Analisi automatizzata di un esame preferenziale di Chemosensory basato sulla popolazione di Nematode

Sommario

Presentiamo una configurazione e un protocollo di registrazione del comportamento che consente l'analisi automatizzata del nematodo, la preferenza di Caenorhabditis elegans per composti solubili in un dosaggio basato sulla popolazione. Questo articolo descrive la costruzione di una camera di comportamento, il protocollo di analisi comportamentale e l'utilizzo del software di analisi video.

Abstract

Il nematode, il sistema nervoso compatto di Caenorhabditis elegans di soli 302 neuroni, si basa su un diverso repertorio di comportamenti. Per facilitare la dissezione dei circuiti neurali sottostanti a questi comportamenti è necessario lo sviluppo di test comportamentali robusti e riproducibili. Precedenti studi di comportamento di C. elegans hanno utilizzato varianti di "test di caduta", un "dosaggio di chemotaxis" e un "test di ritenzione" per indagare la risposta di C. elegans a composti solubili. Il metodo descritto in questo articolo cerca di combinare i punti di forza complementari dei tre suddetti dosaggi. In breve, un piccolo cerchio al centro di ogni piastra di dosaggio è diviso in quattro quadranti con le soluzioni di controllo e sperimentali alternativamente posizionate. Dopo l'aggiunta dei vermi, le piastre di dosaggio vengono caricate in una camera di comportamento in cui le telecamere a microscopio registrano gli incontri dei vermi con le regioni trattate. L'analisi video automatica viene quindi eseguita aNd viene generato un valore di indice di preferenza (PI) per ogni video. L'acquisizione video e le funzioni di analisi automatizzate di questo metodo riducono al minimo il coinvolgimento dello sperimentatore e gli eventuali errori associati. Inoltre, vengono impiegate piccole quantità del composto sperimentale per dosaggio e la configurazione multi-telecamera della camera di comportamento aumenta il throughput sperimentale. Questo metodo è particolarmente utile per condurre schermi comportamentali di mutanti genetici e nuovi composti chimici. Tuttavia, questo metodo non è appropriato per studiare la navigazione a gradiente dello stimolo a causa della stretta vicinanza delle regioni di controllo e di sperimentazione. Non dovrebbe inoltre essere utilizzato quando è disponibile solo una piccola popolazione di vermi. Mentre è idoneo per analizzare le risposte solo a composti solubili nella sua forma attuale, questo metodo può essere facilmente modificato per soddisfare l'interazione sensoriale multimodale e gli studi ottogenetici. Questo metodo può anche essere adattato per analizzare le risposte chemosensoriali di altre specie di nematodi.

Introduzione

Gli animali foraggiati devono integrare gli ingressi da molteplici modalità sensoriali e selezionare le appropriate strategie comportamentali per navigare con successo nell'ambiente. La comprensione di come gli input sensoriali esterni vengono ricevuti e trasfusi in informazioni neurali per guidare la selezione delle azioni è un obiettivo centrale nel campo della neurobiologia. Il nematode genetico tractable, C. elegans , è un attraente modello organizzativo in cui studiare i meccanismi neurali alla base della biologia sensoriale e dell'integrazione multimodale. Anche se C. elegans ha solo 302 neuroni, può rilevare e discriminare tra una grande varietà di stimoli ambientali, compresi composti solubili, odori volatili e temperatura ambiente ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7} . IlNematode C. elegans si basa fortemente sull'apparecchio chemiosensorio per localizzare le fonti alimentari e per avvisare le potenziali minacce. Pertanto, i test comportamentali progettati per esaminare le risposte di C. elegans di tipo selvatico e mutato a stimoli chimici svolgono un ruolo cruciale nella dissezione dei meccanismi genetici, cellulari e neurali sottostanti le notevoli capacità sensoriali di C. elegans .

Per analizzare la risposta a composti solubili sono stati descritti tre tipi di saggi: il test a goccia, il dosaggio della chemotaxis e il saggio di ritenzione. Nel test a goccia viene posizionata una piccola goccia del composto alla coda di un verme in movimento e la decisione del verme di invertire o spostarsi in avanti una volta che il liquido raggiunge l'apparato sensoriale anteriore viene valutato ⁴ . Il test di goccia richiede una piccola preparazione sperimentale ed è utile quando la dimensione del campione dei worm è minore, come nel caso dei worm a laser. Tuttavia, come solo un wormPuò essere analizzato alla volta e lo sperimentatore deve essere presente per tutta la durata del test, il test di caduta può richiedere molto tempo. Il test di goccia è anche vulnerabile a variazioni nella distribuzione di goccia tra ogni worm all'interno di un campione, che può influenzare i risultati complessivi del dosaggio. Un'altra limitazione del test di caduta è che può essere utilizzato solo per analizzare la risposta del verme ai composti avversi in quanto non è possibile discriminare tra un effetto attraente o neutro del composto dal movimento del verme in avanti.

