisi in vitro bioluminescenza per studiare gli interferenti circadiano ambientali specifici di organo. Anche se una varietà di modelli di orologio cellulare (ad es., nel fegato, cheratinociti e le cellule di grasso, nonché una linea di cellule di osteosarcoma) sono state sviluppate in anni recenti12,13,14, 15, il dosaggio descritto qui è il primo modello di orologio cellulare in cellule epiteliali del seno e la prima dimostrazione in vivo risposte a fattori di stress ambientale, sostanze tossiche, farmaci e agenti chemopreventive di ricapitolare.

Renilla luciferasi (rLuc) e luciferasi firefly 30-61 kDa proteine monomeriche che non necessitano di posttranslational elaborazione dell'attività enzimatica e possono funzionare come un reporter genetico immediatamente dopo la traduzione. Una volta che il substrato si associa con l'enzima luciferasi, la reazione biochimica catalizzata genera un lampo di luce. Così, la luciferasi costrutti sono ampiamente usati come espressione gene reporter sistema in vitro e in vivo. Tuttavia, negli studi di ritmo circadiano, l'utilità del reporter di luciferase è limitato il tempo di dimezzamento relativamente lunga della proteina luciferasi (T1/2 = h 3,68) relativa al periodo (soprattutto per il breve periodo) per mutazioni nel gene circadiano espressione; Tuttavia, numerosi studi nel corso degli anni hanno utilizzato con successo il gene della luciferasi nel vettore pGL3, che indica che la luciferasi rapidamente degradabile potrebbero non essere necessario per aver segnalato i ritmi circadiani, soprattutto per i ritmi con un periodo più lungo, come 24 h. Pertanto, un reporter del utilizzando il vettore di luciferasi destabilizzato, pGL [Luc2P/Neo], che contiene hPEST (una sequenza di destabilizzazione della proteina) è stato sviluppato, che ci permette di usarlo come un vettore reporter circadiano per nostra attuale in vitro analisi di bioluminescenza. La proteina codificata da Luc2P ha una molto più breve emivita (T1/2 = 0,84 h) e quindi, risponde più velocemente e con un ordine di grandezza maggiore ai cambiamenti nell'attività trascrizionale che il selvaggio-tipo, hoSPI che può essere utilizzato per monitorare l'espressione ritmica della luciferasi regolato dal promotore PER2 con precisione in tempo reale16.

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Protocollo

1. costruzione del PER2 promotore guidato destabilizzato Luciferase Reporter vettore

