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Articolo metodologico

In Situ Caratterizzazione di Shewanella oneidensis MR1 biofilm di SALVI e ToF-SIMS

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DOI:

10.3791/55944

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18 agosto 2017

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1Earth and Biological Sciences Directorate, Pacific Northwest National Laboratory, 2Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory

In questo articolo

Sommario

Questo articolo presenta un metodo per la coltivazione di un biofilm per in situ spettrometria totale di ione secondaria tempo di volo per la mappatura chimica allo stato idratato, attivata da un reattore di microfluidica, sistema per analisi presso l'interfaccia liquida di vuoto. Shewanella oneidensis MR-1 con proteine di fluorescenza verde è stato usato come modello.

Abstract

Biofilm batterici sono comunità di superficie-collegati che sono ampiamente studiata per capire la loro auto-prodotti sostanze polimeriche extracellulari (EPS) e i loro ruoli in microbiologia ambientale. Questo studio descrive un metodo per coltivare biofilm allegato al sistema per l'analisi all'interfaccia liquido di vuoto (SALVI) e raggiungere in situ chemical mapping di un biofilm vivente mediante spettrometria di massa di ioni secondari di tempo di volo (ToF-SIMS). Questo viene fatto attraverso la coltura di batteri sia all'esterno che all'interno del canale SALVI con la nostra installazione specializzata, nonché attraverso tecniche di imaging ottici per rilevare la presenza di biofilm e spessore prima analisi ToF-SIMS. I nostri risultati mostrano picchi caratteristici del biofilm Shewanella nel suo stato naturale idrata, evidenziando al suo ambiente cluster d'acqua localizzate, come pure di EPS frammenti, che sono drasticamente diversi di biofilm stesso disidratato stato. Questi risultati dimostrano la capacità di innovazione di SALVI che permette per l'imaging di biofilm in situ con uno strumento di imaging chimico basati su vuoto.

Introduzione

Biofilm batterici sono comunità di superficie-associati che si sono evolute nel tempo come una difesa per i batteri di sopravvivere variando negativi stimoli fisici e meccanici, in cui le cellule sono in grado di allegare e sopravvivere in molti ambienti possibili. 1 , 2 i biofilm sono ampiamente studiati e hanno applicazioni in molti campi quali la biomedicina, ingegneria biomedica, l'agricoltura e ricerca industriale e sviluppo. 1 , 2 comprendere la mappatura chimica di queste comunità microbiche complesse, tra cui loro autoprodotti sostanze polimeriche extracellulari (EPS) e il loro ambiente di cluster di acqua locale, è essenziale per ottenere un'accurata e dettagliata rappresentazione della loro attività biologica. 2

Biofilm esistano e crescono all'interno di uno stato altamente idratato. Questo presenta una grande sfida nell'utilizzo di tecniche di analisi delle superfici basate su vuoto come spettrometria di massa di ioni secondari di tempo di volo (ToF-SIMS) dovuto la difficoltà nello studio liquidi volatili nel vuoto. Di conseguenza, tecniche di analisi delle superfici basate su vuoto sono stati limitati quasi esclusivamente a studiare campioni di biofilm al solo allo stato secco. Tuttavia, studiando un biofilm nel suo stato essiccato inibisce l'indagine accurata del suo microambiente biologico vero. Causa spesso drastici cambiamenti alla morfologia EPS integrità e biofilm, che è stata dimostrata dopo aver confrontato i risultati spettrali di massa secca biofilm agli studi in situ di liquido. 3 , 4 questo articolo presenta una soluzione per lo studio di biofilm nel loro naturale stato idratato impiegando l'uso del nostro sistema per l'analisi a liquido vuoto interfaccia (SALVI),5,6 un reattore microfluidici che contiene liquido sotto la sua membrana di nitruro (SiN) di silicio sottile in un microchannel di polidimetilsilossano (PMD), fornendo così accesso diretto per il fascio di ioni secondari sonda pur mantenendo l'integrità strutturale della matrice liquida all'interno di un vuoto camera. 7 , 8

S. oneidensis MR-1 mutato per esprimere proteine di fluorescenza verde (GFP) è stato scelto come organismo modello per questa illustrazione di procedura di biofilm grazie alla sua versatilità metabolica e di uso comune in microbiologia applicata ed ambientale, che è stato basato pesantemente sulla sua capacità uniche per la riduzione del metallo e trasferimento di elettroni extracellulare. 9 , 10 , 11 inoltre, la presenza di GFP ammessi per facile biofilm-spessore continuo monitoraggio mediante microscopia a fluorescenza, utilizzando un filtro di fluoresceina isotiocianato (FITC). Nostri studi precedenti hanno indicato la prova di questo batterio favorendo allegato alla finestra peccato utilizzando l'imaging di fluorescenza in operando per la crescita di biofilm ad uno spessore di fino a 100 micrometri. 4 , 12 mentre questa carta discuterà solo la conferma della presenza di biofilm attraverso microscopia di fluorescenza, la SALVI è compatibile con altri metodi di imaging ottici come super-resolution imaging di fluorescenza (cioè, illuminazione strutturata microscopia (SIM)9) e laser confocale microscopia (CLSM)4di imaging). Imaging ottico può servire per misurare lo spessore del biofilm e ottenere un'immagine 3D di, la forma del biofilm come appare, confermando il suo spessore ed il suo attaccamento alla finestra di peccato. 9 mentre GFP è stato utilizzato nell'analisi SIMS, s. oneidensis senza GFP è stato usato per la curva di crescita, come questa unica misura necessaria della densità ottica e non richiede alcuna formazione immagine fluorescente. Generalmente, la differenza tra la GFP taggati e senza tag specie nella curva di crescita è insignificante. Inoltre, mentre questo protocollo utilizza S. oneidensis MR-1 GFP come organismo modello per descrivere la procedura, questa procedura è stata progettata per qualsiasi ceppo batterico che può essere necessaria per la coltivazione all'interno di SALVI. Anche se, data la conoscenza del ceppo batterico necessario, alcune condizioni di crescita come tempo, temperatura e ossigeno ambiente potrebbero essere necessario essere modificati per accogliere il ceppo di batteri per essere utilizzato. Per mezzo di crescita, questa procedura utilizza il brodo di soia medio, Trittico "nanofili" (TSB) senza destrosio e tryptic soy agar (TSA) senza destrosio per la coltura. La composizione del mezzo "nanofili" è stato appositamente formulata per la crescita e per il monitoraggio delle estensioni della membrana e Periplasma di S. oneidensis che sembrano prendere la forma di piccoli fili e la composizione media è stata stabilito nella precedente ricerca. 13 , 14

