Questo manoscritto descrive i metodi per applicare la tecnologia del microarray peptide alla profilazione di specificità degli anticorpi che riconoscono gli istoni e le loro modificazioni post-traslazionali.
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Articolo metodologico
Analisi della specificità degli anticorpi istonici con microarray di peptide
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le modificazioni post-traduzionali (PTMs) sulle proteine dell'istone sono ampiamente studiate per i loro ruoli nella regolazione della struttura cromatica e dell'espressione genica. La produzione di massa e la distribuzione di anticorpi specifici ai PTM istonici ha facilitato notevolmente la ricerca su questi segni. Poiché gli anticorpi PTM dell'istone sono reagenti chiave per molte applicazioni di biochimica cromatica, è necessaria un'analisi rigorosa della specificità degli anticorpi per un'accurata interpretazione dei dati e un progresso continuo nel campo. Questo protocollo descrive una pipeline integrata per la progettazione, la fabbricazione e l'uso di microarray peptidi per la profilazione della specificità degli anticorpi istoni. Gli aspetti di progettazione e analisi di questa procedura sono facilitati da ArrayNinja, un pacchetto software open source e interattivo che abbiamo recentemente sviluppato per semplificare la personalizzazione dei formati di stampa con microarray. Questa pipeline è stata utilizzata per la visualizzazione di un gran numero di anticorpi anti-PTM di istone commercialmente disponibili e ampiamente utilizzatiE i dati generati da questi esperimenti sono liberamente disponibili tramite un database di specificità anticorpo istante in linea e in espansione. Al di là degli istoni, la metodologia generale descritta qui può essere applicata ampiamente all'analisi degli anticorpi PTM-specifici.
Introduzione
Il DNA genomico è imballato elegantemente all'interno del nucleo delle cellule eucariotiche con proteine dell'istone per formare la cromatina. La subunità ripetizione della cromatina è il nucleosoma, che consiste di 147 coppie di basi di DNA avvolto attorno ad un nucleo octameric di proteine istoni H2A, - H2B, H3, H4 e 1. La cromatinica è ampiamente organizzata in euchromatin pienamente ricoperti e domini eterocromatina strettamente confezionati. Il grado di compattazione della cromatina regola la misura in cui i macchinari di proteine possono accedere al DNA sottostante per eseguire processi fondamentali del DNA come la replica, l....
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Protocollo
1. Installazione e esecuzione di ArrayNinja
- Scaricare e installare Oracle Virtual Box da www.virtualbox.org.
- Scaricare e decomprimere la macchina virtuale ArrayNinja (VM) da http://research.vai.org/Tools/arrayninja.
- Aprire Virtual Box e aggiungere l'ArrayNinja VM facendo clic su "Machine", "Aggiungi" e selezionando arrayninja.vbox dalla cartella in cui è stato salvato ArrayNinja VM.
- Avviare ArrayNinja selezionandolo all'interno di Virtual Box e facendo clic sulla freccia verde 'start'.
- Virtual Box apre una nuova finestra e visualizza un messaggio che consente di accedere alla VM navigando il browser w....
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Risultati
Questo protocollo è stato utilizzato per progettare e realizzare una piattaforma microarray peptide per l'analisi della specificità degli anticorpi PTM. L'array richiede una libreria di più di 300 funzionalità peptide uniche (20-40 residui di lunghezza) che rappresentano molte delle combinazioni note di PTM trovate sulle proteine di istone del nucleo e delle varianti 38 . Questa pipeline è stata un cavallo di lavoro per lo screening di molti anticorpi PT.......
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Discussione
L'affidabilità degli anticorpi nelle applicazioni di ricerca biomedica è fondamentale 46 , 47 . Ciò è particolarmente vero nella biochimica cromatica data la posizione degli anticorpi come strumenti chiave per la maggior parte delle tecniche sviluppate per caratterizzare l'abbondanza e la distribuzione di PTM istoniche. Il protocollo qui presentato illustra una pipeline ottimizzata per la progettazione, la fabbricazione e l'uso di microarray peptidi .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da Van Andel Research Institute e da una borsa di studio degli Istituti Nazionali di Sanità (CA181343) a SBR
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tampone di stampa | ArrayIt | PPB | |
| BSA Omnipure | 2390 | ||
| Vetrini per microscopio rivestiti di streptavidina | Greiner Bio-one | 439003-25 | |
| polipropilene Piastra a 384 pozzetti | Greiner Bio-one | 784201 | |
| Biotina-fluoresceina | Sigma | 53608 | |
| stampante microarray a contatto | Aushon | 2470 | Aushon 2470 Microarray Stampante |
| contatto Stampante Microarray | Gene Machines | OmniGrid 100 | OmniGrid Microarray |
| Stampante PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Blocking Buffer | ArrayIt | SBB | |
| Penna in cera idrofobica | Vector Labs | H-4000 | ImmEdge Penna PAP a barriera idrofobica |
| in silicone Guarnizione | Grace Bio-labs | 622511 | |
| Recipiente di ibridazione | Thermo Scientific | 267061 | o recipiente simile |
| Anticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente | Life Technologies | A-21244 | Alexa Fluor 647 (anti-coniglio) |
| Anticorpo secondario coniugato con colorante fluorescente | Life Technologies | A-21235 | Alexa Fluor 647 (anti-topo) |
| Cera Imprinter | ArrayIt | MSI48 | |
| Tween-20 | Omnipure | 9490 | |
| Scanner per microarray | Innopsys | InnoScan 1100AL | o scanner per microarray equivalente |
| EipTitan Histone Peptide Microarray | Epicypher | 112001 | |
| AbSurance Pro Histone Peptide Microarray | Millipore | 16668 | |
| MODified Histone Peptide Array Active | Motif | 13001 | |
| Codice istone Microarray di peptidi | JPT | His_MA_01 | |
| Cera | Oak | GulfWax | per imprinter |
| per cerai Camera di ibridazione per vetrini Microarray umidificata VWR | 97000-284 | ||
| Camera di lavaggio per vetrini per microscopio ad alta produttività | Microscopio ArrayIt | HTW | |
| centrifuga a vetrino | VWR | 93000-204 | |
| Anticorpo 1 | Abcam | 8898 | |
| Anticorpo 2 | Millipore | 07-473 | |
| Peptide istonico biotinilato | EpiCypher | 12-0001 | Peptide di esempio. Peptidi simili con varie modifiche sono disponibili da diverse fonti commerciali. |
| ImageMagick | https://www.imagemagick.org/script/index.php | ||
| ArrayNinja | https://rothbartlab.vai.org/tools/ |
Riferimenti
- van Steensel, B. Chromatin: constructing the big picture. EMBO J. 30 (10), 1885-1895 (2011).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Rothbart, S. B., Strahl, B. D.
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Ristampe e permessi