  1. acquistare un oggetto personalizzato pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vettore che contiene il cDNA codificante rLuc e umani Frammento di promotore PER2 (hPER2P, 941 bp) presso il sito tra Sac I e Hind III a clonazione più regione 17.
  2. Tagliare il frammento di promotore PER2 umano (hPER2P, 941 bp) fuori dal vettore. Buffer di enzima di restrizione
    1. aggiungere 2,5 µ l, 10 µ l (180 ng) pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vettore e 1 µ l di enzimi di restrizione, Sac I (10 unità / µ l) e Hind III (10 unità / µ l), in un DNA/RNA/nucleotide-gratuito tubo del microcentrifuge. Aggiungere acqua ultrapura (10,5 µ l) fino a 25 µ l e mescolare dolcemente pipettando.
    2. Incubare a 37 ° C per 90 min in un blocco di riscaldamento.
    3. Eseguire l'intero volume (25 µ l) della reazione degli enzimi di limitazione su gel di agarosio di 0,7% contenente 0,0001% etidio bromuro (EtBr) per separare il hPER2P dal vettore.
      Nota: EtBr, bromuro di 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium (numero di registrazione di CAS: 1239-45-8), è un liquido inodore rosso. È un agente intercalante che è comunemente usato come un fluorescente tag (colorante acido nucleico) nell'elettroforesi del gel di agarosio e visibile come un colore arancione sotto la luce UV. Possibili rischi di effetti mutageni irreversibili si sono verificati in animali da esperimento, anche se nessuno degli enti regolatori Classificato come un agente cancerogeno 18. Di conseguenza, abbiamo raccolto agarosio utilizzato gel ed elettroforesi tampone contenente EtBr come rifiuti rischio chimico e richiesto da Rutgers Environmental Health & sicurezza (REHS) per raccogliere e smaltire in modo sicuro.
    4. Tagliare un pezzo di gel di agarosio contenente una banda di fluorescenza di EtBr a 941 bp e purificare i frammenti hPER2P dal gel con un kit di estrazione del DNA gel, seguito da quantificazione su uno spettrofotometro misurando la densità di assorbimento (OD) a 260 Nm.
  3. Linearizzare 1,0 µ l (1 µ g) del vettore di espressione destabilizzato firefly luciferase, pGL [Luc2P / Neo] con lo stesso metodo come descritto nella procedura 1.2.1-1.2.2. Estrarre il vettore con un kit di pulizia del DNA seguito da quantificazione come descritto in precedenza utilizzando uno spettrofotometro.
  4. Legare il hPER2P nel vettore linearizzato pGL [Luc2P / Neo].
    Nota: Per il produttore ' s instruction, l'ideale rapporto molare di inserto e vettore è 2:1. Per vettore di ng 50, la quantità ideale di inserimento viene calcolata come 23,6 ng con una formula, [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242 kb vettoriale] x (2/1) = 23,6 ng inserto]. Basato sulle concentrazioni di hPER2P (7,26 ng / µ l) e pGL [Luc2P / Neo] (50 ng / µ l), i volumi di 50 ng pGL [Luc2P / Neo] e 23,6 ng hPER2P sono calcolati come 1 µ l e 3,26 µ l, rispettivamente. Reazione di
    1. ligasi del DNA T4 di aggiungere 2 µ l tampone (10 X) (50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl 2, 1mm ATP e 10 mM DTT), 3,26 µ l (23,6 ng) hPER2P, 1 µ l (50 ng) pGL [Luc2P / Neo], e 13,74 µ l acqua fino a 20 µ l , mescolare delicatamente.
    2. Aggiungere 1 µ l T4 DNA ligasi (400 unità / µ l), mescolare delicatamente e incubare a 16 ° C durante la notte in un termociclatore e poi raffreddare il vettore legato sul ghiaccio per il produttore ' Istruzione s.
  5. Trasformare il vettore dei pGL [hPer2P / Luc2P / Neo] a chimicamente competente Escherichia coli 19.