Il nostro protocollo precedente su in situ liquido ToF-SIMS ha illustrato il beneficio che SALVI ha da offrire per immobilizzazione della proteina e l'attaccamento al peccato, come pure un protocollo dettagliato sulla riduzione dei dati e analisi ToF-SIMS. 12 piuttosto che ripetere passaggi di riduzione dei dati, questa carta servirà invece focalizzare l'approccio unico di impostazione e coltivando i biofilm all'interno nostro microchannel SALVI, come pure i passaggi imaging per rilevare la presenza di biofilm e spessore preventivo per l'analisi ToF-SIMS. Mentre biofilm sono stati precedentemente limitati solo asciugato campioni all'interno della camera di vuoto-base superficie tecniche analitiche, EPS e biofilm chimica mappatura dettagliata di biofilm live possa ora essere ottenuto in situ a causa di questa nuova funzionalità.

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Protocollo

1. preparazione dei materiali

  1. Preparazione di Medium tubi
    1. bottiglie di siero (uno per ogni cultura di biofilm e tre per ogni curva di crescita)
      Nota: come accennato nell'introduzione, qualsiasi crescita mezzo adatto a fornire i nutrienti necessari per il ceppo di batteri di interesse può essere utilizzato per questa procedura; in questo caso, " nanofili " media e TSB senza supporto di destrosio è stato utilizzato per la crescita di S. oneidensis MR-1 GFP. 13
      1. deposito 20 mL di terreno di coltura in una bottiglia di siero di 70 mL, tappo il tappo e la bottiglia a crimpare. Coprire la parte superiore con un pezzo di carta stagnola pulita sterile.
      2. Autoclave la bottiglia con un ciclo liquido per 30 min a 121 ° C. poi, conservare il flacone di siero sterile a temperatura ambiente.
    2. Provette di coltura anaerobica
      1. depositare 5 mL di terreno di coltura in una provetta di coltura anaerobica con spazio di testa aria, mettere sul tappo e bottiglia a crimpare. Coprire la parte superiore con un foglio sterile.
  2. Preparando Bubble Trap tubi
    1. con attenzione usando un ago da 22 gauge, fare un buco attraverso un tappo di gomma del flacone di siero.
    2. Tagliare 20 a 1/32 " politetrafluoroetilene (PTFE) della tubazione con un rasoio tali che una delle estremità del segmento di tubazione è aguzza.
    3. Utilizzando l'estremità appuntita, infilare il tubo di PTFE attraverso il foro nella parte superiore del tappo di gomma. Spingere il tubo fino a circa 2 cm è attraverso il tappo e tagliare l'estremità appuntita di tubo flessibile in PTFE con un rasoio per avere un piatto fine.
    4. Togliere lo stantuffo di una siringa da 5 mL e montare il tappo di gomma dal punto 1.2.3 nell'estremità aperta della siringa. L'estremità di 2 cm del tubo di PTFE è all'interno della canna della siringa. Questo è il gorgogliatore.
    5. Avvolgere il gorgogliatore (il PTFE tubo, tappo di gomma e siringa) effettuata nel passaggio 1.2.4 con foglio di alluminio e fissare con nastro autoclave. Autoclave per sterilizzare il tubo con una gravità del pacchetto della stagnola del ciclo a 121 ° C per 30 min. memorizzare il pacchetto di alluminio sigillata a temperatura ambiente fino a che pronto per l'uso nel passaggio 2.4.
  3. Curva di crescita batterica
    Nota: questo protocollo utilizza S. oneidensis MR-1 GFP come organismo modello per la crescita di biofilm in SALVI. Tuttavia, questa procedura può essere adattata per ospitare altri batteri che crescono aerobicamente o anaerobicamente. A seconda di quale ceppo viene utilizzato, tempo di crescita e ambiente potrebbe essere necessario essere regolata.
    Nota: scorte batteriche congelatore-80 ° C ha consistito di una miscela 1:1 di TSB senza destrosio e glicerolo. Nell'esempio di curva di crescita mostrata nella Figura 1 B è stato preparato utilizzando una coltura starter di TSB con nessun destrosio, trasferito in quantità rispettive 0,2 mL tre volte per bottiglie da 70 mL siero con 20 mL " nanofili " mezzo per rimuovere tracce di TSB. Tuttavia, questo protocollo presuppone che verrà utilizzato solo un terreno di coltura, e che i trasferimenti successivi non potranno essere condotto, come questo è stato fatto con queste particolari soluzioni medie per S. oneidensis. Anche se non descritto in questo protocollo, trasferimenti extra come questo sono raccomandati come inizialmente depositando i batteri per il ricco TSB aiuta le cellule congelate recuperare; e tre trasferimenti successivi a " nanofili " assicura che tutti i TSB è andato e che tasso di crescita tipici che si verifica.
