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Articolo metodologico

Isolamento delle pericelle di tipo I e II di muscoli scheletrici del mouse

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DOI:

10.3791/55904

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26 maggio 2017

 ,  , 
1College of Pharmacy, University of Minnesota

In questo articolo

Sommario

Questo lavoro descrive un protocollo basato su FACS che consente l'isolamento facile e simultaneo di periciti tipo I e II di tipo muscolare scheletrico.

Abstract

Periciti sono cellule multipotenti perivascolari che mostrano eterogeneità in organi diversi o addirittura all'interno dello stesso tessuto. Nei muscoli scheletrici esistono almeno due sottopopolazioni pericite (chiamate tipo I e tipo II) che esprimono differenti marcatori molecolari e hanno differenti capacità di differenziazione. Utilizzando i topi a doppio-transgenici NG2-DsRed e Nestin-GFP, le pericelle di tipo I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) e di tipo II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) sono state isolate con successo. Tuttavia, la disponibilità di questi topi doppi transgenici impedisce l'uso diffuso di questo metodo di purificazione. Questo lavoro descrive un protocollo alternativo che consente l'isolamento facile e simultaneo di periciti tipo I e II di tipo muscolare scheletrico. Questo protocollo utilizza la tecnica di selezione delle cellule attivata con fluorescenza (FACS) e mira a PDGFRβ, piuttosto che a NG2, insieme al segnale Nestin-GFP. Dopo l'isolamento, digitare I e tyPe periciti mostrano morfologie distinte. Inoltre, le pericie di tipo I e tipo II isolate con questo nuovo metodo, come quelle isolate dai topi doppi transgenici, sono rispettivamente adipogenici e miogenici. Questi risultati suggeriscono che questo protocollo può essere utilizzato per isolare le sottopopolazioni pericite dai muscoli scheletrici e, probabilmente, da altri tessuti.

Introduzione

La distrofia muscolare è un disturbo muscolare-degenerativo che non ha finora trattamenti efficaci. Lo sviluppo di terapie che promuovono la rigenerazione dei tessuti è sempre stato di grande interesse. La rigenerazione tissutale e la riparazione dopo danni dipendono da cellule staminali residui / cellule progenitrici 1 . Le cellule satellitari sono impegnate da cellule precursori myogeniche che contribuiscono alla rigenerazione muscolare 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Tuttavia, il loro utilizzo clinico è ostacolato dalla loro limitata migrazione e dal basso tasso di sopravvivenza dopo l'iniezione, nonché dalla loro diminuita capacità di differenziazione dopo l'amplificazione in vitro 8 , 9 , 10 , 11 . Oltre ai satellitiLe cellule ei muscoli scheletrici contengono anche molte altre popolazioni cellulari con potenzialità myogenica 12 , 13 , 14 , 15 , 16 come le cellule interstiziali posizionali di fattore di crescita del recettore beta-beta (PDGFRβ) derivato dalle piastrine. Ci sono prove che dimostrano che le cellule PDGFRβ + derivate dal muscolo sono in grado di differenziarsi in cellule miogeniche e migliorare la patologia muscolare e la funzione 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFRβ prevalentemente etichetta periciti 21 , che sono cellule perivascolari con pluripotenza 22 , 23 . Oltre al PDGFRβ, molti altri marcatori, tra cui Neuron-Glial 2 (NG2) e CD146, sono utilizzati anche per iDentify pericytes 21 . Va comunque osservato che nessuno di questi marcatori è specifico per cicli 21 . Recenti studi hanno rivelato due sottotipi di periciti muscolari, chiamati tipo I e tipo II, che esprimono diversi marcatori molecolari e svolgono funzioni distinte 19 , 24 , 25 . Biochimicamente, le pericelle di tipo I sono NG2 + Nestin, mentre le pericelle di tipo II sono NG2 + Nestin + 19 , 24 . Funzionariamente, i periciti di tipo I possono subire differenziazione adipogenica, contribuendo all'accumulo di grassi e / o alla fibrosi, mentre i periciti di tipo II possono differenziarsi lungo il percorso miocogenico, contribuendo alla rigenerazione muscolare 19 , 24 , 25 . Questi risultati dimostrano che: (1) i periciti di tipo I possono bE destinato al trattamento di disturbi degenerativi grassi / fibrosi, e (2) le pericie di tipo II hanno un grande potenziale terapeutico per la distrofia muscolare. Ulteriori indagini e caratterizzazione di queste popolazioni richiedono un protocollo di isolamento che consente la separazione dei periciti di tipo I e tipo II ad un alto livello di purezza.