    1. Impostare il bagno di acqua a 42 ° C, scaldare il brodo ottimale Super con il mezzo di repressione (S.O.C) dei cataboliti (2% Tryptone, 0,5%, Estratto di lievito, 10 millimetri di NaCl, 2.5 mM KCl, 10mm MgCl 2, 10mm MgSO 4 e 20 millimetri di glucosio) a temperatura ambiente , riscaldare la piastra di agar Luria-Bertani (LB) (contenente 100 µ g/mL ampicillina, 80 µ g/mL X-gal e 0,5 µM IPTG), in incubatore a 37 ° C e scongelare su ghiaccio un flaconcino di competente Escherichia coli cellule per ogni trasformazione.
    2. Aggiungere 6 µ l (21 ng) legato 1 µ l o vettoriale (30 ng) vettore (controllo negativo) per un tubo di chimicamente competenti Escherichia coli (50 µ l) vuoto e poi capovolgere delicatamente il tubo per mescolare. Incubare in ghiaccio per 30 min.
    3. Heat shock in bagnomaria a 42 ° C per 30 s senza agitazione e poi tornare alla Ice.
  6. Selezionare una colonia di Escherichia coli trasformata con un vettore dei utilizzando lo screening blu/bianco.
    1. Medie aggiungere 250 µ l S.O.C il trasformato e. coli tube e incubare per 1h a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min.
    2. Si è diffusa in modo uniforme 10-50 µ l di trasformato Escherichia coli sulla superficie della piastra di agar LB. Mettere la piastra capovolta in incubatore a 37 ° C durante la notte.
      Nota: Una reazione efficiente clonazione dovrebbe produrre diverse colonie di centinaia. Due diversi volumi di placcatura è consigliata per garantire che almeno un piatto avrà colore chiaro grande, bianco o blu e le colonie ben distanziati. Quando le colonie sono troppo piccole e il colore non è distinguibile, utilizzando un microscopio (10 X o 50 X) è disponibile.
    3. Pick 3-6 colonie bianchi dalle piastre con dente sterilizzato bastoni e rilasciare ogni colonia nel tubo una cultura contenente 4 mL di terreno di coltura LB con ampicillina di 50 µ g/mL.
    4. Incubare le provette a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min durante la notte. Estrarre il DNA con 2 mL di 4 mL coltivate con un plasmide DNA estrazione mini prep kit per il fabbricante l'e. coli ' Istruzione s.
  7. Verificare e analizzare l'inserto (hPER2P, 941 bp)
    1. digerire il DNA del plasmide con enzimi di restrizione ed eseguire l'elettroforesi come descritto nella procedura 1.2.1-1.2.3 per confermare se c'è un inserto.
      Nota: Controllo positivo (hPER2P purificato al punto 1.2.4) e controllo negativo (e. coli trasformate con un vettore vuoto) sono stati inclusi.
    2. Sequenza DNA plasmidico selezionato utilizzando M13 in avanti ed iniettori d'inversione M13 per confermare l'orientamento e la sequenza di inserto a plasmide 19.
      Nota: Solo una colonia che aveva un inserto con la dimensione corretta del hPER2P in elettroforesi e corretto orientamento e sequenza nel risultato sequenziamento è stato selezionato.
    3. Analizzare il frammento di promotore PER2 umano (hPER2P, 941 bp) di sequenza per gli elementi normativi circadiani, tra cui motivi di E-box (un sito di legame di Bmal1, CAT/CGTG), CCAATC, GC box e trascrizione start sito (CAGCGG) 20.
  8. Amplifica il selezionato Escherichia coli aggiungendo il rimanente da 2 mL coltivato Escherichia coli in mL 200 LB terreno di coltura contenente ampicillina di 50 µ g/mL e poi incubazione durante la notte, a 37 ° C con agitazione a 200 giri/min.
  9. Estrarre DNA con un maxi privo di endotossina plasmide prep kit per ogni il produttore ' Istruzione s e quindi di quantificarlo misurando OD a 260 Nm con uno spettrofotometro. Aliquotare e archivio il DNA del plasmide, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo], in congelatore a-80 ° C per un uso futuro.