    1. Inoculando la coltura Starter
      1. rimuovere lo stock di glicerolo batterica dal congelatore-80 ° C e scaldare il brodo con una mano guantata scongelare più rapidamente possibile. Spostare questo stock di freezer per la cappa di sicurezza biologica (BSC).
      2. All'interno il BSC, utilizzare una siringa da 1 mL con ago 22G collegato per trasferire 0,1 mL di Stock in freezer in una provetta di coltura anaerobica innevate e aggraffato contenente 5 mL di medium di crescita con nessun destrosio, preparata al punto 1.1.2. Smaltire il rimanente brodo di freezer nel contenitore dei rifiuti biologico appropriato, come congelamento nuovamente potrebbe scioccare le cellule.
      3. Incubare la coltura starter in un incubatore/agitatore a 30 ° C a 150 rotazioni al minuto (rpm) e assicuratevi di prendere la densità ottica a 600 nm (OD 600) lettura quando si è pronti per l'uso. Registrare il tempo di crescita e OD 600 tale che può essere fatto a quel tempo stesso per ogni uso successivo, tale che i risultati sono riproducibili. Ad esempio, questa coltura starter era permesso di crescere per 15 h e utilizzata un OD 600 di circa 1.0.
    2. Inoculando crescita medio
      1. prendere le bottiglie di tre siero preparate al punto 1.1.1.2 e la coltura starter preparato in 1.3.1.3 e portare entrambi a BSC.
      2. All'interno il BSC, usando una siringa sterile da 1 mL con un ago 22G, 0,1 mL di soluzione di trasferimento dalla coltura starter a ciascuna delle bottiglie del siero, rispettivamente.
      3. Sterilizzare la parte superiore delle bottiglie del siero con 70% di etanolo e coprire con un foglio di alluminio sterilizzato, etichettare correttamente e trasferimento a Agitatore orbitale all'interno di un'incubatrice. Impostare l'agitatore orbitale a 150 rpm e impostare l'incubatrice a 30 ° C. Incubare fino a che punto i primi dati di 600 OD è adottata, entro passo 1.3.3.
    3. OD ottenere 600 punti dati
      1. preparare uno spazio vuoto che depositano 100 µ l di filtro-sterilizzato distillata deionizzata (DI) l'acqua in una provetta sterile. Avvolgere pellicola plastica paraffina intorno alla parte superiore della provetta in modo che l'acqua non vengano contaminato. Conservare a temperatura ambiente. Uso questo vuoto con lo spettrofotometro UV/Vis prima di prendere qualsiasi punti di dati per la curva di crescita inserendo la cuvetta e premendo " vuoto ".
        Nota: Ogni 48 h un nuovo vuoto dovrebbe essere preparato per evitare lettura errata, come regolarmente sostituendo uno spazio vuoto è buona pratica.
      2. Per ogni punto di dati OD 600, rimuovere le bottiglie di siero preparate nel passaggio 1.3.2.3 dall'incubatore e trasferimento a un BSC sterilizzato. Prendere 0,1 mL di inoculato da ogni flacone di siero e deposito in tre etichettato separatamente le provette sterili.
      3. Dopo la tranciatura, inserire la provetta contenente la cultura in spettrofotometro ultravioletto visibile (UV/Vis) e leggere il OD 600 uno alla volta e registrare tutte le tre letture per quel punto di tempo.
        Nota: Per S. oneidensis MR-1, i punti dati sono stati presi a 1, 14, 28, 32, 41, 57, 81 e 105 h dopo l'inoculazione. La crescita è completa quando i batteri è stata completata la fase di morte. Questi punti dovrebbero essere adeguati di conseguenza se c'è mancanza di conoscenza sulla crescita particolare tempo e tendenza dei batteri utilizzati nel presente protocollo. Se vi è incertezza circa la tendenza di crescita, dati punti dovrebbero essere raccolti più frequentemente, per esempio, ogni tre ore per le prime 12 h, ogni 6 h per successive 36 h, a intervalli di 12 h per il seguente h 100 e a intervalli di 24 h per il finale h. 124
      4. Usare il OD 600 punti dati come l'asse y e il tempo come l'asse x, grafico di una curva della media dei tre punti presi con barre di errore quadratico medio per ogni punto di tempo utilizzando un software di grafico. La curva di crescita di S. oneidensis MR-1 viene visualizzata in Figura 1 nella sezione risultati rappresentativi, B.
      5. Utilizzando il grafico preparato nel passaggio 1.3.3.4, identificare l'intervallo di tempo della sezione Registro-fase della curva di crescita. Per Shewanella, questo è tra 12 e 33 h di crescita; Pertanto si può dedurre che alla 24 h di crescita, Shewanella sarà all'interno del suo registro-fase di crescita, assumendo che i batteri saranno coltivati utilizzando la stessa media e trattamento prima dell'uso che è stato utilizzato per la curva di crescita.

