Articolo metodologico

PIP-on-a-chip: Uno studio privo di etichette delle interazioni proteine-fosfoinositide

DOI:

10.3791/55869

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27 luglio 2017

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University, 2Department of Chemistry, The Pennsylvania State University

In questo articolo

Sommario

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Qui presentiamo un bilingue lipidico supportato nel contesto di una piattaforma microfluidica per studiare le interazioni proteine-fosfoinositide usando un metodo senza etichetta basato sulla modulazione del pH.

Abstract

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Numerose proteine ​​cellulari interagiscono con superfici di membrana per influenzare processi cellulari essenziali. Queste interazioni possono essere indirizzate verso una componente lipidica specifica all'interno di una membrana, come nel caso di fosfoinositide (PIP), per garantire una localizzazione e / o un'attivazione subcellulare specifica. PIPs e domini cellulari PIP-binding sono stati studiati in modo estensivo per comprendere meglio il loro ruolo nella fisiologia cellulare. Abbiamo applicato un saggio di modulazione del pH sui bilayers lipidici supportati (SLBs) come uno strumento per studiare le interazioni proteine-PIP. In questi studi è stata utilizzata la fosfatidiletiletilammina coniugata con orto- Solforodina B sensibile al pH per rilevare interazioni proteine-PIP. Dopo il legame di una proteina a una superficie di membrana contenente PIP, il potenziale di interfaccia è modulato ( cioè il cambiamento nel pH locale), spostando lo stato di protonazione della sonda. Un caso di studio sull'uso efficace del saggio di modulazione del pH è presentato utilizzando fosfolipasi C delta1 PleckstrIn omologia (PLC-δ1 PH) e fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PI (4,5) P 2 ) come esempio. L'apparente costante di dissociazione ( K d, app ) per questa interazione era 0,39 ± 0,05 μM, simile a K d, valori app ottenuti da altri. Come osservato in precedenza, il dominio del PLC-δ1 è PI (4,5) P 2 specifico, mostra un legame più debole verso fosfatidilinositolo 4-fosfato, e nessun legame con SLB di fosfatidilcolina pura. Il test PIP-on-a-chip è vantaggioso rispetto ai test tradizionali PIP-binding, tra cui, ma non limitati, il basso numero di campioni e nessun requisito di etichettatura del ligando / del recettore, la capacità di testare interazioni a membrane di alta e bassa affinità con piccole e Grandi molecole e un miglior rapporto segnale / rumore. Di conseguenza, l'utilizzo del metodo PIP-on-a-chip faciliterà la chiarificazione dei meccanismi di una vasta gamma di interazioni di membrana. Inoltre, questo metodo poteva essere uNel identificare le terapie che modulano la capacità della proteina di interagire con le membrane.

Introduzione

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Interazioni di microrganismi e processi biochimici avvengono su superfici a membrana bidimensionale fluida. Gli organelli racchiusi in membrana in cellule eucariotiche sono uniche non solo nei processi biochimici e nel loro proteome associato, ma anche nella loro composizione lipidica. Una classe eccezionale di fosfolipidi è fosfoinositide (PIP). Anche se comprendono solo l'1% del lipidome cellulare, essi svolgono un ruolo cruciale nella trasduzione del segnale, nell'autofagia e nel traffico di membrana tra gli altri 1 , 2 , 3 , 4 . La fosforilazione dinamica del gruppo testa inositolo per le cellule PIP chinasi dà origine a sette gruppi di capi PIP che sono mono-, bis-, o tris-fosforilati 5 . Inoltre, i PIP definiscono l'identità subcellulare delle membrane e servono come siti di ancoraggio a membrana specializzati per proteine ​​/ enzimi che contengono uno o più fosfoidiDomini leganti, ad esempio Homology Pleckstrin (PH), Phox Homology (PX) e Epsin N-terminal Homology (ENTH) 6 , 7 . Uno dei domini PIP-legame più studiati è fosfolipasi C (PLC) dominio PH -δ1 che interagisce specificamente con fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato (PI (4,5) P 2) all'interno di un alto nanomolari-gamma bassa affinità micromolare 8 , 9 , 10 , 11 .

