Articolo metodologico

Valutazioni di neurobehavioral in un modello murino di ferita di cervello Hypoxic-ischemica neonatale

DOI:

10.3791/55838

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24 novembre 2017

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1Department and Research Institute of Rehabilitation Medicine, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University, 3Department of Rehabilitation Medicine, Yonsei University Wonju College of Medicine, 4Rehabilitation Institute of Neuromuscular Disease, Yonsei University College of Medicine, 5Graduate Program of NanoScience and Technology, Yonsei University

In questo articolo

Sommario

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Abbiamo effettuato l'occlusione unilaterale dell'arteria carotica postnatale giorno 7-10 CD-1 del mouse cuccioli per creare un modello di (HI) hypoxic-ischemica neonatale e studiato gli effetti del trauma cranico HI. Abbiamo studiato le funzioni neurobehavioral in questi topi rispetto ai topi normali non azionato.

Abstract

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Abbiamo effettuato l'occlusione unilaterale dell'arteria carotica su topi CD-1 per creare un modello neonatale ipossico-ischemica (HI) ed abbiamo studiato gli effetti della ferita di cervello neonatale HI studiando le funzioni neurobehavioral in questi topi rispetto ai non-funzionati (vale a dire, topi normali). Durante lo studio, metodo di riso-Vannucci è stato usato per indurre il danno di cervello neonatale HI nei topi di postnatale giorno 7-10 (P7-10). L'operazione di HI è stata eseguita su cuccioli di legatura unilaterale dell'arteria carotica e l'esposizione all'ipossia (8% O2 e 92% N2 per 90 min). Una settimana dopo l'operazione, i cervelli danneggiati sono stati valutati con l'occhio nudo attraverso il cranio semi-trasparente e sono stati categorizzati in sottogruppi basati sull'assenza ("nessuna lesione corticale" gruppo) o presenza (gruppo "lesione corticale") di lesioni corticali, ad esempio una lesione nell'emisfero destro. Settimana 6, sono stati eseguiti i seguenti test di neurobehavioral per valutare le funzioni cognitive e motorie: scaletta (PAT), compito di evitare passivo walking test e test di forza di presa. Questi test comportamentali sono utili per determinare gli effetti della ferita di cervello neonatale HI e sono utilizzati in altri modelli murini di malattie neurodegenerative. In questo studio, topi neonatali di lesioni cerebrali HI ha mostrato i deficit del motore che ha corrisposto a danno di giusto emisfero. I risultati dei test comportamentali sono rilevanti per i deficit osservati nei pazienti affetti da HI neonatali, come paralisi cerebrale o pazienti neonatali del colpo. In questo studio, un modello murino di ferita di cervello neonatale HI era stabilito e ha mostrato diversi gradi di deficit motori e danno conoscitivo rispetto ai topi non azionato. Questo lavoro fornisce informazioni di base sul modello del topo di HI. Immagini di risonanza magnetica dimostrano i fenotipi diversi, separati in base alla gravità del danno cerebrale da prove motorie e cognitive.

Introduzione

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Ferita di cervello HI neonatale si verifica durante la prima infanzia (circa due pazienti per 1.000 bambini)1,2,3,4,5. Studi per quanto riguarda la ferita di cervello neonatale HI sono importanti, e utilizzando HI, un cervello stabilito neonatale ferita modello murino può facilitare la ricerca preclinica in vivo sulla lesione cerebrale HI.

I modelli tradizionali di HI sono utilizzati su ratti adulti6. Per il modello di neonato, il metodo di riso-Vannucci è comunemente usato il P7 ratti7,8. Tuttavia, poiché i ratti e topi sono leggermente diversi9,10, anche se sono entrambi roditori, abbiamo effettuato un metodo modificato di riso-Vannucci su CD-1 cuccioli a P7-10, sulla base di studi precedenti che hanno mostrato che P7-10 è il periodo caratterizzato da oligodendrociti immaturi, corrispondente al termine umano P011,12. Il modello di mouse HI neonatale è stabilito attraverso sia la legatura dell'arteria carotidea unilaterale e l'esposizione dei topi all'ipossia con 8% di ossigeno in P7-10 cuccioli.

I topi sottoposti alla procedura ha mostrata vari gradi di lesioni cerebrali nella zona posterolateral dell'emisfero destro. Per identificare i deficit cognitivi e motori, neurobehavioral valutazioni fondate su PAT, scaletta walking test e test di forza di presa sono stata eseguita. Sono state analizzate le differenze tra non-funzionati (cioè, normale) e topi HI. Questo lavoro presenta informazioni di base sul modello del topo di HI. Le immagini di MRI mostrano i diversi fenotipi, separati secondo la severità di danni di cervello usando le prove motorie e cognitive.