2. Coltura di batteri

  1. primo giorno: inoculare la piastra di Agar
    Nota: questa sezione della procedura è stata utilizzata con un pla di agarosiote di prendere una sola unità formanti colonie (CFU) in fase di log, invece la cultura starter liquido utilizzata per la curva di crescita. Questo potrebbe essere presupposto per riprodurre le stesse condizioni di crescita, dovuto al fatto che TSA senza destrosio è stato utilizzato e successivamente trasferito a " nanofili " medium nella procedura della curva di crescita e TSA ha gli stessi ingredienti che la compongono TSB.
    1. Togliere Stock in S. oneidensis MR-1 GFPbacteria dal congelatore a-80 ° C e posto in un secchio di ghiaccio, mettere questo secchio dentro sterilizzato BSC.
    2. All'interno il BSC, utilizzare un ciclo di inoculazione sterile 1 µ l per raschiare la superficie dello stock congelati batteri e viene utilizzato il ciclo di T-striscia la superficie di una piastra di agarosio.
    3. Dopo la sigillatura ai lati della piastra con la pellicola di plastica paraffina, capovolgere la piastra e memorizzare in un'incubatrice di 30 ° C per 24 h, fino a quando appaiono diverse colonie.
  2. Day Two: inoculare il flacone di siero
    1. rimuovere la piastra dall'incubatrice e aperti all'interno di BSC.
    2. All'interno il BSC, pulire la superficie del tappo di gomma su una bottiglia di siero preparato dal punto 1.1.1 con etanolo al 70% in acqua deionizzata.
    3. Selezionare un singolo CFU dalla piastra di agar e, utilizzando una siringa sterile con un allegato 22 ago del manometro, depositare abbastanza mezzi di crescita per sloggiare la Colonia dalla piastra senza toccare alcun colonie vicine e mescolare la Colonia con il mezzo con la punta del l'ago.
      Nota: Un singolarmente Colonia dovrebbe essere selezionata che è abbastanza lontano da altri batteri sulla piastra, tale che medie possono essere depositate su di esso senza toccare le altre colonie.
    4. Utilizzando la stessa siringa, estrarre il liquido dalla superficie della placca.
    5. Dopo aver toccato fuori le bolle all'interno della siringa, iniettare il liquido nella bottiglia del siero e posto su un agitatore orbitale all'interno di 30 ° C a 150 rpm per 24 h.
      Nota: Toccando le bolle fuori la siringa è importante al fine di evitare di introdurre più ossigeno alla bottiglia del siero, come introducendo più ossigeno alla bottiglia può modificare le condizioni sperimentali e ridurre la coerenza tra i tempi di crescita per i batteri.
  3. Day Two: sterilizzazione del Microchannel SALVI
    Nota: per promuovere la sterilità del sistema di tubazione, passaggi che richiedono staccare la siringa dalla tubazione e la sostituzione con una nuova siringa dovrebbero essere fatto entro il BSC. Per effettuare questa operazione, semplicemente staccare la siringa dalla pompa siringa svitando il titolare metallo siringa e portare la siringa con tubo collegato a un BSC sterile. Quando il sistema della tubazione è menzionato nelle procedure, si riferisce alla siringa contenente il serbatoio, collegato con un iniettore di polyetheretherketon (PEEK) per il tubo di PTFE, collegato alla camera di gocciolamento, che ha un iniettore PEEK raccordo collegato il Ingresso SALVI tubazione, così come il contenitore di uscita che il tubo di uscita SALVI è sigillato per.
    1. Utilizza un nuovo dispositivo SALVI e allegare un raccordo PEEK e iniettore a un'estremità di un tubo di PTFE.
      Nota: I dispositivi SALVI sono preparati freschi per ogni esperimento segue la fabbricazione di dispositivi dettagliata in precedenti ricerche e brevetti. 5 , 6 , 8 , 15
    2. prendere 2 mL di etanolo al 70% in una siringa e collegare al raccordo di PEEK sulla SALVI. Dopo la siringa come collegare una pompa a siringa e collegare la presa della SALVI per una bottiglia di scarico, lasciare che la soluzione di etanolo DI acqua a correre attraverso la SALVI a 20 µ l/min per 1,5 h.
    3. Prendere 4 mL di sterilizzato DI acqua in una siringa e collegare all'ingresso della SALVI stesso. Dopo aver collegato la siringa una pompa a siringa, permettere all'acqua di correre attraverso la SALVI a 20 μL/min per almeno 3 h.
    4. All'interno di un BSC, aprire il pacchetto di lamina preparato al punto 1.2.5 e collegare un raccordo all'estremità della siringa da 5 mL e sterile PEEK raccordi all'estremità della tubazione TFE sterile per iniezione PEEK. Prendere ~ 3 mL di terreno sterile in una siringa e collegare al tubo TFE. Invertire la camera di gocciolamento 5 mL e, utilizzando una siringa sterile, iniettare il mezzo di crescita nella camera di gocciolamento, fino a raggiungere un volume totale di 1 mL.
    5. Collegare l'estremità della camera di gocciolamento siringa 5ml all'ingresso della SALVI.
    6. Prendere 10 mL di terreno di coltura in una siringa sterile e collegare all'ingresso del tubo di gocciolamento. Dopo aver collegato la siringa una pompa a siringa, lasci che il media attraversano la SALVI a 20 µ l/min per 12 h (o notte). Utilizzare nastro adesivo per proteggere queste parti. Coprire la bottiglia presa con fogli o lamine di plastica paraffina per ridurre al minimo la probabilità di particelle di polvere e organismi ivi contenuti per contaminare il mezzo. Una raffigurazione dettagliata di come dovrebbe apparire il programma di installazione può essere trovata in Figura 1 A.
      1. Consentire il tubo di gocciolamento di essere verticale, che significa che la pompa a siringa deve essere inserita su una superficie sopraelevata con tubi a goccia protetta con nastro adesivo e con la SALVI fissato su una superficie piana sottostante.
      2. Eseguire medio attraverso la SALVI per 12 h per garantire che siano state rimosse tutte le tracce di etanolo dalla tubazione della SALVI prima dell'inoculo con batteri e microchannel.
      3. Per una maggiore protezione, tenere la camera di microchannel SALVI all'interno di una capsula Petri sterilizzati, con i lati tagliati per adattarsi l'ingresso e il tubo di uscita. Inoltre, tieni il nastro sempre sulla finestra per proteggere la membrana di peccato e canale prima dell'analisi di imaging.
  4. Giorno tre: inoculazione del Microchannel SALVI
    1. rimuovere il sistema intero della tubazione (siringa collegata a gocciolare camera collegata a SALVI collegato alla bottiglia dei rifiuti) da pompa a siringa e portarlo a un BSC sterilizzato. Inoltre, rimuovere il flacone di siero dal punto 2.2.5 dall'incubatrice e portarlo al BSC.
    2. Pulire la superficie del tappo di bottiglia del siero con etanolo al 70% per evitare qualsiasi contaminazione e quindi utilizzare una siringa sterile con un ago 22G sterile per estrarre 4 mL di batteri dalla bottiglia.
    3. Scollegare la SALVI dal vano di 5ml della tubazione del gocciolamento e collegare la siringa con inoculato direttamente all'ingresso della SALVI. Lasciare il tubo di gocciolamento all'interno di un pacchetto di lamina di alluminio sterile o BSC.
    4. Collegare la siringa con la bottiglia di SALVI e presa per la pompa a siringa per eseguire a 20 µ l/min per 3 h inoculare il canale di SALVI, al fine di consentire più variazioni di volume del liquido contenuto all'interno di SALVI.
    5. Dopo l'inoculazione, scollegare la siringa con SALVI dalla pompa a siringa e portare al BSC. Dopo aver montato l'ingresso della SALVI torna alla camera di gocciolamento 5 mL dal punto 2.4.3, prendere 20 mL di terreno di coltura in una siringa sterile e collegare all'ingresso del tubo di gocciolamento.
    6. Portare il tubo collegato alla SALVI dal BSC per la pompa a siringa e lasci che il media di passare attraverso il tubo ad un tasso di 2 µ l/min per sei a dieci giorni, o fino a formazione immagine di fluorescenza (discussa nel passaggio 3) Mostra la crescita di biofilm visibile favorevole per Analisi ToF-SIMS. Riempire mezzo fresco come si esaurisce entro il BSC riempiendo una siringa sterile nuova con 10mL di terreno di coltura e collegando alla SALVI dopo che il mezzo di crescita precedente è esaurita.
      Nota: Dopo aver iniziato l'inoculazione a 2 µ l/min, la portata non dovrebbe mai essere aumentata o diminuito, come variare la velocità di flusso sarebbe creare sollecitazione di taglio all'interno del canale e staccare il biofilm. È fondamentale che questa portata non deve essere mai modificata; per preparare questo, ~ 24 h prima di SIMS, osservare il tubo molto attentamente per assicurarsi che non ci sono nessun bolle così che c'è bisogno di spingere il mezzo più ad un tasso più veloce in tutto il tubo.
      1. Evitare bolle in microchannel, come si può spingere il biofilm fuori del canale. È importante essere cauti di bolle all'interno del fondo del tubo di gocciolamento 5 mL dove si collega al tubo di SALVI. Medium fresco può essere iniettato nell'estremità dell'iniettore PEEK per garantire che nessun aria sarà costretti nella SALVI.