2. Trasfezione transiente

  1. acquisto e coltura di cellule di MCF10A
    1. acquisto un'immortalizzate, non trasformate normale umano linea cellulare epiteliale mammaria (MCF10A) da un commerciale di banca di cellule, dove le cellule sono citogeneticamente testato e autenticato con breve ripetizione in tandem analisi prima del congelamento. Scongelare e mantenere ogni flaconcino di cellule congelate in coltura per un massimo di 8 settimane.
      Nota: A differenza di altre cellule, queste cellule hanno inibizione da contatto una volta che ottengono alla confluenza di ~ 70%. Richiede quella sottocultura avviene a circa il 70%.
    2. Della coltura le cellule con il mezzo di crescita delle cellule epiteliali mammarie (MEGM), che contiene la sostanza basale epiteliale mammaria (MEBM), supplementi di crescita e tossina del colera in un'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C, umidità 95% e 5% CO 2.
      Nota: Acquisto di fattori di crescita di ready-to-use forniti in SingleQuot (SQ) e ottenere la tossina del colera separatamente. Le concentrazioni finali dei supplementi di crescita sono bovina estratto pituitario 0,4%, 0,1% insulina, idrocortisone 0.1%, 0,1% fattori di crescita epidermico umano, tossina del colera di 100 ng/mL e 0.05% gentamicina solfato e 0.05% amfotericina B.
    3. Dissociare le cellule nella piastra di coltura di 10 cm di incubazione con 10 mL di tripsina/EDTA per ~ 20 min e quindi neutralizzare la tripsina aggiungendo tripsina 10ml soluzione neutralizzante. Raccogliere tutte le celle con HEPES buffer soluzione salina (HBSS).
    4. Contare le celle con un emocitometro sotto un microscopio invertito e calcolare la concentrazione della sospensione unicellulare e seme poi un certo numero di cellule, come necessario. Agitare le piastre accuratamente per ottenere una distribuzione uniforme delle cellule in ogni piatto. Incubare le cellule nell'incubatore di cultura cellulare a 37 ° C, umidità 95% e 5% CO 2.
      Nota: Acquistare una confezione di reagenti di sottocultura contenente tripsina/EDTA, soluzione neutralizzante tripsina e HBSS utilizzare.
  2. Transitori di transfezione delle cellule con il vettore circadiano costruito.
    1. Seme 2 x 10 5 MCF10A cellule uniformemente in 35mm coltura piatto con MEGM e crescere fino a 20-30% confluenza (giorno successivo).
      2. Media del siero
    2. warm up ridotto (ad es., Opti-MEM) a 37 ° C acqua vasca e transfezione reagente a temperatura ambiente per 30 min. Diluire il plasmide DNA costruito (pGL [hPer2P / Luc2P / Neo]) a 30 ng / µ l con endo-tossina libera Tampone Tris-EDTA (TE) e tenerlo a temperatura ambiente.
    3. Preparare la miscela di transfezione del plasmide in una microcentrifuga da 1,5 mL aggiungendo 63,6 µ l siero riduttore caldo media prima, quindi l'aggiunta di DNA del plasmide (0,1 µ g) µ l 33,4 e mescolare delicatamente il pipettaggio, e infine aggiungendo 3 µ l di transfezione reagente direttamente nel centro del tubo senza toccare la parete. Dopo la miscelazione dolcemente pipettando, conservare a temperatura ambiente per 30 min.
    4. Cadere l'impasto intero plasmide (100 µ l) direttamente sulla superficie del centro del mezzo nel piatto e poi mescolare delicatamente agitando il piatto. Coltura le cellule in un incubatore a CO 2 per altre 48-72 h.
      Nota: Si prevede che la massima efficienza di trasfezione sarebbe alla confluenza di 40-70% di queste cellule a causa della loro inibizione da contatto a ~ 70%. Di conseguenza, la transfezione funziona migliori a partire da ~ 20% e fermata a ~ 70% confluenza.

3. Istituzione del dosaggio bioluminescenza In Vitro in cellule di MCF10A transitoriamente Transfected

  1. morire di fame le cellule coltivate alla confluenza di ~ 70% (dopo la trasfezione per 48-72 h) in MEBM senza fattori di crescita per 24 h.
  2. Trattare le cellule con l'agente di sincronizzazione (ad esempio, 50% di siero equino (HS)) in MEBM per 1,5 h in incubatore a CO 2.
    Nota: Per la selezione di un agente di sincronizzazione ideale, 10 µM forskolin, 1 nM melatonina, desametasone 0,1 µM, 50% HS e 100% SQ sono stati confrontati in termini di ampiezza circadiana e periodo nelle cellule circadiano vettoriale trasfettate. Vettore vuoto transfettate le cellule sono trattate con 100% SQ come controllo negativo.
  3. Supporto di registrazione di pre-prepare 20 mL (per 10 dei piatti di cultura 30mm) aggiungendo 5 mL di MEGM, 15 mL di MEBM, 150 µ l bicarbonato di sodio, 200 µ l HEPES e luciferina 40 µ l di soluzione (50 mM) in una provetta da centrifuga 50 mL sterilizzato riserva.
    Nota: Le concentrazioni finali dei singoli componenti: 20% SQ e tossina del colera 20 ng/mL, bicarbonato di sodio 0,06%, 1% di penicillina/streptomicina e 10 mM HEPES. Riscaldamento pre-preparati registrazione medio e sterilizzato 1X PBS per 30 min a 37 ° C bagno d'acqua. Aggiungere 100 luciferina µM immediatamente prima dell'uso.
  4. Lavare le cellule con caldo 1 x Dulbecco ' s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) per 3 volte dopo l'incubazione con l'agente di sincronizzazione e quindi aggiungere 2 mL di mezzo di registrazione.
  5. Guarnizione il piatto con una classe di copertura sterilizzato utilizzando grasso al silicone per evitare l'evaporazione e quindi apporre un'etichetta sul lato.
  6. Porre la capsula sigillata nella sede all'interno del luminometro e attivare l'opzione per salvare il percorso del file nella cartella (per il dettaglio, vedi sezione 6).

4. Selezione di cellule stabilmente trasfettate con

  1. ottimizzare una concentrazione ideale G418 (800 µ g/mL) con un'analisi della curva di uccidere secondo il produttore ' istruzione di s per la selezione delle cellule stabilmente trasfettate.
  2. Dopo trasfezione transiente per 48 o 72 ore, sottocultura e seme le cellule con MEGM in piatti più grandi alle 5.000 cellule/piatto (100 mm). Dopo 24 h cultura nell'incubatrice di coltura cellulare (37 ° C, umidità 95% e 5% CO 2), trattare le cellule con 800 µ g/mL di G418 sostituendo il vecchio mezzo con nuovo medium contenente 800 µ g/mL G418 ogni 3-4 giorni per 2 settimane.
  3. Sottocultura sopravvivente stabilmente trasfettate colonie per passaggi 1-3 con MEGM contenente 500 µ g/mL G418 per mantenere l'espressione stabile di hPer2P/Luc2P e congelato in azoto liquido per un utilizzo futuro.
  4. Trattamento di 500 µ g/mL G418 dopo la subcoltura generale per selezionare nuovamente la popolazione stabilmente trasfettata delle cellule, se l'intensità di bioluminescenza nel risultato dell'analisi di bioluminescenza in vitro diventa progressivamente più basso dopo l'uso in molti passaggi.

5. Trattamento con prodotti chimici

  1. alle 48 ore o 72 ore post-transfezione, morire di fame le cellule da fattori di crescita in MEBM per 24 h.
  2. Dopo la sincronizzazione con 50% HS per 2 h, trattare le cellule con 0,25 o 0,5 mM nitrosomethylurea (NMU), 20 nM EX527 o cambinol di 1 µM per 1 h a MEBM contenente 20% sq.
  3. Dopo il lavaggio con 1 x D-PBS, Aggiungi registrazione media contenente 12,5 µM MSC da soli o in combinazione con 20 nM EX527 o cambinol di 1 µM, alle cellule. Monitoraggio la bioluminescenza con il luminometro.
  4. Trattare il MCF10A stabilmente trasfettate / PER2-cellule dLuc con NMU a 0,5, 1 o 2 mM, EX527 a 40 nM, o Cambinol a 2,0 µM, per 1 h dopo la sincronizzazione con 50% HS e poi incubare le cellule in registrazione media contenente 12,5 µM di MSC o dosi differenti (5, 10 o 20 µM) di n-acetilcisteina (NAC). Inserire le piastre sul luminometro, record e salvare la bioluminescenza dal luminometro per 4-8 giorni come descritto nella sezione 3.6.
    Nota: NMU è una nitrosourea metilato composto con proprietà mutagene, cancerogene e teratogene. NMU è un agente alchilante ad azione diretta e ha una breve emivita (T 1/2 = ~ 30 min). È stabile alle condizioni acide (pH 4-5), ma instabile stato alcalino (pH 9-10) e a temperature oltre i 20 ° C. Di conseguenza, candeggina al 10% utilizzabile come un efficace agente di disattivazione per pulizia di superfici panca e mercanzie di laboratorio potenzialmente contaminate da Solutia NMUsu. Soluzione di riserva avanzi è prelevati e smaltiti in modo sicuro da REHS. Base alla modalità di azione di prodotti chimici, cellule sincronizzate possono essere trattate per tempi più brevi prima coltura in supporto di registrazione. Le cellule possono anche essere trattate a mezzo di registrazione per un tempo più lungo (diversi giorni).