Il dosaggio di chemotaxis per composti solubili comporta generalmente la suddivisione di una piastra agar in quattro quadranti, con la soluzione sperimentale mescolata all'agar di due quadranti opposti e la soluzione di controllo mescolata agli altri due quadranti ^{8 , 9} . All'inizio del test, una goccia di tampone contenente worm è posta al centro della piastra e il numero di worm in Ogni quadrante viene segnato in diversi punti temporali. Il dosaggio della chemotaxis fornisce una maggiore potenza statistica rispetto al test di caduta, in quanto vengono testati in un determinato dosaggio un gran numero di vermi. Tuttavia, una limitazione di questo metodo è che la preparazione delle piastre di dosaggio della chimotaxis richiede grandi quantità di composto sperimentale. Ciò renderà difficile eseguire schermi di comportamento su larga scala se è necessario un processo di purificazione complicato con rese limitate per ottenere il composto di interesse, come nel caso delle molecole di segnalazione ascaroside ¹⁰ . Inoltre, il conteggio manuale dei worm durante il test è suscettibile di errori e la perturbazione delle piastre durante il processo di conteggio potrebbe influenzare i risultati.

A differenza dei due metodi di cui sopra, il saggio di ritenzione utilizza la visione della macchina, che minimizza l'errore durante il processo di punteggio e riduce l'interferenza del sperimentatore durante il saggio > 11. L'analisi computerizzata delle registrazioni video del comportamento dei worm può anche rivelare dinamica comportamentale sottile che si mancherà quando il punteggio viene eseguito solo in alcuni punti di tempo discreti. Nel saggio di ritenzione, due punti di soluzione vengono aggiunti sui lati opposti di una piccola zona circolare di cibo batterica seguito dal posizionamento di un piccolo numero di vermi nel mezzo della patch alimentare. Il comportamento dei worms viene poi registrato, analizzato e un valore di indice di preferenza viene calcolato in base al numero totale di pixel worm in ciascuna regione di soluzione. Sebbene la presenza di una zona attraente di cibo consente di utilizzare più piccole popolazioni di vermi in ogni dosaggio, il cibo è stato precedentemente dimostrato di sensibilizzare i comportamenti di evasione a repellenti solubili ¹² . Inoltre, i vermi presentano una risposta fotofobica alla luce a breve corto d'onda e l'uso di sorgenti luminose a microscopio che emettono luce bianca nella configurazione del comportamento di registrazione potrebbero influenzare il comportamentoS = "xref"> 13.

Lo scopo del metodo discusso in questo articolo è quello di registrare e analizzare la preferenza di C. elegans per composti solubili usando un saggio basato sulla popolazione. A tal fine, il metodo attuale integra e migliora gli aspetti di tutti e tre i metodi precedentemente discussi. Consente di testare grandi popolazioni di vermi e richiede solo piccole quantità di soluzione sperimentale da utilizzare in ogni dosaggio. Inoltre, il dosaggio viene condotto all'interno di una camera di comportamento recintata personalizzata con retroilluminazione a LED a infrarossi per ridurre al minimo gli effetti della luce a corto raggio d'onda sul comportamento. Ciascuna camera può anche essere dotata di fotocamere a microscopi, che aumenta il throughput sperimentale senza compromettere lo spazio del banco. Infine, il software di analisi video emette il valore dell'indice di preferenza per ciascun video e una trama di occupazione del worm di accompagnamento per visualizzare la dinamica del comportamento della popolazione nel tempo. La configurazione della camera e unaIl protocollo ssay può essere ulteriormente modificato per studiare le risposte a comportamento multimodale come l'effetto degli odoranti o della temperatura sui comportamenti chemiosensoriali.

Questo articolo descrive la costruzione della camera di comportamento e il protocollo di analisi. Esso dimostra anche l'utilità di questo metodo nel valutare la risposta di worm di tipo selvatico e mutanti difettosi chemosensori al reintensivo solubile conosciuto, ioni di rame ⁴ . Infine, il processo di analisi video che utilizza il software fornito è dettagliato.