3. Optical Imaging del Biofilm all'interno il Microchannel SALVI

  1. Imaging microscopia di fluorescenza
    Nota: Shewanella utilizzato come organismo modello all'interno di questo protocollo è mutato per esprimere GFP; come tale, non richiede la macchiatura. Se i batteri richiedono la macchiatura, questo dovrebbe essere fatto sempre alla stessa portata (ad es., 2 µ l/min) per evitare il distacco del biofilm. Inoltre, quando le cellule vanno senza disponibilità di nutrienti, essi si staccherà. Pertanto, se qualsiasi colorazione aggiuntiva è necessaria, la macchia deve essere iniettata il mezzo di crescita, piuttosto che acqua prima fornitura per macchiare le cellule.
    1. Staccare la SALVI dal gocciolamento della tubazione all'interno del BSC e chiudere la SALVI avvitando i raccordi di PEEK per serrare l'Unione PEEK.
    2. Nastro il tubo della camera microchannel SALVI in modo sicuro su una lastra di vetro, di modo che la finestra sia completamente piatto e rivolta verso l'alto. Rimuovere il nastro protettivo dalla finestra. Morsetto della diapositiva sul palco del microscopio ponendo il vetrino tra i morsetti di fase sulla piattaforma.
    3. Abbassare la fase del microscopio tale che la parte superiore della SALVI è posizionata abbastanza vicino alla fine dell'obiettivo 10x, dove la regolazione della messa a fuoco non causerà l'obiettivo di toccare la finestra.
    4. Interruttore sulla retroilluminazione e trovare il canale utilizzando l'obiettivo del microscopio 10X regolando la messa a fuoco. In questo momento, assicurarsi che la presenza di attacco batterico alla finestra peccato della SALVI è evidente rispetto alla finestra di un canale di controllo con nessun batteri inoculato. Più vicino imaging delle cellule, per passare all'obiettivo 20x. Rispetto ad un canale vuoto SALVI, la presenza di batteri collegato alla finestra dovrebbe avere una forte fluorescenza verde.
    5. Disattivare la retroilluminazione e accendere la fonte di mercurio di microscopio. Attendere 2-3 min e passare al filtro FITC impostata sul microscopio vista e catturare le immagini del biofilm collegato alla finestra. Come un esempio di come apparirà il biofilm maturato come quando si è pronti, fare riferimento alla Figura 1 C.
    6. Turn off la fonte di mercurio e staccare la SALVI dal vetrino. Se necessario, collegare a 2 µ l/min flusso medio ancora una volta per consentire una crescita più prima dell'imaging di nuovo, o trasferire la SALVI a uso di contenimento secondario per analisi ToF-SIMS. Ciò è necessario se lo spessore del biofilm è concluso di non essere abbastanza spessa, e prima analisi ToF-SIMS è necessario più tempo per la crescita. Per allegare al flusso medio, ancora una volta, fare riferimento al punto 2.3.6.
      Nota: Se rimesso sotto flusso medio, l'imaging di fluorescenza dovrebbe essere fatto prima analisi ToF-SIMS.
      1. Dare il biofilm crescita medio per la sua alimentazione fino a quando possono essere condotte analisi ToF-SIMS. Mentre non consigliato, se necessario, la SALVI chiuso possono essere memorizzati all'interno di 4 ° C durante la notte, ma dovrebbe essere lasciata scaldare a temperatura ambiente prima di inserire la camera del vuoto del ToF-SIMS. Tuttavia, analizzare il biofilm immediatamente dopo staccati dal flusso medio per ridurre il distacco di biofilm.

