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Articolo metodologico

Induzione e diagnosi dei tumori in

15.3K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/55901

⸱

25 luglio 2017

 , 
1Structural Biology Center, National Institute of Genetics and Department of Genetics, School of Life Science, SOKENDAI, 2Graduate School of Media and Governance, Keio University

In questo articolo

Sommario

L'analisi del clone di mosaico nel disco epiteliale di Drosophila imaginal è un potente sistema di modelli per studiare i meccanismi genetici e cellulari della tumorigenesi. Qui descriviamo un protocollo per indurre tumori nei dischi immaginari di ala Drosophila utilizzando il sistema GAL4-UAS e introdurre un metodo di diagnosi per classificare i fenotipi tumorali.

Abstract

Nelle prime fasi del cancro, le cellule mutanti trasformate mostrano anomalie citologiche, iniziano la sovrabbondanza incontrollata e progressivamente distruggono l'organizzazione tissutale. Drosophila melanogaster è emerso come un popolare sistema di modelli sperimentali nella biologia del cancro per studiare i meccanismi genetici e cellulari della tumorigenesi. In particolare, gli strumenti genetici per i dischi imaginal Drosophila (sviluppo epitelio in larva) consentono la creazione di cellule pro-tumor trasformate all'interno di un normale tessuto epiteliale, una situazione simile a quella iniziale del cancro umano. Un recente studio sulla tumorigenesi nei dischi imaginali dell'ala Drosophila ha tuttavia dimostrato che l'iniziazione del tumore dipende dalla citoarchitettura intrinseca del tessuto e dal microambiente locale, suggerendo che sia importante considerare la suscettibilità specifica della regione a stimoli tumorigenici nella valutazione dei fenotipi tumorali in immagini dischi. Per facilitare l'analisi fenotipica dei progressi tumoraliIn dischi immaginari, qui descriviamo un protocollo per esperimenti genetici usando il sistema GAL4-UAS per indurre tumori neoplastici nei dischi imaginal di ala. Abbiamo inoltre introdotto un metodo di diagnosi per classificare i fenotipi delle lesioni clonali indotte nell'epitelio immaginario, poiché un metodo di classificazione chiaro per discriminare le varie fasi della progressione tumorale (come iperplasia, displasia o neoplasia) non era stato precedentemente descritto. Questi metodi potrebbero essere generalmente applicabili all'analisi clonale dei fenotipi tumorali nei vari organi di Drosophila .

Introduzione

I tessuti epiteliali sono sistemi altamente organizzati che hanno la straordinaria abilità homeostatica per mantenere la propria organizzazione attraverso lo sviluppo e il fatturato delle cellule. Questo robusto sistema di auto-organizzazione, tuttavia, è progressivamente interrotto durante lo sviluppo del tumore. All'inizio dello sviluppo del tumore, all'interno di uno strato epiteliale emergono singole cellule mutanti derivanti dall'attivazione di oncogene o dall'inattivazione del gene del soppressore tumorale. Quando questa "cellula pro-tumorica" ​​trasformata evita un ambiente soppressivo, interferisce con l'organizzazione epiteliale e inizia la proliferazione incontrollata, la tumorigenesi si verifica 1 . Negli ultimi decenni, i notevoli progressi tecnologici nella genetica e nella biologia molecolare hanno fatto notevoli progressi sulla ricerca sul cancro. In particolare, recenti studi che utilizzano gli strumenti di analisi genetica mosaica in Drosophila melanogaster , come il recupero mitotico FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase target)2 e flip-out-GAL4-UAS (sequenza di attivazione a monte) 3 , hanno contribuito notevolmente a una migliore comprensione dei meccanismi genetici coinvolti nella formazione e nella metastasi dei tumori 4 , 5 , 6 .