Sono stati sviluppati diversi metodi qualitativi e quantitativi in vitro e utilizzati per studiare il meccanismo, la termodinamica e la specificità di queste interazioni. Tra i più comuni metodi di rilascio PIP sono la risonanza plasmonica superficiale (SPR), la calorimetria isotermica (ITC), la spettroscopia magnetica nucleare (NMR), il test di flottazione / sedimentazione dei liposomi e le macchie lipidiche (grasso-blots / PIP-strips)12 , 13 . Anche se questi sono ampiamente utilizzati, tutti hanno molti svantaggi. Ad esempio, SPR, ITC e NMR richiedono grandi quantità di campioni, strumentazione costosa e / o personale addestrato 12 , 13 . Alcuni formati di analisi come i blot di lipidi a base di anticorpi utilizzano forme solubili in acqua di PIP e li presentano in modo non fisiologico 12 , 14 , 15 , 16 . Inoltre, le macchie lipidiche non possono essere quantificate in modo affidabile e spesso hanno portato a osservazioni false positivo / negativo 12 , 17 , 18 . Per superare queste sfide e migliorare l'attuale set di strumenti, è stato stabilito un nuovo metodo senza etichetta basato su un duplicato lipidico supportato (SLB) nel contesto di Piattaforma microfluidica, che è stata applicata con successo allo studio delle interazioni proteine-PIP ( Figura 1 ) 19 .

La strategia utilizzata per rilevare le interazioni proteine-PIP è basata sulla sensazione di modulazione del pH. Ciò comporta una tintura sensibile al pH che ha orto- solforodamina B ( o SRB) direttamente coniugata al gruppo tossico lipidico della fosfatidiletanolammina 20 . La sonda o SRB-PAPA (Figura 2A) è altamente fluorescente a pH basso e spenta a pH elevato con un pKa circa 6,7 entro 7,5 moli% PI (4,5) P 2 SLB -aventi (Figura 5B). Il dominio PH del PLC-δ1 è stato ampiamente utilizzato per la convalida delle metodologie di legame di proteine-PIP a causa della sua elevata specificità nei confronti di PI (4,5) P 2 ( Figura 5A ) 21 , 22 ,"> 23 , 24 , 25. Quindi, abbiamo ragionato che il dominio PL PLC-δ1 possa essere utilizzato per testare il suo legame a PI (4,5) P 2 attraverso il test PIP-on-a-chip. Utilizzata in questo studio ha una carica netta positiva (pI 8.4) e attrae quindi gli OH - ioni ( Figura 5C ). Quando si lega a SLB che contengono PI (4,5) P 2 , il dominio PH porta gli OH - ioni al La superficie della membrana, che a sua volta modula il potenziale di interfaccia e sposta lo stato di protonazione di o SRB-POPE ( Figura 5C ) 26. In funzione della concentrazione del dominio di PH, la fluorescenza viene fatta abbrutire ( Figura 6A ). Adatta ad un'isoterma legante per determinare l'affinità dell'interazione di PH-dominio-PI (4,5) P 2 ( Figura 6B , 6C ).

In questo studio viene fornito un protocollo dettagliato per eseguire la legame delle proteine ​​a SLB contenenti PIP all'interno di una piattaforma microfluidica. Questo protocollo prende il lettore dall'assemblaggio del dispositivo microfluidico e della preparazione della vescicola alla formazione di SLB e alla legatura delle proteine. Inoltre sono fornite indicazioni per l'analisi dei dati per estrarre le informazioni di affinità per l'interazione PLC-δ1 PH-dominio-PI (4,5) P 2 .

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Protocollo

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1. Pulizia dei vetri di copertura

  1. Diluire la soluzione di pulizia 7x (vedi tabella dei materiali ) 7 volte con acqua deionizzata in un piatto di vetro borosilicato profondo da 100 mm con fondo piano e riscaldare fino a 95 ° C su una piastra calda a livello per 20 minuti o fino a che la soluzione nuvolosa diventa chiara .
    NOTA: la soluzione sarà calda, usa cautela per evitare lesioni corporali. La soluzione di pulizia 7x è una miscela proprietaria di esasodio [ossido- [ossido (fosfonatoossil) fosforil] ossifosforil] fosfato, 2- (2-butossietossi) etanolo, sodio 1,4-bis (2-etilhexossi) -1,4-diossobutano -2-solfonati e aggiunte non pericolose.
  2. Usando le pinzette, disporre le copertine (40 mm di lunghezza x 22 mm di larghezza x 0,16-0,19 mm di altezza) su una cremagliera di alluminio in alternanza. Mantenere un punto vuoto tra ciascuna copertina per evitare che si tocchino.
  3. Immergere completamente la cremagliera con le copertine nella soluzione di pulizia. Tieni le copertineLa soluzione per 1 h.
    NOTA: quando l'acqua evapora, continuare ad aggiungere acqua fresca deionizzata per mantenere invariata la concentrazione della soluzione.
  4. Prendete le cremagliere dalla soluzione di pulizia e lavate le copertine con abbondanti quantità di acqua deionizzata per rimuovere il detersivo.
  5. Asciugare le copertine con gas azoto (circa 5 min per cremagliera) e quindi posizionare le copertine in un forno per 6 ore a 550 ° C per l'annealing.
    NOTA: questo è un passo fondamentale che liscia le caratteristiche ruvide sulla superficie del vetro.
  6. Posizionare le copertine in un contenitore di plastica e tenerli lontani dalla polvere.