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Protocollo

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Tutti gli animali sono stati alloggiati in una gabbia standard (27 × 22.5 × 14 cm3) in una struttura accreditata dall'associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio animale cura (AAALAC) e dato cibo e acqua ad libitum sotto alternando 12-h chiaro/scuro cicli. Gli autori hanno seguito la normativa sulla protezione degli animali, e le procedure sperimentali sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Comitato di Yonsei University College of Medicine (No. IACUC 2010-0252; 2013-0220).

1. Mouse modello di lesione cerebrale neonatale HI

  1. Anestetizzare i cuccioli con isoflurano.
    1. Posizionare i cuccioli (meno di 5) in una scatola anestetizzante e chiudere il coperchio.
    2. Accendere il sistema anestetizzante per circa 15 min; regolare il gas e isoflurano utilizzando una macchina di anestesia superiore della tabella. Regolare il flussometro ossigeno a 1,5 L/min regolare il vaporizzatore di isoflurane per 3-5% per l'induzione dell'anestesia.
    3. Dopo 15 min, regolare il vaporizzatore di isoflurane per 1-2% per il mantenimento dell'anestesia.
  2. Posare un cucciolo completamente anestetizzato sotto un microscopio di dissezione (addome rivolto verso il ricercatore) e fissarlo con nastro adesivo.
  3. Fare un'incisione di ~0.7-mm nel collo utilizzando forbici sterilizzate.
  4. Con attenzione rimuovere il tessuto adiposo utilizzando pinze sterili ed esporre l'unilaterale dell'arteria carotica di destra.
  5. Legare l'arteria carotica di destra unilaterale con una sutura riassorbibile 5-0.
  6. Sutura l'incisione nel collo con sutura 5-0.
  7. Posizionare ogni cucciolo in una camera ipossica calda di 37 ° C per 1 h per il recupero. Non chiudere il coperchio della camera.
  8. 1 h dopo l'intervento chirurgico, quando i cuccioli sono completamente svegli, chiudere il coperchio della camera di ipossia e fanno diminuire i livelli di gas per stabilire condizioni di ipossia (8% O2 e 92% N2).
  9. Dopo 90 min di ipossia, restituire i cuccioli nelle loro gabbie.
  10. Una settimana dopo la ferita di cervello di HI, ripetere il passaggio 1.
    1. Dopo l'anestesia, praticare un'incisione nel cuoio capelluto con forbici sterilizzate e forcipe per identificare la lesione di cervello in zona posterolateral dell'emisfero destro.
      Nota: Questo trattamento induce ipossia nei cuccioli. La presenza e l'entità del trauma cranico in tutti i topi è valutata visivamente con l'occhio nudo attraverso il cranio semi-trasparente. Come determinato dalla dimensione o il volume dello sbiadimento (cioè, la lesione di cervello), i cuccioli sono classificati in gruppi. Se non c'è nessuna lesione corticale visibile, il mouse è classificato nel gruppo "nessuna lesione corticale". Se c'è una lesione corticale visibile (cioè, una lesione nell'emisfero destro), il mouse è classificato nel gruppo "lesione corticale". Poiché la classificazione dei topi in gruppi è fatta una settimana dopo l'operazione, i raggruppamenti possono essere modificati quando le morfologie dei campioni del cervello sono chiaramente definite al momento del sacrificio1,2,3, 4.

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Figura 1: Modellazione neonatale cranico HI in topi.
(A) un cucciolo di sette-giorno-vecchio mouse ha subito la chirurgia e l'arteria carotica di destra unilaterale è stata legata. (B) cuccioli sono stati collocati in una camera ipossica per 90 min con 8% O2 e 92% N2. (C, D ed E) I cervelli con lesioni HI neonatale ha mostrato varie gravità dei danni e sono stati categorizzati in base al grado di danno. Alla settimana 14, i cervelli sono stati ottenuti, e le lesioni sono state visualizzate. (C) immagine di un cervello che è classificato come una "nessuna lesione corticale". Sia (D) ed (E) sono state classificate nel gruppo "lesione corticale". (F, G e H) Rappresentante MRI di (C), (D) e (E) topi, rispettivamente. (F) il danno nell'ippocampo è indicato con una freccia gialla, e lesioni nell'emisfero destro sono anche indicate con frecce gialle (G e H). Scala bar = 1 mm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. neonatale test comportamentali

Nota: Qui, i test comportamentali sono stati eseguiti a 6 settimane dell'età.