Studi di un gruppo di geni gonfiori letali di Drosophila conservati, larve giganti letali ( lgl ), dischi di grandi dimensioni ( dlg ) e scribble ( scrib ), hanno evidenziato il rapporto critico tra la perdita di organizzazione epiteliale e lo sviluppo del tumore, in quanto questi geni svolgono ruoli chiave Nella regolazione della polarità delle cellule apicala-basali e della proliferazione cellulare nei tessuti epiteliali 7 . Mentre i dischi imaginal di Drosophila sono normalmente epiteli monolayered, mutazioni omozigote in ognuno di questi tre geni provocano la perdita della struttura e della polarità delle cellule, non differisconoReniate, sovraproliferano e, in ultima analisi, formano masse amorfe multistrato che si fusono con i tessuti adiacenti 7 . Allo stesso modo, la distruzione di questi geni nei mammiferi è coinvolta nello sviluppo di tumori maligni 8 , 9 . I fenotipi neoplastici esposti dai tessuti mutanti hanno portato alla classificazione di questi tre geni come geni conservati, neoplastici del soppressore del tumore (nTSGs) 7 , 8 . Tuttavia, quando le cellule mutanti nTSG omozigoti vengono generate sporadicamente nello sviluppo di dischi immaginari di tipo selvaggio utilizzando la ricombinazione mitotica mediata da FLP-FRT, le cellule mutanti vengono eliminate dal tessuto attraverso l'apoptosi 10 , 11 , dipendente dalla c-Jun N-terminale chinasi (JNK) , 12 , 13 , 14 , estrusione 15 , 16 , o engulfment e fagocitosi da parte dei vicini 17 . In questa epiteli geneticamente mosaica, l'apoptosi viene rilevata per lo più nelle cellule mutanti nTSG situate al limite del clone, suggerendo che le cellule normali adiacenti innescano l'apoptosi delle cellule mutanti nTSG 10 , 11 , 12 , 18 . Recenti studi sulle cellule di mammiferi hanno confermato che questa eliminazione cellulare delle cellule pro-tumoriche è un meccanismo evolutivamente protetto contro il cancro 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .

Un recente studio sui dischi imaginal Drosophila , tuttavia, ha mostrato che i cloni mosaici nTSG-knockdown inducono tumori neoplastici in specificiRegioni dei dischi imaginal di ala 16 . La formazione tumorale iniziale è sempre stata trovata nella regione "cerniera" periferica e non è mai stata osservata nella regione "pouch" centrale dell'epitelio del disco dell'ala, suggerendo che il potenziale tumorigenico delle cellule ntsg-knockdown dipende dall'ambiente locale. La regione del sacchetto centrale funge da "freddo" del tumore in cui le cellule pro-tumorali non mostrano sovrapposizione displastica, mentre la regione di cerniera periferica si comporta come un "hotspot tumorale" 16 . Nelle regioni di sacche di "coldspot", le cellule ntsg-knockdown si delaminano dal lato basale e subiscono l'apoptosi. Al contrario, poiché le cellule a cerniere "hotspot" possiedono una rete di robuste strutture citoscheletriche sui loro lati basali, le cellule di coltura nTSG delaminano dal lato apicale dell'epitelio e iniziano la crescita tumorigenica 16 . Pertanto, l'analisi dei fenotipi tumorali nei dischi immaginari richiede un'attenta analisiDerazione della suscettibilità specifica per regione a stimoli tumorigenici.

Qui descriviamo un protocollo per indurre la formazione di tumori neoplastici nei dischi imaginali dell'ala Drosophila che utilizzano il sistema GAL4-UAS- RNAi mediante i quali vengono generati nTSG-knockdown cellule nell'epitelio normale dell'ala. Anche se questi sistemi sperimentali sono utili per studiare le fasi iniziali del cancro, non è stato chiaramente descritto chiaramente un metodo di classificazione chiaro per valutare le fasi della progressione tumorale nell'epitelio disco immaginario. Pertanto, proponiamo anche un metodo di diagnosi per classificare i fenotipi clonali pro-tumori indotti nell'epitelio di alafibre in tre categorie: iperplasia (accumulazione di un numero eccessivo di cellule apparenti normali con proliferazione aumentata), displasia (tessuto premaligeno composto da anomalie apparenti Cellule) e neoplasie (tumore benigno o maligno composto da cellule aventi un aspetto anomalo e pattern anomalo di proliferazione).