6. Raccolta dati, analisi e presentazione

Nota: attuabilità delle cellule deve essere determinata utilizzando metodi standard (ad es., analisi di MTT) dopo il trattamento delle cellule alle stesse concentrazioni per gli stessi tempi indicati. Tutte le concentrazioni di trattamento usate per il test di bioluminescenza in vitro sono stati inferiori al 30% di concentrazione letale (LC30). Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplice copia e sono stati presentati i risultati rappresentativi.

  1. Dopo aver sigillato il piatto (passo 3.5), caricare i piatti su sedi nel luminometro, che viene mantenuto all'interno di un incubatore a 37 ° C senza H 2 O e CO 2 e collegato a un computer.
  2. Clic " salvare " e immettere i nomi per la cartella e il file dove verrà salvato il segnale di luminescenza registrato dal piatto corrispondente.
    Nota: Il sistema rileva il segnale di luminescenza in tempo reale dalle cellule nel piatto alle singole posizioni. I segnali vengono trasferiti al computer tramite 4-photon-counting "tubi fotomoltiplicatori" e salvati e visualizzati nel computer di software di raccolta dati.
  3. Analizzare i segnali dopo aver registrato per 4-7 giorni, che potrebbe essere seguita da cambiamento medio e registrazione continua per una seconda settimana se necessario.
    Nota: Per ottenere i parametri circadiani, tra cui fase, durata del periodo, ampiezza di ritmo e smorzamento tasso, abbiamo usato il software di analisi di luminometro per analizzare i dati di bioluminescenza.
  4. Detrend dati raw con una media in esecuzione e analizzare il meglio-si adatta a un'onda sinusoidale per ottenere periodo, fase, ampiezza e smorzamento tasso 21 , 22.
  5. Dovuto la bioluminescenza transitoria alta al momento di trattamento e di cambiamento medio, escludere il primo ciclo di dati da analisi.
  6. Per la presentazione dei dati, tracciare i dati grezzi (bioluminescenza, conteggio/s) contro il tempo (ore o giorni). Quando necessario, possono essere tracciati i dati baseline-sottratto per confrontare l'ampiezza e la fase.

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Risultati

Vettore reporter circadiano bioluminescenza: espressione umana di promotore-guidato da PER2 della variante destabilizzato luciferasi

La sequenza di DNA che comprende un frammento di bp 941 derivato dal promotore PER2 umano utilizzato per costruire il vettore reporter circadiano, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo, in primo luogo è stato analizzato per la presenza di elementi regolatori conosciuta per regolare...