4. Acquisizione dati ToF-SIMS

Nota: questa sezione serve come una panoramica ed è discusso più dettagliatamente all'interno del nostro precedente protocollo che descrive le analisi di proteine adsorbite molecola liquida SIMS. 12

  1. Installare SALVI nella camera di Loadlock ToF-SIMS
    Nota: guanti devono essere indossati tutti i tempi quando il manipolatore di SALVI e installarla sul ToF-SIMS tappa per evitare potenziali contaminazioni durante la superficie analisi.
    1. Monte SALVI sul palco e fissarla con le viti diverse. Assicurarsi che la finestra di peccato è flat di regolazione vite strettezza e inserimento di wafer di silicio pezzi nella parte inferiore della camera di microchannel PDMS. Rimuovere il nastro protettivo dalla finestra, quindi caricare la fase camerare ToF-SIMS loadlock.
    2. Aprire il loadlock ToF-SIMS, tenere e impostare la fase orizzontalmente sul pianale e chiudere la porta di loadlock. Avviare la pompa del vuoto e aspettare per assicurarsi raggiunto quel vuoto adatto.
    3. Spostare la SALVI nella camera principale, una volta che il vuoto si stabilizza a 1 x 10 -7 mbar.
  2. Profondità di analisi e raccolta dati punti
    1. trovare il canale di microfluidica con il microscopio ottico attrezzato nella ToF-SIMS.
    2. Selezionare modalità positiva o negativa prima di acquisizione dati. Uso il 25 keV Bi 3 + del fascio come il fascio di ioni primari in tutte le misure e utilizzare la pistola di elettrone inondazione per neutralizzare la carica durante tutte le misure di superficie.
      3. Larghezza di
    3. scansione il fascio di 3 + Bi con impulso di ns 150 su una zona rotonda con un diametro di ~ 2 µm con 64 pixel per 64 pixel di risoluzione. Dopo la perforazione attraverso la finestra di peccato 100 nm, continuare a eseguire la scansione per altri 150 s per raccogliere i dati ad alta intensità per l'imaging. Dopo la foratura passante, i conteggi aumenterà in modo significativo all'interno della regione di profilatura di profondità. Dopo l'assestamento, questo può essere indicato come la regione ad alta intensità.
    4. Ridurre la larghezza di impulso a 50 ns per la raccolta di dati di acquisire spettri con migliore risoluzione di massa. Continuare questa acquisizione per circa un altro 200 s.
    5. Ripetere questi passaggi per la raccolta positiva almeno tre e tre punti di dati negativi.
      Nota: Assicurarsi di spazio le zone di foratura passante, tale che non si romperà la finestra di peccato e perdita nella camera del vuoto da compromessa l'integrità finestra.

5. Analisi dei dati ToF-SIMS

  1. massa calibrazione utilizzando il IonToF Software
    1. aprire il software di analisi di ToF-SIMS (misurazione Explorer) e quindi fare clic sul " profili ", " spettri " e " immagine " pulsanti, rispettivamente al processo profondità profilo, spettro di m/z e dati di immagine.
    2. Apri i file di dati ottenuti nel corso di acquisizione dati ToF-SIMS.
    3. Selezionare la profondità di analisi dei dati di interesse e ricostruire gli spettri secondo la serie temporale di profondità profilo.
    4. Press " F3 " per aprire la " massa calibrazione " finestra. Scegliere picchi per calibrazione basato su composti chimici che dovrebbero esistere nell'esempio specifico.
  2. Picchi di interesse selezione
    1. come picco selezione è necessaria per le analisi, determinare picchi caratteristici del campione secondo letteratura o altri risultati precedenti, se presente. Confrontare l'intensità dei picchi di interesse negli spettri m/z. Se necessario, aggiungere nuove vette o Elimina i picchi di interferenza nell'elenco picco.
    2. Clicca su un picco, trovare le linee rosse nella finestra in basso a sinistra. Spostare le linee rosse per racchiudere il picco tutto.
    3. Selezionare un picco in corrispondenza la formula chimica nella finestra principale dello spettro e poi cliccare il " aggiungere picco " pulsante sopra la finestra. < /li >
  3. Esportare dati calibrato di massa
    1. per esportare un elenco di picco, nella " picco elenco " menu, selezionare " salvare … " l'elenco di picco nella " itmil " formato.
    2. Per esportare un profilo di profondità, nella " profilo " finestra, fare clic sul " File " dal menu, quindi selezionare " Export " e quindi selezionare " salvare come " un ". txt " file.
    3. Per esportare un file di spettro m/z, nella " Spectra " finestra, fare clic sul " File " dal menu, quindi selezionare " Export " e quindi selezionare " salvare come " un ". txt " file.
    4. Per esportare un file di immagine, nella " immagine " finestra, stampa schermo e salvare come file immagine.

6. ToF-SIMS dati stampa e presentazione

  1. utilizzare uno strumento grafico per importare i dati.
  2. Fare una trama usando il m/z come l'asse x e picco intensità come l'asse y per mostrare lo spettro ricostruito. Un esempio è dato in Figura 2 A.
  3. Combine ricostruite immagini bidimensionali (2D) di differenti m/z e forma una matrice per visualizzare la mappatura un ione positivo o negativo. Un esempio è dato in Figura 2 B.

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Risultati

Questi risultati rappresentativi servono a mostrare come il profilo chimico del biofilm allegato può essere identificato e interpretato, come ottenuta attraverso ToF-SIMS. Dopo aver tracciato spettri di massa da acquisizione dati ToF-SIMS, brevemente evidenziato nella sezione procedure, identificazione del picco dovrebbe essere condotta al fine di assegnare le identità di ogni valore rispettivo m/z. Questo può essere fatto attraverso la revisione di una vasta letteratura sulla spettrometr...