2. Fabbricare blocchi PDMS Micropatternati

  1. Mescolare il prepolimero di polidimetilsilossano (PDMS) e l'agente di tamponamento in rapporto 10: 1 (w / w) in una grande barca di pesata in plastica e degassarlo in vuoto per 1 h con resistenza al vuoto a 500 Torr o inferiore.
    NOTA: PDMS è un polimero in silicone trasparente e inerte. Per ottenere il blocco PDMS desiderato(0,5 cm), mescolare 55 g del prepolimero con 5,5 g dell'agente di tintura.
  2. Posizionare il master di silicio che contiene più repliche dello stesso SU-8 micropattern in una grossa barra di pesatura in plastica di diametro di 10 cm e versare il PDMS degasato. Quindi, curare in un forno a secco a 60 ° C per tutta la notte.
    NOTA: I micropatteri sono abbastanza grandi da essere visti con l'occhio nudo. Ogni modello contiene 8 micro canali (100 μm di larghezza x 40 μm di altezza x 1 cm di lunghezza) con 40 μm di spaziatura tra ( Figura 1A , 1B ). Lo stampo in silicone, costituito da fotoresist SU-8, è stato fabbricato in un impianto di nanofabbricazione 27 . Altri approcci per la preparazione del master includono l'etching dell'acido fluoridrico (HF), l'etching dell'acqua ad alta temperatura, la xurography e la stampa 3D 28 , 29 , 30 , 31 . commercPossono essere utilizzate anche sorgenti per la preparazione del silicio. I modelli per il dispositivo microfluidico sono stati progettati con un software di progettazione (vedi tabella dei materiali). Il file originale che contiene il disegno del modello è fornito come un file aggiuntivo "Pattern Design.dwg", che può essere fornito direttamente al produttore.
  3. Delicatamente, sfilare il PDMS dal master silicio con le mani. Segna i confini di ogni micropattern in rettangoli utilizzando un bisturi chirurgico e un righello. Quindi, tagliate il PDMS in blocchi.
  4. Punzonatura 16 fori (8 entrate e 8 uscite per blocco) su entrambe le estremità di ciascuna microcanale con un punzone di biopsia (diametro del foro da 1,0 mm) come indicato nella figura 3B .
  5. Applicare nastro su ogni blocco PDMS per proteggere i micropattern da danni e polvere. Conservarli in un contenitore di plastica.

3. Preparazione di piccole vescicole unilamellari (SUV)

NOTA: Composizione negativa di due strati di controlloè 99,5 mol% 1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-fosfocolina (POPC) e 0,5 moli% orto- solforodamina B-1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-fosfoetanolamina (o SRB- PAPA). Composizione di prova bistrato è 92,0 mol% POPC, 0,5 moli% o SRB-PAPA, e 7,5% in moli di una L-α-fosfatidilinositolo-4-fosfato (PI4P) o L-α-fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato (PI ( 4,5) P 2 ). Sotto è la procedura per la preparazione 92,0 mol% POPC, 0,5 moli% o SRB-PAPA, e 7,5% molare di PI (4,5) P 2 SUV -contenenti. La sintesi di o SRB-POPE utilizzata in questo studio è stata precedentemente descritta 20 .

  1. Calcola il volume di POPC, PI (4,5) P 2 e o SRB-POPE che deve essere miscelato, che conta i seguenti totali totali: 2,22 mg di POPC, 0,26 mg di PI (4,5) P 2 , E 2,1 x 10 -5 mg di o SRB-POPE.
  2. Pipette il volume calcolato di POPC, PI (4,5) P 2 , o SRB-POPE in una singola fiala di scintillazione di vetro da 20 ml.
    NOTA: Le soluzioni di riserva POPC e o SRB-POPE vengono fornite in una soluzione cloroformica, mentre il titolo PI (4,5) P 2 (e altri fosfoinositidi) arriva in una miscela di cloroformio: metanolo: acqua (20: 9: 1). Per precisione, bagnare la punta della pipetta con cloroformio prima di utilizzarla. Per la sicurezza, questo passaggio dovrebbe avvenire all'interno di una cappa chimica.
  3. Asciugare la miscela in un flusso di gas di azoto all'interno di una cappa chimica per 10 minuti o fino a quando il solvente si elimina e si forma una sottile pellicola lipidica in fondo alla fiala.
  4. Desiccare la miscela sotto vuoto per ≥3 h ad una forza di vuoto di 10 mTorr per rimuovere qualsiasi residuo organico residuo.
    NOTA: Il tempo di essiccazione di 3 ore è sufficiente per la scala di preparazione SUV descritta in questo protocollo, che è sufficiente per 50 esperimenti. Se è richiesta una più ampia scala di preparazione SUV, si può eseguire la desquamazione durante la notte.
  5. Ridorre il dott(20 mM HEPES, 100 mM NaCl, a pH 7,0) e collocarlo in un bagno ad ultrasuoni con una frequenza di funzionamento di 35 kHz per 30 minuti a RT.
    NOTA: La miscelazione delle quantità di lipidi specificata al punto 3.1 e l'aggiunta di 5 mL di tampone in esecuzione al punto 3.5 rende una sospensione di vescicola a 0,5 mg / mL. In questa fase, la sospensione della vescicola è un mix di vescicole unilamellari e multilamellari ( Figura 2B ). La soluzione apparirà rosa / porpora a colori e relativamente torbida.
  6. Freeze-scongelare la sospensione della vescicola con l'azoto liquido e il bagno d'acqua a 40 ° C per ottenere vesicles unilamellar. Ripetere la freccia-scongelamento 10 volte.
    NOTA: (Facoltativo) Per garantire l'assenza di vescicole non unilamellare nella sospensione, può essere applicata la fase di centrifugazione 32 , 33 .
  7. Estrudere la sospensione della vescolina attraverso una membrana in policarbonato incisa da traccia 0,10 μm usando un estrusore lipidico (vediTavola di materiali) per arricchire i SUV. Ripetere l'estrusione 10 volte.
    NOTA: Un tubo conico da 15 ml può essere utilizzato per raccogliere le vescicole estruse. In questa fase la soluzione dovrebbe essere invalida di torbidità. Il diametro del SUV può essere confermato mediante dispersione luminosa dinamica (DLS) ( Figura 2C ). I SUV sono più adatti per la formazione di SLB 34 .
  8. Coprire il tubo conico con foglio di alluminio e conservare a 4 ° C fino a quando non sarà pronto per l'uso.

4. Montaggio del dispositivo Microfluidico

  1. Testare le entrate e le uscite del blocco PDMS per bloccare schizziando l'acqua deionizzata attraverso i fori usando una bottiglia di lavaggio dell'acqua. Quindi, asciugare il blocco PDMS con gas di azoto.
    NOTA: Questo passaggio rimuoverà anche le particelle di polvere che potrebbero essere intrappolate all'interno e / o tra i canali. Se necessario, copre le coperture pre-pulite con gas nitrogeno per rimuovere eventuali particelle di polvere.
  2. Posizionare il blocco PDMS e il pre-pulito(Vedi sezione 1) all'interno del sistema di plasma dell'ossigeno (vedi tabella dei materiali) camera di campione per esporre con plasma ad ossigeno per 45 s con impostazione di potenza a 75 Watt, velocità di flusso di ossigeno a 10 cm 3 / min e resistenza al vuoto a 200 mTorr .
  3. Posizionare la superficie modellata del blocco PDMS a contatto con la copertura immediatamente dopo il trattamento con plasma ad ossigeno. Premere delicatamente per rimuovere le bolle d'aria nei siti di contatto.
  4. Mettere il dispositivo su una piastra riscaldata a 100 ° C per 3 min per migliorare l'incollaggio.
  5. Utilizzare un panno umido senza pelo ( es. Kimwipe) con etanolo al 100% per rimuovere eventuali particelle di polvere dall'alto (PDMS) e dal fondo (vetro) del dispositivo. Quindi, avvitare il dispositivo in cima ad una vetrina del microscopio in vetro.
    NOTA: Non utilizzare una quantità eccessiva di etanolo e evitare che l'etanolo entri nei canali di ingresso e uscita. L'esecuzione di questo passaggio mentre il dispositivo è ancora caldo è consigliato per garantire che l'etanolo evapori immediatamente. MicrLe scivolature di oscopia possono essere immagazzinate in soluzione al 100% di etanolo per rimuovere polvere e altri contaminanti.

5. Formazione di Bilayers Lipidi Supportati (SLBs)

  1. Trasferire 100 μL di SUV contenenti PI (4,5) P 2 dal punto 3.8 in un tubo di microcentrifuga da 0,65 ml. Regolare il pH della soluzione a ~ 3,2 aggiungendo 6,4 μL di acido cloridrico 0,2 N.
    NOTA: Verificare il pH della soluzione con un misuratore pH dotato di sonda microfilo (vedere tabella dei materiali).
  2. Pipettare 10 μL della soluzione SUV regolata in pH in ogni canale attraverso l'ingresso e applicare la pressione attraverso la pipetta fino a raggiungere la soluzione. Staccare la punta dalla pipetta e lasciarla fissata al dispositivo.
  3. Ripetere il passo precedente per ogni canale e quindi incubare il dispositivo per 10 minuti a RT.
    NOTA: L'iniezione di vescicole nei microchannel dovrebbe essere eseguita immediatamente dopo l'assemblaggio del dispositivo.
  4. Tagliare i set di tubo di entrata e uscita eaCh 60 cm (tubo di entrata) e 8 cm (tubo di uscita) lungo, rispettivamente.
    NOTA: Tagliare diagonalmente il tubo e creare un bordo tagliente, rende più facile inserire il tubo nelle entrate e nelle prese. Il tubo di uscita dovrebbe avere una forma d'arco. La lunghezza del tubo di ingresso può variare in base alla configurazione del microscopio. Il diametro interno del tubo è di 0,05 cm.
  5. Utilizzando le pinzette, collegare il tubo di scarico impostato sul dispositivo e quindi nastro il dispositivo su uno stadio microscopico.
  6. Immergere un'estremità del tubo di entrata impostata in 25 ml di tampone di corsa contenuta in un tubo conico e fissarla per assicurarsi che il tubo sia fissato.
  7. Posizionare il tubo conico su un terreno superiore (~ 20 cm) rispetto al dispositivo per spingere la soluzione attraverso i microchannel via il flusso di gravità; Un jack di laboratorio può essere utilizzato per ottenere questo risultato.
  8. Per ogni tubo di ingresso, utilizzare una siringa per disegnare 1 mL di tampone di esercizio dall'estremità libera del tubo. Rimuovere la punta della pipetta dall'apertura e inserire ilEstremità libera del tubo di entrata nel dispositivo.
    NOTA: Introdurre una goccia di buffer di esecuzione sull'ingresso per ridurre la probabilità che una bolla d'aria venga introdotta nel canale durante questo passaggio. Dopo che il tubo di ingresso è collegato al dispositivo, utilizzare una panno senza peli per rimuovere il buffer in eccesso.
  9. Ripetere il passaggio sopra riportato per collegare tutti i pezzi del tubo di ingresso al dispositivo.
    NOTA: Il flusso di corrente di flusso attraverso i canali aiuta a rimuovere le vescicole in eccesso e a equilibrare il doppio strato in condizioni sperimentali.
  10. Aprire il software di controllo del microscopio (vedere tabella dei materiali). Sul pannello sinistro, fai clic sulla scheda "Microscopio" e scegli l'obiettivo "10X".
  11. Fai clic su icone di immagine "Live" e poi "Alexa 568" sulla barra degli strumenti. Utilizzando le manopole di regolazione del fine e del corso, concentrarsi sui microchannel.
  12. Scansiona attraverso il dispositivo per controllare la qualità degli SLB ei canali ( Figura 8 ). Poi,Fare clic sull'icona di immagine "FL Shutter Closed" sulla barra degli strumenti.
  13. Fai clic sulla scheda "Acquisizione" e in "Regolazioni di base" seleziona "Tempo di esposizione". Impostare il tempo di esposizione su "200 ms".
  14. Nel pannello sinistro, fai clic su "Acquisizione multidimensionale" e nel menu filtri seleziona il canale rosso (contrassegnato come "Alexa 568"). Quindi fare clic sul menu "time lapse", impostare l'intervallo di tempo su 5 minuti, durata fino a 30 minuti e fare clic su "Start".
    NOTA: Sulla base della durata (30 min) e della portata (~ 1,0 μL / min), 30 μL di tampone di funzionamento viene utilizzato per equilibrare il SLB all'interno di un canale, vale a dire 240 μL di tampone di esecuzione per tutti e 8 i canali.
  15. Selezionare lo strumento "Circle" nella scheda "Misura" e disegnare un cerchio in qualsiasi canale. Fare clic destro con il cerchio selezionato e scegliere "Proprietà". Nella scheda "Profilo", seleziona "tutto T" per visualizzare il fileIntensità di fluorescenza in funzione del tempo.
    1. Assicurarsi che questa curva raggiunga un plateau, che indica l'equilibrio, prima di passare alla fase successiva.
  16. Abbassare la soluzione di tampone a un terreno uguale come il dispositivo per fermare il flusso.
  17. Salvare il file di scadenza del tempo.

6. Verifica dell'interazione del dominio di PL con PL (4,5) P 2 contenenti SLB

  1. Preparare le diluizioni del dominio PH utilizzando il buffer di esecuzione come diluente.
    NOTA: poiché esistono otto canali all'interno del dispositivo, utilizzare almeno due di essi per i controlli vuoti. Scegli le estremità finali da ogni lato e usa i canali rimanenti per le diluizioni proteiche. Sono state testate le seguenti concentrazioni di domini PH: 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 e 2,50 μM. Circa 200 μL di ciascuna diluizione era sufficiente per raggiungere l'equilibrio entro 30 minuti.
  2. Uno alla volta, staccare ogni tubo di uscita e applicare 200 μL di ciascuna diluizione proteicaIl canale di uscita usando una pipetta. Non applicare alcuna pressione, lasciare che la gravità faccia il lavoro. Staccare la punta dalla pipetta e lasciarla fissata al dispositivo microfluidico.
  3. Ripetere il passo precedente per ogni canale e assicurarsi che le bolle d'aria non siano introdotte nei canali durante questo processo.
  4. Abbassare il tubo di entrata ad un terreno sotto il dispositivo microfluidico per iniziare a fluire la proteina attraverso i microchannel. Nastro l'estremità libera del tubo in un contenitore di rifiuti. Portare le diluizioni proteiche per 30 min.
    NOTA: Ciò invertire il flusso e consentire che la proteina venga introdotta nei canali. Il tempo per equilibrare e il volume delle diluizioni proteiche necessarie dipenderà dall'affinità dell'interazione.
  5. Sul pannello sinistro del software, nella scheda "Time Lapse", fare clic su "Start" per riprendere l'imaging.
  6. Ripetere la fase 5.15 per assicurarsi che l'equilibrio sia raggiunto. Quando l'esperimento è completo, salva l'intervallo di tempofile.

7. Valutazione della fluidità delle membrane

NOTA: Recupero di fluorescenza Dopo che gli esperimenti di Photobleaching (FRAP) dovrebbero essere eseguiti con ogni nuovo gruppo di SUV e coperture di vetro pulite per garantire che i SLB siano fluidi.

  1. Seguire la procedura per la pulizia delle coperture in vetro (1.1-1.6), fabbricare blocchi PMMS micropaternati (2.1-2.5), preparare SUV (3.1-3.8), assemblare il dispositivo microfluidico (4.1-4.5) e formare SLB (5.1-5.17) come precedentemente descritto.
  2. Mettete a fuoco il microscopio sul doppio strato, impostate il tempo di esposizione a 200 ms e il binning a 1.
  3. Effettuare la foto-candeggina di un punto circolare usando un raggio laser di 532 nm, 2 mW (raggio di 13 μM). Subito dopo la fotopolimerizzazione, iniziare a catturare una serie di immagini ogni 3 s per i primi 45 s, seguita da un intervallo di 30 secondi per il resto del tempo (durata totale di 15 minuti). Una volta che l'acquisizione dei dati è completa, salva il file di scadenza.
  4. Selezionare la sbiancata aRea utilizzando lo strumento di disegno del cerchio per estrarre i valori di intensità di fluorescenza in funzione del tempo. Inoltre, selezionare altre due aree vicine, una corrispondente a una regione non maculata e quella corrispondente a una regione senza SLB.
  5. Calcolare il recupero di fluorescenza ( y ) utilizzando la seguente equazione:
    figure-protocol-1
    NOTA: Qui F t rappresenta l'intensità della regione sbiancata in funzione del tempo, F i rappresenta l'intensità di fluorescenza prima dello sbiancamento (usa "1" come valore normalizzato in questo caso); F 0 è l'intensità di sfondo.
  6. Recupero di fluorescenza trama (asse y) in funzione del tempo (asse x) per generare una curva FRAP. Quindi, inserire i dati in una singola funzione esponenziale come segue,
    figure-protocol-2
    NOTA: Qui A rappresenta la frazione mobile e t 1/2 ):
    figure-protocol-3
  7. Utilizzare il t 1/2 per calcolare la costante di diffusione ( D ):
    figure-protocol-4
    NOTA: Qui R rappresenta il raggio del raggio laser (13 μm). La costante di diffusione per un doppio strato di fluido deve essere di ≥1,0 ​​μm 2 / s.

8. Dati di elaborazione

NOTA: La routine dell'analisi dei dati dipenderà dal microscopio, dal software di elaborazione dell'immagine e dal software di montaggio curva che viene utilizzato.

  1. Apri i file di scadenza del tempo prima (dal passaggio 5.17) e dopo (dal punto 6.6) titolando il dominio PH. Vai all'ultimo fotogramma di ogni file di scadenza del tempo e fai una scansione di linea in tutti i microchannel per ottenere il fluorescenteIn funzione della distanza in pixel ( Figura 6A ). Trasferire i dati in un software di foglio elettronico.
  2. Per ogni microchannel (prima e dopo l'aggiunta di dominio PH), esaminare alcuni dati all'interno del canale e entrambi i lati del canale che rappresentano la linea di base ( Figura 7A ).
    NOTA: L'intensità di fluorescenza del canale vuoto dovrebbe essere rimasta invariata. Tutti gli altri canali sono normalizzati al canale in bianco, quindi è fondamentale avere due canali vuoti e assicurarsi che le loro intensità di fluorescenza rimangano coerenti tra loro.
  3. Applica la seguente formula per normalizzare i dati sul canale in bianco; Un calcolo del campione è fornito in Figura 7B .
    figure-protocol-5
    NOTA: qui la proteina ΔF rappresenta l'intensità di fluorescenza sottrattata di sfondo del canale proteico, Δ; F vuoto rappresenta l'intensità di fluorescenza sottrattata di sfondo del canale in bianco, pre e post si riferiscono a passaggi di titolazione prima e dopo la proteina e α rappresenta il fattore di correzione che è il rapporto delle intensità di fluorescenza del canale proteico e del canale in bianco ([ F protein / F blank ] pre ) con un passaggio di titolazione pre-proteina. Poiché l'intensità della fluorescenza diminuisce in funzione della concentrazione di dominio PH, i dati normalizzati saranno negativi in ​​valore.
  4. Utilizzando un software di montaggio a curva (vedi tabella dei materiali ), tracciare la fluorescenza normalizzata in funzione della concentrazione di dominio PH e adattarsi ad un'isotherm di Langmuir ( Figura 6C ):
    figure-protocol-6
    NOTA: Qui ΔF rappresenta la variazione dell'intensità di fluorescenza rispetto alla variazione massima del fluorescence intensità quando una concentrazione di saturazione di proteine è presente (Af max), mentre il K d, app rappresenta la dissociazione apparente costante, che è uguale alla concentrazione proteica di massa ([PLC-δ1 PH]) alla quale copertura del 50% ( Complesso legato alla membrana). Si tratta di una misurazione basata sull'equilibrio in modo che i dati normalizzati siano adatti a una semplice istamermica Langmuir per estrarre un apparente parametro sperimentale K d, app . Sulla base del software di montaggio K d, l'app per interazione PLC-δ1 PH-PI (4,5) P 2 è 0,39 ± 0,05 μM ( Figura 6B ).

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Risultati

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Abbiamo utilizzato il saggio di modulazione del pH per studiare l'interazione di PL-δ1 domino-PI (4,5) P 2 all'interno di un microprocessore PIP-on-a-chip ( Figura 1 ). Attraverso un protocollo dettagliato, abbiamo dimostrato come preparare e assemblare componenti microfluidici del dispositivo, realizzare piccole vescicole unilamellare ( Figura 2 ), formare SLB all'interno di un dispositivo ( Figu...

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Discussione

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Ogni variante PIP, seppure a basse concentrazioni, è presente sulla superficie citosolica di organismi specifici in cui contribuiscono alla creazione di una composizione fisica e specificità funzionale della membrana organellare 1 . Uno degli usi più importanti di PIPs è come una piattaforma specifica di docking per la moltitudine di proteine ​​che richiedono localizzazione e / o attivazione subcellulare specifica 6 , 7 . A causa del loro...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