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Discussione

In cellule di mammifero, periodicità dell'orologio circadiano è regolato da anelli di retroazione trascrizionale traslazionale interconnessi. Eterodimeri di Bmal1 e orologio o Npas2 regolare la trascrizione circadiano legandosi agli elementi di E-box nei promotori di nucleo CGs, tra cui Per2 e piangeree numerosi CCGs4. Come si accumulano nella cella, heterodimers di a: Cry traduzionalmente modificati e trasportate al nucleo di reprimere l'attività trascrizionale dell'orologio: Bm...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da 2012 società di tossicologia (SOT)-Colgate Palmolive Grant per ricerca alterativa (M. Fang) e la ricerca di collaborazione internazionale fondo da animali e piante quarantena Agenzia, Repubblica di Corea (M. Fang), e concedere il NIEHS P30ES005022 (Zarbl H.). Vorremmo ringraziare il dottor Zheng Chen (McGovern Medical School presso l'Università di Texas Health Science Center a Houston) per la sua discussione utile, Mr. Shao-An Juan per la sua assistenza sperimentale e MS. Kimi Nakata per la prova di lettura.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vettore SwitchGearGenomicsS700000vettore
personalizzato pGL4.18[Luc2P/Neo] vettorePromega9PIE673vettore di espressione della luciferasi destabilizzata
T4 DNA ligasiInvitrogen15224041Per il subclonaggio Kit di clonazione
TOPO TAInvitrogenK4500-02con One Shot TOP10 E. coli chimicamente competente
Sac INew England BioLabsR0156SEnzima di restrizione
Hind III-HFNew England BioLabsR3104SEnzima di restrizione
CutSmart tamponeNew England BioLabsB7204SDNA del tampone enzima di restrizione
Qiagen28704Purifica i frammenti di DNA dal gel di agarosio
Kit di purificazione PCRQiagen28104Pulizia del DNA LB
Modifica di MillerTEKNOVAL8600Per colture di E. Coli trasformate
LB Agar PiastraTEKNOVAL1902Per la selezione bianco/blu
QIAprep spin miniprep KitQiagen27104Per l'estrazione del DNA plasmidico
EndoFree maxi prep KitQiagen12362Per l'estrazione del DNA plasmidico
FuGene HDPromegaE2311Reagente di trasfezione
Opti-MEM terreno sierico ridottoInvitrogen31985-062Per trasfezione
Linea cellulare MCF10ACollezione di colture di tipo americanoCRL-10317Cellule epiteliali mammarie
MEGM BulletKitLonzaCC-3150Terreno di crescita epiteliale mammaria
MEBMLonzaCC-3151Epiteliale mammario basale medio
MEGM SingleQuot KitLonzaCC-4136Suppliments & Reagente per fattori di
crescitaPackLonzaCC-5034Reagente per sottocoltura
D-PBS (10X)SigmaD1408Lavaggio delle cellule in piastre di coltura
Acqua distillata ultrapuraInvitrogen10977Diluire 10X D-PBS
Piastra per colture tissutali (35 mm)BD/Falcon353001Piastra per colture cellulari adatta a LumiCycle
Grasso siliconicoFisherNC9044707Per sigillare la piastra con il mezzo di registrazione
Vetro di copertura rotondoHarvard Bioscience64-1500 (CS-40R)Per sigillare la piastra con il mezzo di registrazione
Tossina del coleraSigmaC8052Integratore per il terreno di crescita
G418 solfato (geniticina)Invitrogen10131035Antibiotico per la selezione di cellule trasfettate stabili
AmpicillinaSigmaA9393Per la selezione delle colonie
ForskolinSigmaF6886Agente di sincronizzazione
MelatoninaSigmaM5250Agente di sincronizzazione
DesametasoneSigmaD4902Agente di sincronizzazione
Siero di cavalloSigmaH1138Agente di sincronizzazione
d-Luciferina, sale sodicoInvitrogenL2912Substrato della luciferasi
IC261Sigma10658Controllo positivo per l'interferente circadiano
Metilnitrosourea (NMU)SigmaN1517Cancerogeno specifico per la mammella
Metilselenocisteina (MSC)SigmaM6680Selenio organico (agente chemiopreventivo)
EX527Inibitore specifico SigmaE7034SIRT1
CambinolSigmaC0494SIRT1 & Inibitore SIRT2
Spettrofotometro NanoDropThermo ScientificNanoDrop 8000Quantificare il nucleotide
GeneAmp PCR System 9700Applied BiosystemsN805-0200Per esperimenti di biologia molecolare
Incubatore CO2NAPCOSerie 8000 DHPer colture cellulari al 5% di CO2 a 37 gradi ... C
Centrifuga da tavolo con refrezzatoreEppendorf5430RPer esperimenti di biologia molecolare
Centrifuga con secchio oscillanteEppendorf5810 RPer colture cellulari
Microscopio invertitoNikon80124Contrasto di fase opzionale
Cappa per coltura tissutaleLabconcoClasse II A2Certificato BSL-2
LumiCycle 32ActimetriaNon DisponibileRivelatore di luminoscenza
Kit di estrazione del gel di

Riferimenti

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