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Discussione

Dopo inoculando in ritardo-fase, è importante verificare il numero di giorni e la temperatura alla quale il biofilm dovrebbe crescere prima che sia sano e abbastanza spessa per imaging, come descritto al punto 3.1. Questa procedura riguarda in particolare la coltura di un S. oneidensis MR1 biofilm a temperatura ambiente; Tuttavia diverse temperature ambiente possono influenzare il tasso di crescita. Pertanto, è fondamentale utilizzare imaging ottico per capire se il biofilm è pronto prima di procedere all'analisi ToF-SIM...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Siamo grati al Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) terra e scienze biologiche (EBD) missione seme laboratorio diretto di ricerca e sviluppo (LDRD) fondo per il sostegno. Accesso strumentale è stata fornita attraverso una proposta di utente generale W. R. Wiley Ambientale Molecular Sciences Laboratory (EMSL). EMSL è una struttura di uso scientifico nazionale sponsorizzata dall'ufficio di biologico e ambientale ricerca (BER) a PNNL. Gli autori ringraziano il Dr. Yuanzhao Ding per prova leggere il manoscritto e fornire un feedback utile. PNNL è gestito da Battelle per il DOE sotto contratto DE-AC05-76RL01830.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
ToF-SIMSIONTOFTOF. SIMS 5Risoluzione:>10.000 m/Δ m per la risoluzione di massa; >4.000 m/Δ m acronimo di High Spatial Resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)Pacific Northwest National LaboratoryN/ASALVI è uno strumento analitico unico, autonomo e portatile che, per la prima volta, consente a strumenti scientifici basati sul vuoto come la spettrometria di massa di ioni secondari a tempo di volo (ToF-SIMS) di analizzare le superfici liquide nel loro stato naturale a livello molecolare.
-80° C CongelatoreNew Brunswick ScientificN/AU410 Congelatore a bassissima temperatura ad alta efficienza energetica
Premium 4 gradi; C FrigoriferoBioCold ScientificN/ACOLDBOX1
Agitatore orbitaleNew Brunswick ScientificN/AInnova 4900 Agitatore ambientale multilivello, impostato a 30 gradi Celsius per la coltura di flaconi di siero e fiasche, impostato a 150 giri/min.
Pompa a siringaCole-ParmerEW-74905-02Pompa a siringa Cole-Parmer, solo infusione, controllo touchscreen 74905-02, utilizzata per iniettare liquido nel sistema di tubi e SALVI a portata costante.
IncubatoreBarnstead InternationalLT1465X3incubatore Lab-Line, impostato a 30 gradi Celsius per la coltura a piastre.
AutoclaveGetinge533LSUtilizzato per sterilizzare raccordi in PEEK, sistemi di tubi, fiale di siero e terreno. Spettrofotometro sterilizzatore a vapore sottovuoto modello 533LS
Thermo Fisher Scientific4001-000Spettrofotometro GENESYS 20 per letture OD600 di cuvette per curve di crescita.
Cabina di sicurezza biologicaThermo Fisher Scientific1385Serie 1300 Microscopio a fluorescenza per cabina di sicurezza biologica AZ
NikonN/AMicroscopio a fluorescenza Nikon OPTIPHOT-2 con fotocamera e alimentatore con lampada al mercurio ad altissima pressione.
Misuratore di pHMettler Toledo51302803Utilizzato per testare il pH del " nanofili" Terreno dopo la fine e prima della sterilizzazione in autoclave.
RACCORDO PEEKValcoZU1TPKPer collegare l'ingresso e l'uscita di SALVI, la siringa al sistema di tubi e l'ingresso di SALVI alla camera di gocciolamento del sistema di tubi.
Stadio campione a 5 assiIONTOFN/AStage è autocostruito per il montaggio di SALVI in ToF-SIMS.
Sistema di purificazione dell'acqua nanopura BarnsteadThermo Fisher ScientificD11921ROpure LP Modulo di filtrazione ad osmosi inversa (D2716)
PipettaThermo Fisher Scientific21-377-821Intervallo: da 100 a 1.000 µL.
Puntale per pipetteNeptune2112.96.BS1.000 &; micro; L punte per pipette
Manico a lama di rasoioStanleyN/ARaschietto a lama di rasoio Stanley Bostitch con 5 lame a taglio singolo, utilizzato per il taglio di tubi in PTFE
SiringaBD309659Siringa da 1 mL
BD309657
SiringaBD3096465 mL; Utilizzato per realizzare la camera di gocciolamento
SiringaBD309604Siringa da 10 ml
BD302830da 20 ml
Thermo Fisher Scientific13-678-1125 ml Fisherbrand™ Pipette sierologiche monouso sterili in polistirene con striscia di ingrandimento, per il riempimento di flaconi di siero.
Riempitrice elettrica per pipettePipet-aidP-57260Riempitrice per pipette sierologiche elettriche a pressione sottovuoto
Flacone per sieroSigma33109-UContiene circa 69 ml di liquido per la crescita della coltura, ottimale per l'uso di 20 ml di coltura per bottiglia.
Provetta per coltura anaerobicaVWR89167-178Provette anaerobiche, 18 x 150 mm, fornite con tappo in gomma butilica blu da 20 mm e guarnizione in alluminio.
Tappo in gommaSigma27235-UTappo in silicone, utilizzato per sigillare i flaconi di siero e per creare il sistema di tubi/camera di gocciolamento.
Guarnizione a crimpare in alluminio (senza setto)Sigma27227-UGuarnizione in alluminio per la parte superiore del flacone di siero da utilizzare con la crimpatrice per flaconi di siero.