Attualmente, l'isolamento delle sottopopolazioni pericite si basa sui topi doppi transgenici NG2-DsRed e Nestin-GFP 19 , 24 . La disponibilità di topi NG2-DsRed e la qualità della maggior parte degli anticorpi NG2 limitano l'uso diffuso di questo metodo. Dato che tutti i periciti NG2 + esprimono PDGFRβ nei muscoli scheletrici 19 , 20 , 24 , ipotizziamo che NG2 può essere sostituito da PDGFRβ per l'isolamento delle periciti e delle loro subpopulazioni. Questo lavoro descrive un protocollo basato su FACS cheUtilizza la colorazione PDGFRβ e il segnale Nestin-GFP. Questo metodo è meno impegnativo per gli investigatori perché: (1) non richiede lo sfondo NG2-DsRed e (2) utilizza gli anticorpi PDGFRβ commercialmente disponibili, ben caratterizzati. Inoltre, consente l'isolamento simultaneo di periciti di tipo I e di tipo II ad alta purezza, permettendo di approfondire la biologia e il potenziale terapeutico di queste sottopopolazioni pericite. A seguito della purificazione, queste cellule possono essere coltivate in coltura e le loro morfologie possono essere visualizzate. Questo lavoro mostra anche che i periciti di tipo I e II tipo isolati utilizzando questo metodo, come quelli purificati da topi doppi transgenici, sono rispettivamente adipogenici e miogenici.

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Protocollo

I topi transgenici Wildtype e Nestin-GFP sono stati alloggiati nella struttura animale presso l'Università del Minnesota. Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università del Minnesota e sono stati conformi alla Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Dissezione del muscolo e isolamento a cellule singole

  1. Eutanizzare i topi adulti (6-10 settimane, sia maschi che femmine) con il tribromoetanolo (250 mg / kg, ip) e sterilizzare la loro pelle dell'addome con il 70% di etanolo.
    NOTA: il Tribromoetanolo è stato usato qui invece che la ketamina per l'anestesia / eutanasia, in quanto la chetamina è nota per interagire con i recettori NMDA, che potrebbero avere un impatto sullo studio.
  2. Posizionare i topi in posizione supina e utilizzare un bisturi per eseguire un'incisione orizzontale sulla pelle addominale. Scorri la pelle manualmente, tirando in direzioni opposte per esporre i muscoli posteriori.
  3. RaccolteI muscoli di entrambi i muscoli posteriori usando pinze e forbici. Conservarli in salina sterilizzata tamponata fosfato (PBS) integrata con 1% di penicillina-streptomicina (P / S) sul ghiaccio.
  4. Lavare i muscoli dell'indietro dissected in PBS ghiacciato-freddo completato con 1% P / S due volte e trasferirli in una piastra sterile da 10 cm.
  5. Separare con cautela i nervi, i vasi sanguigni e il tessuto connettivo dai muscoli usando le pinze e le forbici sotto un microscopio di dissezione ad ingrandimento 2X.
  6. Tagliare finemente e tagliare i muscoli in piccoli pezzi (1-2 mm 3 ) usando le forbici sterili e le lame. Se necessario, aggiungere una piccola quantità di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) per assicurare che i muscoli non venissero asciugati.
  7. Determinare meccanicamente il tessuto pipettando su e giù attraverso una pipetta serologica da 10 ml 10 volte.
  8. Aggiungere la soluzione di digestione appena fatta (DMEM integrata con 0,2% di collagene tipo 2) alla miscela. Incubare a 37 ° C per 2 ore con gentlAgitazione a 35 giri / min.
  9. Tritare usando un ago da 18 G per omogeneizzare la miscela. Quindi, centrifugare a 500 xg per 5 min. Scartare il surnatante e quindi risospendere il pellet nello 0,25% di tripto / EDTA. Incubare a 37 ° C per 10 min. Ripetere la fase di centrifugazione ancora due volte.
  10. Aggiungere 10 ml di DMEM completato con 20% di siero fetale fetale (FBS) alla soluzione e centrifugare a 500 xg per 5 min. Scartare il surnatante e risospendere il pellet nel tampone di lisi di globuli rossi (155 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO3 e 0,1 mM EDTA).
  11. Centrifugare a 500 xg per 5 min. Scartare il surnatante e risospendere il pellet nel tampone di smistamento (20 mM HEPES, pH 7,0, 1 mM EDTA e 1% BSA in PBS Ca / Mg 2+ , pH 7,0). Filtrare la miscela attraverso un filtro da 40 μm per ottenere una sospensione a singola cellula.
  12. Centrifugare a 500 xg per 5 min. Scartare il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di tampone di smistamento.
  13. Conti ilNumero di cellule con un emocitometro e diluire la sospensione a singola cellula a 5 x 10 6 / mL nel tampone di smistamento.

2. Colorazione e ordinamento delle cellule

  1. Preparare i controlli e il campione come descritto nella tabella 1 . Macellare la sospensione a singola cellula con i rispettivi anticorpi sul ghiaccio per 30 minuti, come descritto nella tabella 1 .
  2. Centrifugare a 500 xg per 5 minuti e lavare i pellet due volte con il tampone di smistamento.
  3. Aggiungere DAPI alle soluzioni a cellule singole, come indicato nella tabella 1. Utilizzare 5 μg / mL DAPI (concentrazione finale) per il controllo monocromatico DAPI e 1 μg / mL DAPI per il controllo PDGFRβ-PE-FMO e il campione. Tenere tutti i tubi sul ghiaccio durante l'esperimento.
  4. Accendere il destinatario e il software. Eseguire la scansione e inserire un chip di classificazione da 100 μm quando richiesto.
  5. Eseguire l'impostazione automatica ( ad esempio l' allineamento del chip, la calibrazione della gocciolina, la calibrazione dei flussi laterali e il ritardo di ordinamento calibratiOn) caricando le perline di impostazione automatica quando richiesto.
  6. Una volta completata l'installazione automatica, vai alla scheda "Esperimento", fai clic su "Nuovo" e seleziona "Modello vuoto" da "Modelli pubblici".
  7. Sotto "Impostazioni di misura" immettere "DAPI" per "FL1", "Nestin-GFP" per "FL2" e "PDGFRβ" per "FL3." Deselezionare le caselle per "FL4" - "FL6".
  8. Controlla le caselle per attivare i laser 405, 488 e 561 e fai clic su "Crea nuovo esperimento".
  9. Selezionare l'opzione "Start Compensation Wizard" e seguire le istruzioni software "Compensation Wizard" per impostare la compensazione.
    1. Carica il controllo non conservato e fai clic su "Avvia". Fare clic su "Detector & Threshold Settings" e regolare il guadagno del sensore dei sensori FSC e BSC per mettere la popolazione sulla bilancia.
    2. Anno DominiSolo i livelli di guadagno dei flussi di fluorescenza FL1-FL3 per posizionare le popolazioni negative sul lato sinistro degli istogrammi. Fare clic sul pulsante "Registra" per registrare i dati.
    3. Caricare controlli monocromatici uno a uno quando richiesto. Fai clic su "Avviare e registrare" per registrare i dati. Regolare i cancelli per le popolazioni positive sugli istogrammi. Fai clic su "Avanti".
    4. Vai a "Calcola Matrice" nella scheda "Compensi" e fai clic su "Calcola" nel pannello "Calcola impostazioni di compensazione" per eseguire la compensazione. Fai clic su "Fine" per uscire dalla "Creazione guidata remunerazione".
  10. Caricare il controllo PDGFRβ-PE-FMO e fare clic su "Start". Disegna una porta poligonale (Porta A) attorno alle celle di interesse sotto il grafico "Tutti gli eventi".
  11. Fare doppio clic all'interno della porta A per creare una trama figlia. Cambiare l'asse Y su DAPI e disegnare una porta poligonale (Porta B) attorno alle celle viventi (DAPI low ). Fare doppio clic su iNside Gate B per creare una trama figlia. Cambiare l'asse X su FSC-H e l'asse Y a FSC-W e disegnare una porta poligonale (Porta C) attorno alle singole per eliminare i dublettini.
  12. Fare doppio clic all'interno della porta C per creare una trama figlia. Cambiare l'asse X a Nestin-GFP e l'asse Y a PDGFRβ-PE. Fare clic sul pulsante "Registra" per registrare i dati.
  13. Caricare il campione e ripetere i passaggi 2.11-2.12. Dopo la registrazione, fai clic su "Pausa" per conservare il campione.
  14. Definire i limiti di gating per le cellule PDGFRβ + e Nestin-GFP + basate sul controllo PDGFRβ-PE-FMO. Disegnare le porte per le popolazioni di PDGFRβ + Nestin-GFP e PDGFRβ + Nestin-GFP + .
  15. Sotto "Metodo di ordinamento", selezionare "Tubi a 2 vie" e assegnare le celle "PDGFRβ + Nestin-GFP" e "PDGFRβ + Nestin-GFP + " ai tubi di raccolta destro e sinistrospettivamente. Montare i tubi di raccolta 15 ml di riempimento con tampone di riempimento nella fase di raccolta e fare clic sul pulsante "Load Collection".
  16. Fai clic sul pulsante "Riprendi" per mantenere il campione in esecuzione. Fare clic su "Start Sort" per raccogliere le cellule PDGFRβ + Nestin-GFP (periciti di tipo I) e PDGFRβ + Nestin-GFP + (periciti di tipo II).