  1. Compito passivo dell'evitare.
    Nota: Per valutare la funzione di memoria basato sull'apprendimento e l'evitare di uno stimolo avversivo, un due-vano passaggio-attraverso PAT dovrebbe essere condotto13,14,15,16.
    1. Inserire un mouse nel vano luminoso della casella di navetta di Plexiglas (41,5 × 21 × 35 cm3) di un apparato PAT.
    2. Dopo 30 s, aprire la porta a ghigliottina e registrare il tempo di latenza per il mouse per spostare nel vano scuro (fino a 300 s).
    3. Chiudere la porta a ghigliottina quando tutte e quattro le membra del mouse sono completamente all'interno del vano scuro.
    4. Somministrare shock elettrici del piede (0.5 mA) 2 s e ritorno il mouse alla sua gabbia.
    5. Sostituire il mouse nel vano luminoso 24 h dopo lo shock elettrici del piede.
    6. Aprire la ghigliottina porta 10 s dopo il mouse è completamente inserito nel vano luminoso e registrare il tempo di latenza per il mouse per spostare nel vano scuro (fino a 300 s).
  2. Test di camminata di scaletta.
    Nota: L'attività di ambulante del gradino scala consente per la discriminazione tra sottili disturbi della funzione motoria combinando qualitativa e analisi quantitative di qualificati a piedi17,18.
    1. Attivare una videocamera.
    2. Posizionare un mouse sul pannello di inizio della scala e iniziare immediatamente la registrazione.
    3. Registrare i video, concentrandosi sugli arti del mouse.
    4. Interrompere la registrazione quando il mouse tocca l'ultimo pannello della scala. Ripetere il viaggio avanti e indietro quattro volte.
    5. Analizzare la registrazione video e manualmente contare il numero di foglietti di ogni zampa anteriore, come segue:
      1. Giocare la registrazione del video su un computer a una velocità lenta (0,1 x) e contare i passi manualmente.
  3. Prova di resistenza di aderenza.
    Nota: La prova di forza di presa viene eseguita utilizzando un misuratore di forza di presa, che comprende un estensimetro push-pull.
    1. Difficoltà l'apparato di forza di presa su un pannello di acrilico.
    2. Posizionare il mouse sul pannello acrilico e tenere la coda.
      1. Spostare la mano che tiene la coda così che possa raggiungere il mouse e il grip il filo metallico dell'apparato.
    3. Consentire prove multiple, fino a quando il mouse afferra un pezzo triangolare di filo metallico (2 mm di diametro); la forza massima viene automaticamente registrata in grammi dall'apparato.
      Nota: Utilizzare la forza di picco media di tre prove per analisi19,20,21.

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Risultati

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Tutti i dati sono espressi come media ± errore standard della media (SEM). Il confronto di variabili fra i due gruppi è stata condotta utilizzando un indipendente o la coppia t-prova il software statistico SPSS. Un p-valore < 0.05 è stato considerato statisticamente significativo.

I cervelli con lesioni HI neonatale ha mostrato diverse gravità del danno e sono stati categorizzati in conseguenza (

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Discussione

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In questo studio, abbiamo indotto HI trauma cranico in un mouse P7-10 CD-1 neonatale ed abbiamo identificato la lesione di cervello con rilevanti deficit cognitivi e motori. Durante questa procedura, l'occlusione dell'arteria carotica di destra unilaterale era critica. In questo passaggio, l'arteria potrebbe essere danneggiato e strappato. Maggior parte dei cuccioli che ha avvertito una rottura dell'arteria è morto. Al contrario, se i ricercatori legato un'altra vena di sangue invece l'arteria carotica di destra unilater...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno concorrenti interessi.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato sostenuto da borse di studio dal National Research Foundation (NRF-2014R1A2A1A11052042; 2015M3A9B4067068), il Ministero della scienza e tecnologia, Repubblica di Corea, coreano Health Technology R & D Project (HI16C1012), Ministero della salute & Benessere, Repubblica di Corea e il programma di assistenza "Dongwha" ricerca Facoltà di Yonsei University College of Medicine (6-2016-0126).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Camera ipossicaJeung Do Bio & Plant CoCostruttore
Apparecchio PATJeung Do Bio & Plant CoCostruttore
La scala piolo camminandoJeung Do Bio & Plant Co, Costruttore
, SDI, Sistema di forza di presa,San Diego Instruments, Inc.
Misuratore di forza di presaUgo Basile47200
Harvard Apparatus Sistema di anestesia fluovac Harvard Apparatus
anestetizzazioneacrilica
I-Fran Liquid (Isofluorane)Hana Pharm. Co., Ltd.Anestetici generali (isoflurano 100ml)
CD-1 topiOrient Co., Ltd.
Sutura mono in nylon blu non assorbibile 5-0 50cmAilee Co., Ltd.NB 521
Statistiche IBM SPSS IBMVer. 23
sperimentalesperimentalesperimentaleScatola di scatola

Riferimenti

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