Questo lavoro descrive un protocollo basato su FACS che consente l'isolamento facile e simultaneo di periciti tipo I e II di tipo muscolare scheletrico.
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Articolo metodologico
Isolamento delle pericelle di tipo I e II di muscoli scheletrici del mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
Periciti sono cellule multipotenti perivascolari che mostrano eterogeneità in organi diversi o addirittura all'interno dello stesso tessuto. Nei muscoli scheletrici esistono almeno due sottopopolazioni pericite (chiamate tipo I e tipo II) che esprimono differenti marcatori molecolari e hanno differenti capacità di differenziazione. Utilizzando i topi a doppio-transgenici NG2-DsRed e Nestin-GFP, le pericelle di tipo I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) e di tipo II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) sono state isolate con successo. Tuttavia, la disponibilità di questi topi doppi transgenici impedisce l'uso diffuso di questo metodo di purificazione. Questo lavoro descrive un protocollo alternativo che consente l'isolamento facile e simultaneo di periciti tipo I e II di tipo muscolare scheletrico. Questo protocollo utilizza la tecnica di selezione delle cellule attivata con fluorescenza (FACS) e mira a PDGFRβ, piuttosto che a NG2, insieme al segnale Nestin-GFP. Dopo l'isolamento, digitare I e tyPe periciti mostrano morfologie distinte. Inoltre, le pericie di tipo I e tipo II isolate con questo nuovo metodo, come quelle isolate dai topi doppi transgenici, sono rispettivamente adipogenici e miogenici. Questi risultati suggeriscono che questo protocollo può essere utilizzato per isolare le sottopopolazioni pericite dai muscoli scheletrici e, probabilmente, da altri tessuti.
Introduzione
La distrofia muscolare è un disturbo muscolare-degenerativo che non ha finora trattamenti efficaci. Lo sviluppo di terapie che promuovono la rigenerazione dei tessuti è sempre stato di grande interesse. La rigenerazione tissutale e la riparazione dopo danni dipendono da cellule staminali residui / cellule progenitrici 1 . Le cellule satellitari sono impegnate da cellule precursori myogeniche che contribuiscono alla rigenerazione muscolare 2 , 3 , 4 , 5 , 6 ,
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Protocollo
I topi transgenici Wildtype e Nestin-GFP sono stati alloggiati nella struttura animale presso l'Università del Minnesota. Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università del Minnesota e sono stati conformi alla Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Dissezione del muscolo e isolamento a cellule singole
- Eutanizzare i topi adulti (6-10 settimane, sia maschi che femmine) con il tribromoetanolo (250 mg / kg, ip) e sterilizzare la loro pelle dell'addome con il 70% di etanolo.
NOTA: il Tribromoetano....
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Risultati
I parametri FACS, compresa l'intensità laser e la compensazione dei canali, vengono corretti in base ai risultati di controlli non controllati e controlli monocromatici. Il controllo PDGFRβ-PE-FMO viene utilizzato per impostare il gating per la popolazione di PDGFRβ-PE + ( Figura 1A ). Tra le cellule PDGFRβ-PE, due popolazioni che rappresentano le cellule Nestin-GFP + e Nestin-GFP sono chiaramente separate ( Fig.......
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Discussione
Periciti sono cellule perivascolari multipotenti 22 , 23 situate sulla superficie abluminale dei capillari 21 , 26 . Nei muscoli scheletrici, i periciti sono in grado di differenziarsi lungo i percorsi adipogenici e / o miogenici 19 , 20 , 24 . Recenti studi hanno rivelato due sottopopolazioni di periciti, con d.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori non hanno alcun conflitto di interessi per divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da una sovvenzione di Fund-A-Fellow della Fondazione Myotonic Dystrophy (MDF-FF-2014-0013) e dello Scienziato per la Sviluppo dell'American Heart Association (16SDG29320001).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Smistatore di celle | Sony | SH800 | |
| Installazione automatica Perline | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Siero fetale bovino | Gibco | 16000 | |
| Siero di cavallo | Sigma | H1270 | |
| Collagenasi Tipo 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0,25% Tripsina/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillina/Streptomicina | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Anticorpo | eBioscience | 12-1402 | |
| Anticorpo perilipina | Sigma | P1998 | |
| Anticorpo S-miosina | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anticorpo anti-coniglio& nbsp; | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-anticorpo topo | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Terreno di montaggio con DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| Aghi da 18 G | BD | 305196 | |
| Pipetta sierologica da 10 mL | BD | 357551 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 |
Riferimenti
- Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispens....
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Ristampe e permessi