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Protocollo

1. Crociere di mosche e induzione del clone

  1. Rimuovere tutte le mosche nella fiala 12 h prima di raccogliere le mosche vergini.
  2. Anestetizzare le mosche nel flaconcino iniettando il gas CO 2 e posizionare le mosche su un moscerino di CO 2 .
  3. Trasferite 10-20 femmine vergini e 10 maschi dal tampone di volo CO 2 in un flaconcino fresco e incubate per 1 giorno a 25 ° C.
  4. Trasferire queste mosche in una fiala fresca e incubare per 12 h a 25 ° C.
    NOTA: Scartare il primo flaconcino in quanto le femmine vergini non posano le uova sufficienti nel primo giorno.
  5. Per linee enhancer-GAL4, rimuovere le mosche adulti e incubare la fiala a 25 ° C fino alla dissezione.
  6. Per l'induzione di cloni mosaici per flip-out-GAL4, rimuovere le mosche adulte e incubare il flaconcino per 2 - 4 giorni a 25 ° C. Il tempo di incubazione prima dello shock termico dipende dallo scopo sperimentale. Un colpo di calore 2 giorni dopo la deposizione dell'uovo (AED) genera cloni mosaici in secondi immaturiInstallare epitelio immaginario. Una scossa termica dopo 3 o 4 giorni AED genera cloni mosaici in epitelio immaginario differenziato all'inizio del periodo medio e terzo.
    NOTA: È importante esaminare l'effetto di alterazione del tempo di scossa termico sui fenotipi tumorigenici.
  7. Per l'induzione di cloni di mosaico per flip-out-GAL4, scuotere il flacone mediante immersione in un bagno d'acqua di 37 ° C per 10-45 minuti seguito da incubazione per 2 - 3 giorni a 25 ° C.
    NOTA: Le informazioni relative al tempo di scossa, tempi e tempi di incubazione in ciascun esperimento sono mostrati nelle leggende delle figure.

2. Dissezione delle larve

  1. Raccogli le larve di terzo istante vaganti con un bastone di legno o pinze sbattute, genotiparle con appositi marcatori fluorescenti ( ad es . EGFP) sotto un microscopio stereoscopico a fluorescenza e collocarli in un piatto di dissezione con PBS (salina tampone fosfato).
  2. Lavare le larve in PBS pipettando con pipette di trasferimento di plastica da 2 ml.
  3. Pinch il centro della larva con una pinza e strappare il corpo a metà con le altre pinze.
  4. Pinch il gancio della bocca della metà anteriore con una pinza e spingere la bocca verso il corpo con l'altra pinza per girare il corpo dentro di fuori.
  5. Rimuovere materiali inutili come ghiandole salivari o corpi grassi con pinze.

