Articolo metodologico

Scansione retrovirale: Mappatura dei siti di integrazione MLV per definire regioni regolatori specifiche per le cellule

DOI:

10.3791/55919

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28 maggio 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Genome Research, Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia, 2Laboratory of Chromatin and Gene Regulation During Development, Imagine Institute, 3Institute for Biomedical Technologies, CNR, 4Généthon, 5Sorbonne Paris Cité - Université Paris Descartes

In questo articolo

Sommario

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Qui descriviamo un protocollo per la mappatura genomica dei siti di integrazione dei vettori retrovirali basati su virus della leucemia murina Moloney nelle cellule umane.

Abstract

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I vettori retrovirali a base virale di leucemia murina Moloney (MLV) si integrano prevalentemente in promotori e promotori acetilati. Per questo motivo, i siti di integrazione di mLV possono essere utilizzati come marcatori funzionali di elementi regolatori attivi. Qui presentiamo uno strumento di scansione retrovirale, che consente la identificazione genica di promotori e promotori specifici delle cellule. In breve, la popolazione di cellule bersaglio viene trasdotta con un vettore derivato da mLV e il DNA genomico viene digerito con un enzima di restrizione a taglio frequente. Dopo la legatura di frammenti genomici con un linker DNA compatibile, la reazione a catena di polimerasi mediata da linker (LM-PCR) consente l'amplificazione dei giunti del genoma del virus-ospite. La sequenza massiccia degli ampliconi viene utilizzata per definire il profilo di integrazione mLV in tutto il genoma. Infine, sono definiti cluster di integrazioni ricorrenti per identificare regioni regolatori specifiche per le cellule, responsabili dell'attivazione di programmi transcrizionali specifici di tipo cellulare.

ad esempio cellule staminali somatiche) che non dispongono di marcatori robusti per l'isolamento prospettico.

Introduzione

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L'identità cellulare è determinata dall'espressione di set specifici di geni. Il ruolo degli elementi cis-regolatori, come promotori e promotori, è fondamentale per l'attivazione di programmi transcrizionali specifici di tipo cellulare. Queste regioni regolatrici sono caratterizzate da caratteristiche specifiche di cromatina, quali modificazioni peculiari dell'istone, fattori di trascrizione e co-fattori legati e accessibilità cromatica, che sono stati ampiamente utilizzati per la loro identificazione a livello genomico in diversi tipi di cellule 1 , 2 , 3 . ....

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Protocollo

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1. MLV Trasduzione di cellule umane

  1. Isolare le cellule bersaglio e trasportarle con un vettore retrovirale derivato da mlV che ospita il gene del reporter eGFP e pseudotipizzato con vescicolare Stomatite Virus G (VSV-G) o la glicoproteina dell'amfotropo 16 .
    1. Tenere le cellule mock transduced come un controllo negativo per le analisi seguenti. Poiché i vettori retrovirali basati su mLV possono trasducere cellule divide in modo efficiente, coltivare la popolazione delle cellule bersaglio in condizioni che stimolano la divisione cellulare. Le condizioni di trasduzione devono essere specificamente ottimizzate p....

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Risultati

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Flusso di lavoro della procedura di scansione retrovirale

Il flusso di lavoro della procedura di scansione retrovirale è schematizzato in Figura 1 . La popolazione delle cellule bersaglio viene purificata e trasfusa con un vettore retrovirale derivato da mLV che esprime un gene reporter del eGFP. Il transgene è affiancato dalle due identiche ripetizioni terminali lunghe (5 'e 3' LTR), garantendo la s.......