Protocollo

1. Assieme della Camera Comportamento

NOTA: La camera di comportamento è costituita da un telaio a forma di cubo realizzato in barre in alluminio estruso, rivestito con coperture opache, con fondo trasparente acrilico e supporti della telecamera. Le giunzioni tra le barre in alluminio estruse che formano la camera di comportamento sono tutte perpendicolari e sono fissate mediante staffe ad angolo "L" (larghe da 1 pollici con piedini da 1 pollici) che fissano una gamba di ogni angolo a ciascuna barra con viti e slitta T-dadi. Ogni giunto è fissato con una o due staffe d'angolo come descritto di seguito. I rivestimenti di tessuto sopra la camera sono fissati alle barre di alluminio con le stesse viti e le dadi a scorrimento, ma attraverso i gommini negli angoli del tessuto. Le viti sono correttamente inserite nel lato contrapposto dei dadi a scorrimento, non in corrispondenza del lato con il labbro sporgente. Quando si collega un gruppo di fissaggio a vite / dado a dado ad una barra in alluminio, far scorrere il dado T nel canaleSulla superficie appropriata della barra con la testa della vite che si estende dalla scanalatura.

1. Preparare le coperture del tessuto.
   1. Usare forbici per tagliare cinque pezzi del tessuto opaco in poliestere per coprire i primi e quattro lati della camera.
      1. Taglia un quadrato di 14 x 14 pollici di ² fogli di tessuto per la parte superiore della camera. Tagliare quattro rettangolare 11 x 14 pollici ² fogli di tessuto per i lati della camera.
   2. Installare i gommini agli angoli delle lenzuola.
      1. Segnare una linea di riferimento da 0,5 pollici da ogni bordo di tutti i cinque fogli di tessuto in poliestere utilizzando una matita e un retino.
      2. Per i quattro fogli rettangolari, utilizzare le pinze per guarnizioni per inserire i gommini centrati dove le linee della matita si intersecano ad ogni angolo (cioè 4 gommini per foglio).
      3. Per il foglio quadrato, inserire due guarnizioni lungo ciascun bordo con ciascun gommino centrato sulla linea della matita e posizionato 1,5 pollici dalla fine di ciascuno diLe quattro linee a matita (ovvero 8 gommini totali, due vicini ad ogni angolo).
   3. Inserire una vite in ciascun foro della guarnizione e fissare un dado a T connettore a ciascuno.
2. Fabbricare barre di montaggio della telecamera.
   1. Utilizzare una sega a nastro o equivalente per tagliare una barra di estrusione di alluminio da 2 pollici lungo per ogni telecamera, assicurando che l'estremità tagliata della barra sia perpendicolare alla lunghezza della barra per facilitare il montaggio successivo.
   2. Utilizzare una pressa con un foro da 0,25 pollici per forare un foro attraverso i telai centrali di ciascuna barra di montaggio della telecamera da 0,75 pollici da un'estremità tale che il foro è perpendicolare alle facce superiori e inferiori e passa attraverso la linea centrale della barra . Facoltativamente, forare il foro utilizzando un trapano elettrico palmare con un foro da 0,25 pollici, ma assicurarsi che il foro sia perpendicolare alle facce superiori e inferiori della barra.
3. Preparare tutte le staffe d'angolo.
   1. Inserire una vite nel foroOgni gamba di staffe d'angolo, inserendo la vite dal lato d'angolo interno. Filettare leggermente un dado a T su ogni vite.
4. Preparare il gruppo di montaggio della fotocamera ( figura 1B , livello 2).
   NOTA: il gruppo di montaggio della telecamera è un gruppo a "H" che supporta i tre telecamere.
   1. Fissare le barre di montaggio della fotocamera alla barra centrale del gruppo di montaggio della fotocamera.
      1. Disporre le tre barre di montaggio della telaio fabbricate al punto 1.2 con i fori forati orientati verticalmente. Inserire due staffe d'angolo sui lati di ciascuna barra di montaggio alla fine più lontana dal foro forato.
      2. Posizionare le staffe d'angolo con le gambe delle staffe in filo con l'estremità della barra e stringere le viti per fissarla. Questo forma una forma "T" con il foro forato nella parte inferiore del "T".
      3. Posare un'estrusione di alluminio da 1 piede sulla superficie di lavoro. Far scivolare i dadi a nastro di una barra di montaggio della telecameraMbly (dal passaggio precedente) su un lato del bar di 1 piedi. Centrare la barra di montaggio lungo la lunghezza della barra di 1 piedi e stringere le viti per fissarla. Far scivolare le altre due barre di montaggio sul lato opposto della barra di 1 piede.
      4. Posizionare le due barre equidistanti dalla metà della barra di 1 piedi, con le parentesi angolo interno distanti circa 2,5 pollici. Inserire le staffe d'angolo sui lati della barra di 1 piedi, due a ciascuna estremità della barra. Posizionare le staffe d'angolo con le gambe delle staffe a filo con le estremità della barra e serrare le viti per fissarla.