3. Fissazione e colorazione degli anticorpi

  1. Trasferire la metà anteriore disseccata del corpo larvale (compresi i dischi flap imaginali) in un tubo di plastica da 1,5 ml e fissare in 1 mL di soluzione Fix (4% di formaldeide in PBS) per 10 minuti a temperatura ambiente al buio con una rotazione delicata.
    ATTENZIONE: la formaldeide è tossica e ha un potenziale cancerogeno. Indossare guanti e indumenti protettivi per evitare il contatto con la pelle.
    NOTA: In questa parte, tutti i passaggi avvengono in un nutatore a temperatura ambiente al buio, salvo diversa indicazione.
  2. Rimuovere la soluzione Fix e scartare. Lavare i tessuti con 1 mL di PBT (0,3% TritSu X-100 in PBS) tre volte per 15 minuti ciascuno.
  3. Rimuovere il PBT e aggiungere 1 mL di PBTG (albumina serica bovina 0,2% e siero di capra normale 5% in PBT) per bloccare e nutrire 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
  4. Rimuovere PBTG e aggiungere soluzione primaria anticorpale opportunamente diluita con PBTG (vedi Tabella Materiali ) e nutrire per una notte a 4 ° C.
  5. Rimuovere la soluzione anticorpale primaria e lavare i tessuti con 1 mL di PBT tre volte per 15 minuti ciascuno.
  6. Rimuovere PBT e aggiungere soluzione secondaria anticorpale opportunamente diluita con PBTG (1: 400). Nocciola per 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C.
  7. Rimuovere la soluzione anticorpale secondaria e lavare i tessuti con 1 ml di PBT due volte per 15 minuti ciascuno.
  8. Per macchiare F-actina, rimuovere PBT e aggiungere soluzione Phalloidin opportunamente diluita in PBS (1:40). Poi nutrire per 20 minuti. Rimuovere la soluzione di Phalloidin e lavare i tessuti con 1 mL di PBT due volte per 15 minuti ciascuno.
  9. Per contare il DNA nucleare, rimuovere PBT e aggiungere DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo) (0,5 μg / mL di DAPI in PBS). Poi nutate 10 min.
    ATTENZIONE: DAPI ha potenziale cancerogeno. Indossare guanti e indumenti protettivi per evitare il contatto con la pelle.
  10. Rimuovere la soluzione DAPI e lavare i tessuti con 1 ml di PBT due volte per 15 minuti ciascuno.
  11. Sciacquare una volta in 1 ml di PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
  12. Rimuovere PBS e aggiungere 500 μl di glicerolo al 100% come mezzo di pre-montaggio.

4. Montaggio su diapositive microscopiche

  1. Posizionare i tessuti macchiati su uno scivolo a microscopio utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica da 2 ml.
  2. Trasferire i tessuti a gocce di supporto di montaggio su un'altra scivolo a microscopio con pinze.
  3. Tenere la fine del tessuto sezionato con una pinza e tirare fuori i dischi antennari del cervello e dell'occhio con le altre pinze.
    NOTA: Tenere i cervelli dissected per posizionarli vicino ai dischi imaginal di ala. I cervelli fungono da piattaforma che impediscono la copertura a schiacciare i dischi imaginali dell'ala.
  4. Per isolare i dischi fantinici dell'ala, tenere la fine del tessuto sezionato con una pinza e graffiare delicatamente la parete del corpo e strappare i dischi con le altre pinze.
    NOTA: Se è difficile trovare i dischi fantinici dell'ala, sbucciare la trachea dal retro al lato anteriore. I dischi imaginali delle ali sono attaccati alla trachea.
  5. Coprire delicatamente i dischi imaginali con una copertura e un sigillo con smalto; Conservare a 4 ° C.

5. Microscopia confocale

  1. Per acquisire immagini confocali utilizzando parametri di acquisizione dell'immagine di microscopio confocale, compresi l'intervallo di lunghezza d'onda di emissione, l'intensità del laser, il guadagno, l'offset, la velocità di scansione e la dimensione dell'immagine 24 .
    NOTA: Per una procedura dettagliata delle impostazioni di acquisizione delle immagini, fare riferimento al manuale di istruzioni fornite da ciascun produttore del microscopio.
  2. Per catturare singoli coLe sezioni nfocal di un intero disco fantasiale, utilizzare un obiettivo obiettivo 20X.
  3. Acquisire immagini tridimensionali mediante scansione z-stack a dimensioni passo-passo di 0,5-1,0 μm utilizzando lenti 40X o 60X.
    NOTA: Per analizzare i fenotipi cellulari in alta risoluzione, le dimensioni di un'immagine devono essere superiori a 512 x 512 pixel.

6. Analisi delle immagini usando ImageJ

  1. Utilizza Fiji, un software ImageJ open-source, focalizzato sull'analisi delle immagini biologiche (https://fiji.sc/) 25 , per acquisire e analizzare immagini confocalizzate a z-stack.
  2. Per acquisire le sezioni verticali, aprire le immagini z-stack in ImageJ e selezionare la voce di menu "Immagine / Stacks / Reslice".
    NOTA: L'asse XZ o l'asse YZ possono essere selezionati nel menu Reslice. La sezione verticale può essere ottenuta anche in una direzione arbitraria, disegnando una retta o un rettangolo sull'immagine z-stack.