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Discussione

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Qui abbiamo descritto un protocollo per la mappatura genomica dei siti di integrazione di mLV, un retrovirus che mira alle regioni di cromatina, contrassegnato epigeneticamente come promotori e promotori attivi. I passi critici e / o le limitazioni del protocollo includono: (i) trasduzione mLV della popolazione cellulare target; (Ii) amplificazione di giunzioni virali-host da parte di LM-PCR; (Iii) recupero di un'alta percentuale di siti di integrazione. I vettori retrovirali basati su mLV trasudano in modo efficien.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Consiglio europeo della ricerca (ERC-2010-AdG, GT-SKIN), Ministero italiano dell'istruzione, delle università e della ricerca (FIRB-Futuro in Ricerca 2010-RBFR10OS4G, FIRB-Futuro in Ricerca 2012-RBFR126B8I_003 , EPIGEN Epigenomics Flagship Project), il Ministero della Salute italiano (Giovani ricercatori Chiamata 2011 GR-2011-02352026) e la Fondazione Imagine Institute (Parigi, Francia).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
PBS, pH 7.4ThermoScientific10010031o equivalente
Siero fetale bovinoThermoScientific16000044o equivalente
Provette da 0,2 mlfornitore
Provette da 1,5 mldi laboratorio
QIAGEN QIAmp DNA mini Kit QIAGEN51306o equivalente
T4 DNA ligasi New England BioLabsM0202T
T4 DNA Ligasi Tampone di reazioneNew England BioLabsM0202T
Linker Plus Filamento oligonucleotidefornitoredi laboratorio 5'-PO4-TAGTCCCTTAAGCGGAG-3'   (Grado di purificazione: SDS-PAGE)
Linker Minus Strand oligonucleotidegenerale di laboratorio5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCCGCTTAAGGGAC-3' (Grado di purificazione: SDS-PAGE)
Tru9IRoche-Sigma-Aldrich11464825001
SuRE/Cut Buffer MRoche-Sigma-Aldrich11417983001
PstI Roche-Sigma-Aldrich10798991001
SuRE/Cut Buffer HRoche-Sigma-Aldrich11417991001
Platinum Taq DNA Polimerasi Alta FedeltàInvitrogen11304011
10 mM dNTP MixInvitrogen18427013o acqua di
grado PCRlaboratorio generale
ciclatore termico a 96 pozzetti (con coperchio riscaldato)fornitore
primer linkerdi laboratorio5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (Grado di purificazione: grado PCR)
MLV-3' Primer LTRdi laboratorio generale5'-GACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGG-3' (Grado di purificazione: grado PCR)
linker nested primer 454di laboratorio generale5'-GCCTTGCCAGCCCGCTCAG[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Grado di purificazione: SDS-PAGE)
MLV-3' LTR nested primer 454general lab supplier5'-GCCTCCCTCGCGCCATCAGTAGC[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Grado di purificazione: SDS-PAGE)
linker nested primer Illuminageneral lab supplier5'-TCGTCGGCAGCGTGAGAGAG-[AGGGCTCCGCTTAAGGGAC](Grado di purificazione: SDS-PAGE)
MLV-3' Primer nidificato LTR Illuminadi laboratorio generale5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACC](Grado di purificazione: SDS-PAGE)
Soluzione di acetato di sodio (3M) pH 5.2fornitore
Etanolo (assoluto) per biologia molecolareSigma-AldrichE7023o
equivalente Kit di clonaggio Topo TA (con vettore pCR2.1-TOPO)InvitrogenK4500-01
Kit di estrazione del gel QIAquickQIAGEN28704
AgarosioSigma-AldrichA9539o
equivalente Bromuro di etidio.Sigma-AldrichE1510o equivalente
100 bp DNA ladderInvitrogen15628019o equivalente
6x tampone di caricoThermoScientificR0611o equivalente
NanoDrop 2000 UV-Vis SpectrophotometerThermoScientificND-2000
Nextera XT Index kitIlluminaFC-131-1001 o FC-131-1002
2x KAPA HiFi Hot Start Ready Mix KAPA BiosystemsKK2601
Supporto magnetico dinale per provette da 2 mlInvitrogen12321Do
equivalente Kit Agencourt AMPure XP da 60 mlBeckman Coulter GenomicsA63881
Tris-HCl 10 mM, pH 8.5fornitore
Agilent 2200 Sistema TapeStationAgilent TechnologiesG2964AAo equivalente
D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5582o
reagenti D1000Agilent Technologies5067-5583o equivalente
Kit di quantificazione della libreria KAPA per piattaforme Illumina (ABI Prism)KAPA BiosystemsKK4835
ABI Prism 7900HT Sistema di PCR in tempo reale veloceBiosystems applicato 4329003
NaOH 1.0 N, molecolare di laboratorio generale
HT1 (tampone di ibridazione)Illumina di reagenti MiSeq
Kit di reagenti MiSeq v3 (150 cicli)IlluminaMS-102-3001
Sistema MiSeqIlluminaSY-410-1003
PhiX Control v3IlluminaFC-110-3001
di laboratorio generico fornitore generico generale fornitore equivalente fornitore di di laboratorio generale fornitore generale fornitore fornitore fornitore di laboratorio generaledi laboratorio generico equivalenti fornitore di livello biologicoFornito nel kit

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  2. Shlyueva, D., Stampfel, G., Stark, A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet.

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PCR mediata da linkerdigestione del DNA genomicodigestione con enzimi di restrizioneanalisi di citometria a flussoelettroforesi su gel di agarosiopreparazione della libreriasequenziamento profondo

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