Crimpatrice per guarnizioni in alluminio per flacone di sieroWheaton224307crimpatrice da 30 mm con guarnizione standard.
Tubi in PTFESupelco58697-U1,58 mm OD x 0,5 mm ID 50 piedi Tubo in teflon PTFE, utilizzato per creare il sistema di tubi.
Cuvette monousoGMBH759085D1,5 ml per l'uso con spettrofotometro.
AgoBD22G; utilizzato per l'iniezione di flaconi di siero.
AgoBD30512023G; utilizzato per la punzonatura attraverso il tappo in gomma per creare un sistema di tubi a goccia.
Shewanella oneidensis MR-1 con GFPN/AN/AMatthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Costruzione di vettori GFP per l'uso in batteri Gram-negativi diversi da Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. 
EtanoloThermo Fisher Scientific  S25310A95% denaturato
TSABD212305agar di soia triptica per la coltura dell'organismo modello (S. oneidensis) utilizzato in questo protocollo
TUBI BufferSigmaP-1851utilizzato per " nanofili" medio {Hill, E.A. 2007}
Idrossido di sodioSigmaS-5881Usato per " nanofili" medium {Hill, E.A. 2007}
Cloruro di ammonioSigmaA-5666Usato per " nanofili" medium {Hill, E.A. 2007}
Cloruro di potassioSigmaP-4504Usato per " nanofili" medio {Hill, E.A. 2007}
Fosfato di sodio monobasicoSigmaS-9638Usato per " nanofili" medium {Hill, E.A. 2007}
Cloruro di sodioThermo Fisher ScientificS271-3Usato per " nanofili" e utilizzato per fare la soluzione minerale utilizzata per " nanofili" medium {Hill, E.A. 2007}
Lattato di sodioSigmaL-137560%(p/p) sciroppo @ 98% puro, d=1,3 g/mL, 7M, utilizzato per " nanofili" medium {Hill, E.A. 2007}
Bicarbonato di sodioSigmaS-5761Utilizzato per produrre una soluzione NTA ferrica, utilizzato per " nanofili" medium {Hill, E.A. 2007}
Acido nitrilotriacetico Sale trisodicoSigmaN-0253Utilizzato per fare la soluzione NTA ferrica, utilizzato per " nanofili" medium {Hill, E.A. 2007}
Cloruro di ferro (III)Sigma451649Utilizzato per produrre una soluzione di NTA ferrica, utilizzato per " nanofili" medium {Hill, E.A. 2007}
Solfato di magnesioSigma208094Utilizzato per fare la soluzione dei minerali, usato per " nanofili" medio {Hill, E.A. 2007}
Solfato di manganese (II) monoidratoSigmaM-7634Utilizzato per fare la soluzione di minerali, utilizzato per " nanofili" medio {Hill, E.A. 2007}
Solfato di ferro (II) eptaidratoSigma215422Utilizzato per fare la soluzione di minerali, utilizzato per " nanofili" medium {Hill, E.A. 2007}
Cloruro di calcio diidratoSigma223506Utilizzato per fare la soluzione dei minerali, usato per " nanofili" medium {Hill, E.A. 2007}
Cloruro di cobalto (II)Sigma60818Utilizzato per fare la soluzione dei minerali, usato per " nanofili" medium {Hill, E.A. 2007}
Cloruro di zincoSigma229997Utilizzato per fare la soluzione dei minerali, usato per " nanofili" medio {Hill, E.A. 2007}
Solfato di rame (II) pentaidratoSigmaC-8027Utilizzato per fare la soluzione dei minerali, usato per " nanofili" medio {Hill, E.A. 2007}
Alluminio Potassio Solfato DodecaidratoSigma237086Utilizzato per fare la soluzione dei minerali, usato per " nanofili" medio {Hill, E.A. 2007}
Acido boricoSigmaB-6768Utilizzato per fare la soluzione di minerali, utilizzato per " nanofili" medium {Hill, E.A. 2007}
Molibdato di sodio diidratoSigma331058Utilizzato per fare la soluzione di minerali, utilizzato per " nanofili" medium {Hill, E.A. 2007}
Cloruro di nichel (II)Sigma339350Utilizzato per fare la soluzione di minerali, utilizzato per " nanofili" medium {Hill, E.A. 2007}
Sodio Tungstato DiidratoSigma14304Utilizzato per fare la soluzione di minerali, usato per " nanofili" medium {Hill, E.A. 2007}
D-BiotinSigma47868Utilizzato per fare soluzioni vitaminiche, usato per " nanofili" medium {Hill, E.A. 2007}
Acido folicoSigmaF-7876Usato per fare la soluzione vitaminica, usato per " nanofili" medium {Hill, E.A. 2007}
Piridossina cloridratoSigmaP-9755Utilizzato per fare la soluzione vitaminica, usato per " nanofili" medio {Hill, E.A. 2007}
Riboflavina (B2)Sigma47861Usato per fare la soluzione vitaminica, usato per " nanofili" medium {Hill, E.A. 2007}
Tiamina cloridratoSigmaT-4625Utilizzato per fare la soluzione vitaminica, usato per " nanofili" medium {Hill, E.A. 2007}
Acido nicotinicoSigmaN4126Utilizzato per produrre soluzioni vitaminiche, utilizzato per " nanofili" medio {Hill, E.A. 2007}
D-Acido pantotenico Sale emicalcicoSigma21210Utilizzato per fare la soluzione vitaminica, usato per " nanofili" medio {Hill, E.A. 2007}
Vitamina B12SigmaV-2876Usato per fare la soluzione vitaminica, usato per " nanofili" medio {Hill, E.A. 2007}
4-Acido amminobenzoicoSigmaA-9878Usato per fare la soluzione vitaminica, usato per " nanofili" medio {Hill, E.A. 2007}
Acido tiotticoSigmaT-1395Utilizzato per produrre soluzioni vitaminiche, utilizzato per " nanofili" medio {Hill, E.A. 2007}
da 3 mL Pipetta monouso 303015

Riferimenti

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