7. Diagnosi dei fenotipi neoplastici

  1. Apri la verticaleSezioni (asse XZ o YZ) ottenute da un insieme di immagini a z-stack e analisi di fenotipi morfologici e colorazione degli anticorpi.
  2. Per la diagnosi dei fenotipi tumorali, si concentrano principalmente i seguenti tre punti: (1) se una massa cellulare, compresi i cloni di abbattimento, si discosta dallo strato epiteliale principale, (2) se la localizzazione subcellulare delle proteine ​​junctional è alterata in questa massa cellulare , E (3) se il diametro di questa massa cellulare è maggiore di 4 celle.
  3. Classificare i fenotipi tumorali secondo il diagramma di flusso descritto nella Figura 1 .

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Risultati

Per dimostrare la formazione di tumori neoplastici sperimentalmente indotta da un nocciolamento nTSG mediato da RNAi nei dischi imaginal di ala Drosophila , sono stati utilizzati tre diversi driver GAL4 per esprimere UAS-RNAi per lgl o scrib : (1) sd-GAL4, che guida un'espressione UAS forte nel Sacchetto ala e espressione lieve nelle regioni delle cerniere ( Figura 2 e Figura 3A

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Discussione

Il sistema GAL4-UAS è uno degli strumenti genetici più potenti per l'espressione genica mirata in Drosophila 26 e consente notevolmente l'induzione e l'analisi delle cellule tumorali in vivo 4 . Questo sistema consente la generazione di cloni che portano a eliminare i geni del soppressore tumorale o sovraespressione di oncogeni all'interno del tessuto epiteliale di tipo selvaggio, una situazione molto simile agli stadi iniziali del cancro ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo J. Vaughen per una lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 e la Fondazione di Ricerca di Takeda Science Grant a YT

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Wako162-19321
TritonX-100Wako168-11805
FormaldeideWako064-00406
albumina sierica bovinaSigmaA7906
siero normaledi capra SigmaG6767
terreno di montaggio, VectashieldVector LaboratoriesH-1000
DAPISigmaD9542
mouse-anti-Dlg 4F3Developmental Studies Hybridoma Bank4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203diluito in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1Developmental Studies Hybridoma Bank3A6B4, RRID:AB_5797803 miscelato 1:1:1 e diluito in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1Developmental Studies Hybridoma Bank3B8D12, RRID:AB_5797813 miscelato 1:1:1 e diluito in PBTG, 1:40
mouse-anti-MMP1Developmental Studies Hybridoma Bank5H7B11, RRID:AB_5797793 miscelato 1:1:1 e diluito in PBTG, 1:40
mouse-anti-atubulinDevelopmental Studi Hybridoma BankAA4.3, RRID:AB_579793diluito in PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 FalloidinaSonde molecolariA22283diluito in PBS, 1:40
anticorpo IgG anti-topo di capra, Alexa Fluor 546Sonde molecolariA11030diluito in PBTG, 1:400
NameCompanyNumero di catalogoComments
Fly ceppi
sd-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center#8609ricombinato con UAS-EGFP
upd-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center#26796ricombinato con UAS-EGFP
UAS-lgl-RNAiVienna Drosophila RNAi center#51247
UAS-scrib-RNAiVienna Drosophila RNAi center#105412
UAS-RasV12Centro di stoccaggio di Bloomington Drosophila#64196
UAS-Yki3SACentro di stoccaggio di Bloomington Drosophila#28817
hsFLPCentro di stoccaggio di Bloomington Drosophila#6
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4)Bloomington Drosophila Stock Center#4780ricombinato con UAS-EGFP
UAS-EGFPBloomington Drosophila Stock Center#5428X chromosome
UAS-EGFPBloomington Drosophila Stock Center#6658terzo cromosoma
UAS-Dicer2Bloomington Drosophila Stock Center#24650secondo cromosoma
UAS-Dicer2Bloomington Drosophila Stock Center#24651terzo cromosoma
vkg-GFPMorin et al. 2001GFP trappola proteica

Riferimenti

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