PIP-on-a-chip: Uno studio privo di etichette delle interazioni proteine-fosfoinositide

Djoshkun Shengjuler; Simou Sun; Paul S. Cremer; Craig E. Cameron

doi:10.3791/55869

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Articolo metodologico

PIP-on-a-chip: Uno studio privo di etichette delle interazioni proteine-fosfoinositide

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DOI:

10.3791/55869

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27 luglio 2017

Djoshkun Shengjuler¹ , Simou Sun² , Paul S. Cremer¹^,² , Craig E. Cameron¹

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University, ²Department of Chemistry, The Pennsylvania State University

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un bilingue lipidico supportato nel contesto di una piattaforma microfluidica per studiare le interazioni proteine-fosfoinositide usando un metodo senza etichetta basato sulla modulazione del pH.

Abstract

Numerose proteine cellulari interagiscono con superfici di membrana per influenzare processi cellulari essenziali. Queste interazioni possono essere indirizzate verso una componente lipidica specifica all'interno di una membrana, come nel caso di fosfoinositide (PIP), per garantire una localizzazione e / o un'attivazione subcellulare specifica. PIPs e domini cellulari PIP-binding sono stati studiati in modo estensivo per comprendere meglio il loro ruolo nella fisiologia cellulare. Abbiamo applicato un saggio di modulazione del pH sui bilayers lipidici supportati (SLBs) come uno strumento per studiare le interazioni proteine-PIP. In questi studi è stata utilizzata la fosfatidiletiletilammina coniugata con orto- Solforodina B sensibile al pH per rilevare interazioni proteine-PIP. Dopo il legame di una proteina a una superficie di membrana contenente PIP, il potenziale di interfaccia è modulato ( cioè il cambiamento nel pH locale), spostando lo stato di protonazione della sonda. Un caso di studio sull'uso efficace del saggio di modulazione del pH è presentato utilizzando fosfolipasi C delta1 PleckstrIn omologia (PLC-δ1 PH) e fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PI (4,5) P ₂ ) come esempio. L'apparente costante di dissociazione ( K _{d, app} ) per questa interazione era 0,39 ± 0,05 μM, simile a K _d, valori _app ottenuti da altri. Come osservato in precedenza, il dominio del PLC-δ1 è PI (4,5) P ₂ specifico, mostra un legame più debole verso fosfatidilinositolo 4-fosfato, e nessun legame con SLB di fosfatidilcolina pura. Il test PIP-on-a-chip è vantaggioso rispetto ai test tradizionali PIP-binding, tra cui, ma non limitati, il basso numero di campioni e nessun requisito di etichettatura del ligando / del recettore, la capacità di testare interazioni a membrane di alta e bassa affinità con piccole e Grandi molecole e un miglior rapporto segnale / rumore. Di conseguenza, l'utilizzo del metodo PIP-on-a-chip faciliterà la chiarificazione dei meccanismi di una vasta gamma di interazioni di membrana. Inoltre, questo metodo poteva essere uNel identificare le terapie che modulano la capacità della proteina di interagire con le membrane.

Introduzione

Interazioni di microrganismi e processi biochimici avvengono su superfici a membrana bidimensionale fluida. Gli organelli racchiusi in membrana in cellule eucariotiche sono uniche non solo nei processi biochimici e nel loro proteome associato, ma anche nella loro composizione lipidica. Una classe eccezionale di fosfolipidi è fosfoinositide (PIP). Anche se comprendono solo l'1% del lipidome cellulare, essi svolgono un ruolo cruciale nella trasduzione del segnale, nell'autofagia e nel traffico di membrana tra gli altri ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ .....