Analisi del trasferimento di gig Junction-dependent di miRNA con la microscopia 3D-FRAP

Sommario

Qui descriviamo l'applicazione del recupero di fluorescenza tridimensionale dopo la fotopolimerizzazione (3D-FRAP) per l'analisi della shuttling di miRNA dipendente dalla giunzione di giunzione. In contrasto con i metodi comunemente applicati, il 3D-FRAP consente la quantificazione del trasferimento intercellulare di piccoli RNA in tempo reale, con un'elevata risoluzione spaziatura temporale.

Abstract

I piccoli RNA antisensivi, come miRNA e siRNA, svolgono un ruolo importante nella fisiologia cellulare e nella patologia e, inoltre, possono essere utilizzati come agenti terapeutici nel trattamento di diverse malattie. Lo sviluppo di nuove strategie innovative per la miRNA / siRNA terapia si basa su una vasta conoscenza dei meccanismi sottostanti. Recenti dati suggeriscono che piccoli RNAs siano scambiati tra le cellule in un modo di dipendenza dalla giunzione gap, inducendo quindi effetti regolatori genetici nella cellula ricevente. Le tecniche biologiche molecolari e l'analisi citometrica a flusso sono comunemente utilizzate per studiare lo scambio intercellulare di miRNA. Tuttavia, questi metodi non forniscono una elevata risoluzione temporale, che è necessaria quando si studia il flusso junctional gap delle molecole. Pertanto, per studiare l'impatto di miRNA / siRNA come molecole di segnalazione intercellulare, sono necessari nuovi strumenti che consentiranno l'analisi di questi piccoli RNA a livello cellulare. Il presente protocollo descrive l'apPlicazione del recupero tridimensionale di fluorescenza dopo la microscopia fotoblaccante (3D-FRAP) per chiarire lo scambio di giunzioni dipendente dalle molecole di miRNA tra le cellule cardiache. Importante, questo approccio semplice e non invasivo di immagini viva-cellule consente la visualizzazione e la quantificazione del gap junctional shuttling di piccoli RNA a fluorescenza etichettati in tempo reale, con un'elevata risoluzione spaziatura temporale. I dati ottenuti da 3D-FRAP confermano un nuovo percorso di regolazione delle cellule intercellulari, dove i piccoli RNA agiscono come molecole di segnalazione all'interno della rete intercellulare.

Introduzione

I piccoli RNA non codificanti sono importanti attori nella regolazione del gene cellulare. Queste molecole sono composte da 20-25 nucleotidi che si legano ad un specifico mRNA bersaglio, portando al blocco della traduzione o al degradazione mRNA ^{1 , 2} . Il processo di regolazione del gene intrapreso da piccoli RNA, come miRNA e siRNA, è un meccanismo altamente conservato che è stato trovato in molte specie diverse ³ . In particolare, le molecole di miRNA sono di cruciale importanza per una varietà di processi fisiologici, compresa la proliferazione, la differenziazione e la rigenerazione ^{4 , 5} . Inoltre, la disregolazione dell'espressione miRNA è attribuita a molti disturbi patologici. Correlativamente, i miRNAs sono stati dimostrati essere adatti come biomarkers per la diagnosi e come agenti terapeutici per la terapia genica ^{6 , 7} .

Le giunzioni di Gap (GJs) sono strutture proteiche specializzate nella membrana plasmatica di due cellule adiacenti che consentono lo scambio diffusionale di molecole con un peso molecolare fino a 1 kD. Sono stati dimostrati importanti per lo sviluppo del tessuto, la differenziazione, la morte cellulare e le patologie patologiche come il cancro o le malattie cardiovascolari ^{8 , 9 , 10} . Molte molecole sono state descritte come in grado di attraversare canali GJ, ioni, metaboliti e nucleotidi. È interessante notare che anche GJs hanno fornito un percorso per il movimento intercellulare di piccoli RNA ^{11 , 12} . Così, miRNAs possono agire non solo all'interno della cellula in cui vengono prodotte, ma anche all'interno di cellule riceventi. Ciò evidenzia il ruolo dei miRNA nel sistema di trasduzione di segnali intercellulari. Allo stesso tempo, i dati dimostranoTale interconnessione junctional intercellulare è strettamente legata alla funzione miRNA. A causa dell'impatto significativo di miRNA e GJ sull'omeostasi tissutale, la patologia e la diagnosi, una comprensione completa della funzione dei GJ e delle relative dinamiche intercellulari del miRNA contribuirà a chiarire i meccanismi delle malattie basate su miRNA e sviluppare nuove strategie per MiRNA terapie.

A seconda dell'ampiezza del giunto junctional gap, il trasferimento di molecole di miRNA tra le cellule può essere un processo molto rapido. Pertanto, è necessaria una metodologia che consente la visualizzazione e la quantificazione del rapido movimento intercellulare di queste molecole di segnalazione normativa. Comunemente, sono state applicate citometrie di flusso e tecniche molecolari biologiche per dimostrare la shuttling di piccoli RNA ¹¹ , ^{12 , 13 , 14} . Tuttavia, a differenza di FRAP microsCopia, questi approcci non hanno una elevata risoluzione temporale, che è obbligatoria quando si analizza lo scambio di miRNA attraverso GJs. Inoltre, la microscopia FRAP è meno invasiva e quindi rappresenta una potente e innovativa tecnica di imaging a cellule vive per valutare lo scambio di molecole di GJ-dipendenti in diversi tipi di cellule ^{15 , 16 , 17} .

Qui presentiamo un protocollo dettagliato che descrive l'applicazione di 3D-FRAP per valutare il flusso di miRNA tra i cardiomiociti. A questo scopo, i cardiomiociti sono stati trasfettati con miRNA a fluorescenza. Una cellula contrassegnata con questo miRNA è stata fotoblificata e il ritorno di miRNA giunzionale differenziale dalle cellule adiacenti è stato registrato in modo dipendente dal tempo. L'elevata risoluzione temporale degli esperimenti FRAP offre la possibilità di eseguire studi cinetici per la precisa valutazione del trasferimento intercellulare di miRNA e siRNA tra le cellule viventi. MoreoVisto che i piccoli RNA possono essere scambiati attraverso meccanismi diversi con cinetica molto diverse, la microscopia FRAP può contribuire a chiarire la misura in cui i GJs sono coinvolti nei rispettivi processi di spostamento ¹⁸ . Inoltre, 3D-FRAP può essere utilizzato per indagare le alterazioni fisiologiche e patologiche della permeabilità di GJ e il suo impatto sul piccolo trasferimento di RNA ^{15 , 19} .

Protocollo

Tutte le fasi di questo protocollo che coinvolgono topi neonatali sono stati eseguiti per le linee guida etiche per la cura degli animali del Centro medico universitario di Rostock.

1. Preparazione dei piatti della cultura cellulare e del mezzo per la cultura cardiomiocitaria

1. Applicare una piastra di coltura cellulare con gelatina 0,1% in PBS e incubare a 37 ° C per 4 ore oa 4 ° C per una notte. Rimuovere la gelatina e lasciarlo asciugare sotto il flusso laminare aria sterile.
2. Preparare il mezzo di coltura cellulare composto da 50 ml di DMEM integrato con 10% di siero fetale fetale (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina (P / S). Pre-riscaldare a 37 ° C.

2. Isolamento dei cardiomiociti neonatali

1. Sacrificare i topi neonatali (1-2 giorni) con decapitazione con forbici sterili e aprire il torace lungo lo sterno. Rimuovere il cuore con le pinze mentre leggermente premendo il torace insieme e trasferire il cuore in una piastra da 24 pozzetti contenenti HBSS ghiacciata(Senza Ca ²⁺ e Mg ²⁺ ).
2. Togliere i tessuti non cardiaci e le più grandi vaschette con pinze sterili. Trasferire i cuori puliti in un tubo da 1,5 ml contenente HBSS ghiacciato. Utilizzare un massimo di 5 cuori per tubo per la digestione enzimatica.
3. Mince i cuori con piccole forbici in pezzi da <0,5 a 1 mm³.
4. Lavare il cuore macinato con HBSS due volte per aspirazione / aggiunta di HBSS usando una pipetta da 1 ml di microlitro. Rimuovere completamente l'HBSS prima di aggiungere gli enzimi.
5. Per la digestione enzimatica dei cuori neonatali, utilizzare un kit disponibile in commercio e seguire il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali ). Agitare il tubo contenente i cuori macinati ogni 5 min mentre incubando con gli enzimi a 37 ° C per 35 minuti.
6. Le cellule sospese seminano su piastre di coltura di cellule non rivestite contenenti medium di coltura cellulare per 1,5-2 h per consentire l'aderenza della frazione non cardiomiocitaria. Ripetere questo passaggio se un'alta purezzaDei cardiomiociti è necessaria. Se lo si desidera, coltivare ulteriormente la frazione non cardiomiocitaria.
   NOTA: Per una sospensione cellulare di 15 cuori, la fase di pre-placcatura può essere eseguita su colpi di coltura da 75 cm². Di solito, ~ 5 x 10 ⁵ cellule sono ottenute da un cuore neonatale.
7. Raccogliere il surnatante in un tubo conico da 15 ml e centrifugare per 10 min a 300 x g. Risospendere le cellule in 1 ml di terreno di coltura cellulare.
8. Contare le cellule con un emocitometro della camera Neubauer, oppure utilizzare un metodo equivalente.
9. Il piatto ha isolato i cardiomiociti su piatti a 6 pozzetti con una densità di 3 x 10 ⁵ cellule / cm². Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C e 5% CO ₂ .
   NOTA: Facoltativamente, le cellule possono anche essere trasfettate a questo punto. Tuttavia, è stata osservata una maggiore vitalità quando le cellule sono state coltivate per un giorno prima di essere sottoposte ad elettroporazione.

3. Trasfezione con miRNA fluorescente

1. Pre-(Vedi punto 1.2) a 37 ° C in un bagno d'acqua o in un dispositivo equivalente.
2. Preparare una soluzione di 20 μM di miRNA fluorescente in acqua sterile senza RNasi.
3. Preparare il tampone di elettroporazione contenente 90 mM Na ₂ HPO ₄ , 90 mM NaH ₂ PO ₄ , 5 mM KCl, 10 mM MgCl2 e 10 mM di sodio succinato e regolare il pH a 7,2; Il buffer di elettroporazione può essere conservato a -20 ° C per diversi mesi.
4. Staccare le cellule dal piatto di coltura utilizzando 0,05% di trysina per 5 min. Inattivare la tripsina aggiungendo il mezzo di coltura cellulare.
5. Contare le cellule con un emocitometro della camera Neubauer, oppure utilizzare un metodo equivalente. Centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min.
6. Resuspendere le cellule nel tampone di elettroporazione per ottenere una concentrazione di 4 x 10 ⁵ cellule per 100 μL.
7. Mescolare 100 μL di sospensione cellulare con miRNA fluorescente (concentrazione finale: 0,25 μM) in un tubo eCaricare la miscela in una cuvetta di elettroporazione.
   1. Determinare empiricamente la quantità appropriata di miRNA, a seconda del tipo di cellula.
8. Effettuare l'elettroporazione usando un dispositivo di elettroporazione (vedi tabella dei materiali ), usando il programma "G-009".
9. Aggiungere 500 μl di mezzo di coltura cellulare pre-riscaldato e trasferire l'intero sospensione cellulare (4 x 10 ⁵ cellule) in un pozzetto di uno scivolo a 4 pozzetti in vetro. Coltivare le cellule per 1 giorno a 37 ° C in atmosfera di CO _{2 di} 5%.
   NOTA: per l'analisi FRAP, una densità di cella di ~ 80% è ottimale. La trasfezione del miRNA etichettato dovrebbe essere eseguita esclusivamente utilizzando elettroporazione. Poiché la distribuzione omogenea di molecole di miRNA etichettate è utile per la misura FRAP, non è raccomandata la trasfezione basata su reagenti.

4. Applicazione della microscopia 3D-FRAP (Day 3)

1. Riscaldare l'incubatore del microscopio a 37 °; C e accendere il sistema microscopio confocale almeno 2 ore prima della misura FRAP per stabilire un equilibrio termico e diminuire la possibilità di deriva. Se possibile, mantenere un'atmosfera al 5% di CO ₂ .
2. Inserire la diapositiva della camera nel supporto campione.
3. Trovare un gruppo di cardiomiociti trasfettati utilizzando un obiettivo 1.4 NA di petrolio (ingrandimento 400X) e una luce di eccitazione laser da 561 nm a bassa potenza laser, con un range di rilevamento di 570-680 nm.
   NOTA: La definizione delle impostazioni FRAP, l'acquisizione di immagini e l'analisi sono state eseguite usando un software specifico per microscopio (vedere la tabella dei materiali ).
4. Attivare i pulsanti "z-Stack", "Time Series", "Bleaching" e "Regions" nella "Gestione installazioni".
5. Definire i parametri FRAP.
   1. Definire le impostazioni di acquisizione immagini nel menu "Acquisizione" impostando "la dimensione del fotogramma4; A 512 x 512, "passo linea" a 1 e "tempo di scansione" a <1 s.
   2. Nel menu "Canali", regolare le impostazioni di potenza laser, offset e guadagno per ottenere la massima fluorescenza dalla minima eccitazione laser ( ad esempio, potenza laser: 1-5%); Regolare per evitare la saturazione dell'intensità. Impostare la "dimensione pinhole" a 2 μm.
   3. Quindi, nel menu "Regioni", selezionare lo strumento di disegno ROI e utilizzare il cursore per contrassegnare la cella di destinazione, la cella di riferimento e l'area di sfondo. Se necessario, selezionare diverse celle di destinazione per la fotobillatura.
   4. Regolare le impostazioni di fotolibrazione nel menu "Bleaching" ( ad esempio, iterazioni: 9-14, potenza laser per fotolibrazione: 100%, intervallo di acquisizione di immagini: 60 s, cicli: 15). Definire l'inizio dello sbiancamento dopo 3 scansioni iniziali.
   5. Nel menu "z-Stack", definire i limiti per l'acquisizione z-stack, a seconda dello spessore delle celle. Regolare il "numero oF z-strati "a 12 - 15.
   6. Avviare l'esperimento FRAP e registrare il recupero della fluorescenza.
      NOTA: poiché le impostazioni di un esperimento FRAP dipendono dal tipo di cella, dal colorante fluorescente e dal sistema di microscopio, è meglio eseguire esperimenti pilota per determinare i parametri ottimali per FRAP. La schiaratura deve essere sufficiente per ridurre l'intensità iniziale di fluorescenza di almeno il 50%. In genere, il recupero di fluorescenza deve essere registrato ogni 30-60 s fino alla fase di plateau.

5. Analisi dei dati

1. Crea proiezioni massime delle z-stack acquisite e ottiene i valori di intensità della fluorescenza delle cellule bersaglio sbiancate, della cella di riferimento e dello sfondo. Utilizzando il software specifico per microscopio, fare clic su "Elaborazione" → "Proiezione di intensità massima" → selezionare file → "Applica".
   1. In alternativa, utilizzare uno strumento di analisi dell'immagine equivalente ( ad esempio, ImageJ).
2. Copiare i dati di intensità della fluorescenza in tutti i punti di tempo dalla cella di destinazione, lo sfondo e la cella di riferimento in un foglio di calcolo.
   1. Sottrarre l'intensità della priorità bassa e l'intensità della cella di riferimento dai valori di intensità della cella di destinazione per correggere la fotobillatura causata durante il processo di acquisizione. Eseguire le correzioni delle celle di riferimento e di riferimento per ogni punto temporale.
   2. Normalizzare i dati FRAP corretti all'intensità di fluorescenza iniziale prima dello sbiancamento dividendo ogni valore dalla fluorescenza iniziale.
   3. Per ottenere le curve FRAP, impostare la linea di base all'intensità di fluorescenza immediatamente dopo la candeggina sottraendo i valori di intensità di ogni punto temporale.

Risultati

Qui presentiamo la microscopia 3D-FRAP come una tecnica non invasiva per studiare la distanza di giunzione giunzionale del miRNA fluorescente nei cardiomiociti neonatali. I cardiomiociti isolati hanno rivelato il tipico pattern di α-actina striato e contenevano grandi placche di Cx43 lungo i bordi delle cellule cellulari ( Figura 1A , frecce bianche), che hanno permesso l'elevato flusso intercellulare delle molecole. La purezza dei cardiomiociti isolati è st...

Discussione

MiRNAs sono attori chiave della fisiologia cellulare e sono stati dimostrati di agire come molecole di segnalazione utilizzando, tra gli altri, GJs come percorso per lo scambio intercellulare ^{11 , 12 , 22} . Il protocollo attuale presenta una tecnica di imaging in vivo in vitro per caratterizzare questa shuttling dipendente dal GJ utilizzando miRNA fluorescenti all'interno dei cluster di cellule.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
topi neonatali NMRI
Gelatin	Sigma Aldrich	G7041	0,1% soluzione in PBS, sterilizzato
PBS	Pan Biotech	P04-53500
Dulbecco´ s terreno modificato	Pan Biotech	P04-03550
Penicillina/Streptomicina	Thermo Fisher Scientific	15140122	100 U/mL, 100µ g/mL
Siero fetale bovino	Pan Biotech	P30-3306
Kit di isolamento dei cardiomiociti primari
HBSS	Thermo Fisher Scientific	88281	incluso nel kit di isolamento dei cardiomiociti primari
microRNA marcato miRIDIAN Dy547 Mimic	Dharmacon	CP-004500-01-05	si dissolve in acqua priva di RNAsi, soluzione madre 20µ M
Fosfato di sodio monobasico	Sigma	S3139
Fosfato di sodio bibasico	Carl Roth	T877.2
Cloruro di potassio	Sigma	P9333
Cloruro di magnesio	Serva	28305.01
Succinato di sodio	Carl Roth	3195.1
Soluzione di tripsina/EDTA allo 0,05%	Merck	L2153
Vetrini a 4 pozzetti con camera inferiore in vetro	IBIDI	80827	rivestimento con soluzione di gelatina allo 0,1%
Amaxa Nucleofector II	Lonza		Il programma G-009 è stato utilizzato per l'elettroporazione.
Sistema LSM 780 ELYRA PS.1	Zeiss
Excel Anticorpo	Microsoft
α-actinina	Abcam	ab9465	diluizione 1:200
Anticorpo Connexin43	Santa Cruz	sc-9059	diluizione 1:200
capra anti-topo Alexa 594 anticorpo	Thermo Fisher Scientific	A-11005	diluizione 1:300
capra anti-coniglio Alexa 488 anticorpo	Thermo Fisher Scientific	A-11034	diluizione 1:300
Connexin43 siRNA	Thermo Fisher Scientific	AM16708 ID158724	concentrazione finale 250 nM
Near-IR Kit di colorazione di cellule vive/morte	Thermo Fisher Scientific	L10119
CellTrace Calcein Red-Orange	Thermo Scientific	C34851
DAPI colorazione nucleare	Thermo Scientific	D1306