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DS e CEC sono stati sostenuti, in parte, dalla sovvenzione AI053531 (NIAID, NIH); SS e PSC sono stati sostenuti dalla sovvenzione N00014-14-1-0792 (ONR).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Vetrino coprioggetti
Vetrino coprioggetti: RettangoliFisher Scientific12-544B22 x 40 x 0,16 - 0,19 mm, n. 1 1/2; Soluzione detergente in vetro borosilicato
7XMP Biomedicals976670Detergente
PYREX Piastra di cristallizzazioneCorning3140-190Piastra in vetro borosilicato con fondo piatto; Diametro x Altezza (190 x 100 mm); Distributore: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0Paragon IndustriesSC-2Kiln
NameCompanyNumero di catalogoComments
PDMS
Sylgard 184 Kit di elastomeri siliconiciDow Corning4019862Polidimetilsilossano (PDMS); Distributore: Ellsworth Adhesives
Essiccatore PYREXVWR89134-402con grado di vuoto
Harris15110-10Harris Uni-Core; diametro 1,0 mm; Punzone per biopsia Miltex con stantuffo (Cat. N. 15110-10) può essere utilizzato come alternativa
NameCompanyCatalog NumberComments
Device
Sistema di pulizia al plasmaPlasmaEtchPE25-JWPompa per vuoto dell'olio a trasmissione diretta a 2 stadi, Servizio O2 (Krytox Charged)
Piastra riscaldante digitaleBenchmarkH3760-HAcquistato tramite Denville Scientific (Cat. n. 1005640)
Micro vetrini smerigliatiVWR48312-003smerigliati, selezionati e prepuliti; realizzato in vetro svizzero; Spessore: 1 mm; Dimensioni: 75 x 25 mm; GR 144
NameCompanyCatalog NumberComments
Mold
AutoCADAutodeskv.2016Software di disegno per la progettazione di fotomaschere
Photomask CAD/Art ServicesN/AIl design con sfondo nero e caratteristiche chiare è stato stampato con una risoluzione di 20k dpi su una maschera trasparente (5 x 7 pollici) da CAD/Art Services
Wafer di siliconeUniversity Wafer1575di prima qualità, lucidato su un lato; 100 mm (4 pollici) di diametro; 525 um Spessore
SU-8 50MicroChem Corp.N/AFotoresist a tono negativo; Penn State Nanofabrication Facility Proprietà
SU-8 SviluppatoreMicroChem Corp.N/APenn State Nanofabrication Facility Proprietà
NameCompanyNumero di catalogoComments
SUV
1-palmitoil-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholineAvanti Polar Lipids850457CPOPC
L-&alfa;-fosfatidilinositolo-4-fosfatoAvanti Polar Lipids840045XPI4P
L-α-fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfatoAvanti Polar Lipids840046XPI(4,5)P2
1-palmitoil-2-oleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamineAvanti Polar Lipids850757CPOPE; Necessario per la sintesi di oSRB-POPE
Lissamina Rodamina B Sulfonil cloruro (isomeri misti)ThermoFisher ScientificL-20Necessario per la sintesi di oSRB-POPE
Sonda lipidica fluorescente sensibile al pH (oSRB-POPE)Sintesiinterna N/Ainterna (Huang D. et al. 2013)
Fiala a scintillazione in vetroVWR66022-065Capacità di volume di 20 mL
Aquasonic 250DVWRN/AMembrane a bagno d'acqua ad ultrasuoni
Nuclepore Track-Etched Whatman110605Membrana in policarbonato; Diametro: 25 mm; Dimensione dei pori: 0,1 um; Distributore: Sigma-Aldrich
CloroformioVWRCX1054-6di grado HPLC
Transferra NanosciencesT.001LIPEX 10 mL Estrusore Thermobarrel
Viscotek 802 DLSMalvern InstrumentsN/ADiffusione dinamica della luce; Penn State X-Ray Crystallography Facility Proprietà
NameAziendaNumero di catalogoComments
Data Analysis
GraphPad PrismGraphPad Softwarev.6Software di adattamento della curva per l'analisi dei dati
NameAziendaNumero di catalogoComments
Microscopio
Axiovert 200M MicroscopioCarl Zeiss MicroscopiaN/AFotocamera
AxioCam MRmMicroscopia Carl ZeissN/ATelecamera
X-Cite 120Excelitas TechnologiesN/ASorgente luminosa
Alexa 568 Set di filtriCarl Zeiss MicroscopyN/AEx/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 SoftwareCarl Zeiss MicroscopyN/Adi elaborazione delle immagini
NameAzienda Numero di catalogoComments
Other
TipsVWR10034-132200 uL puntali per pipette; Punta sottile e liscia per l'applicazione della soluzione proteica nel canale microfluidico
PuntaliVWR53509-070Puntali per pipette da 10 uL; Punta sottile e liscia per l'applicazione della soluzione vescicola nel canale microfluidico
Misuratore di pH Orion Star A321Thermo ScientificSTARA3210
Misuratore di pH Sonda micro pH OrionThermo Scientific8220BNWPmicro sonda
di pH N-(2-idrossietil)-piperazina-N'-(acido 2-etansolfonico)VWRVWRB30487HEPES, acido libero
cloruro di sodioVWRBDH8014-2.5KGRNaCl
TubiCavi alleati e CavoTFT-200-24 NDiametro interno: 0,020-0,026 pollici (0,051-0,066 cm); Spessore della parete: 0,010 pollici (0,025 cm); Tubo flessibile in politetrafluoroetilene a parete sottile; Colore naturale
Azoto gassoso - IndustrialePraxairN/AFornitore locale
Ossigeno gassoso - IndustrialePraxairN/AFornitore locale
Azoto liquidoPraxairN/AFornitore locale
Punzone per biopsia Estrusore LIPEX Software

Riferimenti

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Saggio PIP on a chipbilayer lipidici supportatisaggio di modulazione del pHdominio PH della fosfolipasi Cfosfatidilinositolo 45 bisfosfatofabbricazione di dispositivi microfluidicipiccole vescicole unilaminarimisurazione dell intensit di fluorescenzacostante di dissociazione apparente

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