3. Analisi post-ordinamento

  1. Centrifugare le cellule ordinate a 500 xg per 5 minuti, risospendere il pellet in 1 mL di mezzo di pericce (vedere tabella dei materiali ) e contare la densità cellulare usando un emocitometro.
  2. Periciti di tipo I e II di tipo su copertine rivestite con poli-D-lisina (PDL) a ~ 1 x 10 4 cellule / cm 2 . Crescere in media pericta per 3 giorni a 37 ° C con 5% CO 2 .
  3. Il giorno 3, esaminare la morfologia pericita (sotto il contrasto di fase) e l'espressione endogena di Nestin-GFP utilizzando un micro fluorescenteCampo di applicazione (laser di eccitazione: 488 nm, filtro di eccitazione: 470/40 nm e filtro di emissione: 515/30 nm). Prendere le immagini sotto un obiettivo 20X (0,45 NA).
  4. Sostituire il mezzo di pericite con adipogenic (mezzo di base basale MSC mouse + supplemento stimolatorio adipogenico) e myogenic (DMEM + 2% cavallo di cavallo) per iniziare rispettivamente la differenziazione adipogenica e miogenica, come descritto in precedenza 20 . Cambiare il supporto ogni 2-3 giorni.
  5. Fissare le cellule il giorno 17 (14 giorni dopo la differenziazione adipogenica / miogenica) in 4% di paraformaldeide (PFA) per 20 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Attenzione, PFA è un cancerogeno.
  6. Eseguire l'immunocitochimica contro la perilipina (marcatore di adipociti) e la S-myosina (marcatore miootubo / miofibre maturo), come descritto nelle pubblicazioni precedenti 19 , 20 .
    1. Lavare le cellule fisse 3 volte in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
    2. Aggiungere buffer di blocco (PBSCompleta di siero di asina al 5%, 3% BSA e 0,3% Triton X-100) e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
    3. Incubare le cellule con anticorpi anti-perilipina (2 μg / mL) e / o anti-S-myosina (2 μg / mL) a 4 ° C per una notte.
    4. Lavare le cellule 3 volte in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
    5. Incubare le cellule con anticorpi anti-coniglio di Alexa 555 (4 μg / mL) e / o Alexa555 anti-mouse (4 μg / mL) a temperatura ambiente per 1 ora.
    6. Lavare le cellule 3 volte in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
    7. Montare le cellule immunocoste con supporto di supporto contenente DAPI (vedere la tabella dei materiali). Esaminare la perilipina e l'espressione di S-myosina usando un microscopio fluorescente (laser di eccitazione: 543 nm, eccitazione 540/45 nm e emissione di 600/50 nm) e fotografare con un obiettivo 40X (0,60 NA).

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Risultati

I parametri FACS, compresa l'intensità laser e la compensazione dei canali, vengono corretti in base ai risultati di controlli non controllati e controlli monocromatici. Il controllo PDGFRβ-PE-FMO viene utilizzato per impostare il gating per la popolazione di PDGFRβ-PE + ( Figura 1A ). Tra le cellule PDGFRβ-PE, due popolazioni che rappresentano le cellule Nestin-GFP + e Nestin-GFP sono chiaramente separate ( Fig...

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Discussione

Periciti sono cellule perivascolari multipotenti 22 , 23 situate sulla superficie abluminale dei capillari 21 , 26 . Nei muscoli scheletrici, i periciti sono in grado di differenziarsi lungo i percorsi adipogenici e / o miogenici 19 , 20 , 24 . Recenti studi hanno rivelato due sottopopolazioni di periciti, con d...

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Dichiarazioni

Tutti gli autori non hanno alcun conflitto di interessi per divulgare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da una sovvenzione di Fund-A-Fellow della Fondazione Myotonic Dystrophy (MDF-FF-2014-0013) e dello Scienziato per la Sviluppo dell'American Heart Association (16SDG29320001).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Smistatore di celleSonySH800
Installazione automatica PerlineSonyLE-B3001
DMEMGibco11995
Avertin SigmaT48402
Pericyte Growth MediumScienCell1201
MSC Basal Medium (Mouse)Stemcell Technologies5501
Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse)Stemcell Technologies5503
Siero fetale bovinoGibco16000
Siero di cavalloSigmaH1270
Collagenasi Tipo 2WorthingtonLS004176
0,25% Tripsina/EDTA Gibco25200
Penicillina/StreptomicinaGibco15140
PDLSigmaP6407
PDGFRβ-PE AnticorpoeBioscience12-1402
Anticorpo perilipinaSigmaP1998
Anticorpo S-miosinaDSHBMF-20
Alexa 555-anticorpo anti-coniglio& nbsp;ThermoFisher ScientificA-31572
Alexa 555-anti-anticorpo topoThermoFisher ScientificA-31570
Terreno di montaggio con DAPIVector LaboratoriesH-1200
DAPIThermoFisher ScientificD1306
HEPESGibco15630
EDTAFisherBP120
BSASigmaA2058
NH4ClFisher ScientificA661
KHCO3Fisher ScientificP184
PBSGibco14190
Aghi da 18 GBD305196
Pipetta sierologica da 10 mLBD357551
OneComp eBeadseBioscience01-1111

Riferimenti

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