   2. Fissare le barre di estremità alla barra centrale.
      1. Slip due estrusioni in alluminio da 1 piedi sui dadi a T ad ogni estremità dell'assieme dalla fase precedente formando una forma "H". Centrare ciascuna estremità sulla barra centrale e fissare serrando le quattro viti.
      2. Slip quattro staffe d'angolo nella parte superiore delle due estremità aggiunte nella fase precedente, una alla fineDi ogni barra. Posizionare le staffe d'angolo con le gambe delle staffe in filo con le estremità delle barre e serrare le viti per fissarla.
   3. Collegare i supporti e le custodie della fotocamera all'assemblea della fotocamera.
      1. Per ciascuno dei tre supporti della videocamera a microscopio, rimuovere la custodia della fotocamera sganciando la vite a vite e scorrete l'asta di supporto.
      2. Per ogni barra di montaggio della telecamera (ora fissata alla barra centrale del "H"), posizionare una rondella su una vite a testa rotonda, scivolare la vite attraverso il foro forato nella barra di montaggio della telecamera e posizionare un'altra lavatrice sulla vite . Fissare il foro filettato dello stelo della telecamera sulla vite, serrando saldamente contro la barra di montaggio della fotocamera.
      3. Ripetere i passaggi 14.3.2 per le altre due barre di montaggio della fotocamera.
      4. Inserire una custodia per telecamere su ciascuna barra di supporto della telecamera con l'apertura più larga orientata verso la barra di montaggio della telecamera e la vite. Assicurare temporaneamente la custodia per il supporto della telecameraOd con la vite prigioniera della custodia.
         NOTA: la posizione operativa finale sarà impostata nella sezione 2.
5. Montare il telaio della camera di comportamento ( figura 1A ).
   NOTA: Per facilitare la costruzione, montare il telaio a testa in giù, iniziando con il "top" del telaio della camera sulla superficie di lavoro ( figura 1B , livello 1) e lavorando verso l'alto verso i "piedi" del telaio ( figura 1B , strato 3).
   1. Per assemblare lo strato superiore della camera di comportamento, fissare quattro barre in alluminio estruso da 1 piede sul foglio di poliestere quadrato ( figura 1B , strato 1).
      1. Far scorrere una barra sui due dadi a dado lungo ciascun bordo del foglio di tessuto, centrando la barra lungo la larghezza del tessuto. Serrare i fermagli per fissare il foglio di tessuto a ciascuna barra.
      2. Spargere il foglio di poliestere quadrato sulla superficie di lavoro wiLe quattro barre di alluminio collegate in cima. Inserire otto staffe d'angolo sulle superfici superiori delle quattro barre di alluminio, una alla fine di ogni barra. Posizionare le staffe d'angolo sulle barre con le gambe verticali delle staffe a filo con le estremità delle barre. Fissare serrando le viti nei dadi a T.
   2. A sua volta, a ogni angolo, poggiate un'estrusione di alluminio di almeno 1 piedi in posizione verticale, scivolando l'estrusione sui dadi a dadi sulle due gambe di staffe angolari.
   3. Fissare la barra verticale alle barre orizzontali serrando i fermi, quindi unendo le due barre orizzontali adiacenti.
      NOTA: quando completate, le otto estrusioni (quattro orizzontali e quattro verticali) formano un anello quadrato sulla tavola con quattro pali che si appiccicano verso l'alto ( figura 1B , livello 1).
   4. Far scivolare i dadi allentati dell'assemblaggio della telecamera "H" dalla sezione 1.4 fino ai montanti del telaio del passaggio precedente. Lasciate che il "H &34; Scivolate fino a riposare in cima alle staffe d'angolo in ogni angolo del telaio. Assicurare il montaggio della telecamera in posizione serrando le quattro viti di supporto angolari.
   5. Montare lo strato inferiore della camera utilizzando le ultime quattro barre in alluminio estruso da 1 piede ( figura 1B , strato 3).
      1. Far scivolare una staffa d'angolo su ciascuna estremità di ciascuna barra da 1 piedi, posizionare le staffe d'angolo con le gambe delle staffe in filo con le estremità della barra e stringere le viti per fissarle in posizione.
      2. Spingere le barre tra i montanti del telaio con i T-nodi allentati nei canali dei montanti. Posizionare le barre in modo che i bordi superiori delle loro staffe d'angolo siano 1 pollice sotto l'estremità aperta dei montanti e fissare in posizione stringendo le viti dell'angolo.
6. Far scorrere i dadi delle quattro fogli di poliestere rettangolari nei canali sulle barre di estrusione verticali per coprire i lati del caminoR e stringere i fissaggi per fissare in posizione.
7. Selezionare un lato per essere una porta per accedere all'interno della camera e rimuovere le due viti e le dadi a dado nello strato inferiore della camera.
   NOTA: quando il telaio è rivolto in posizione verticale, il fondo di questo coperchio si blocca in basso e può essere sollevato per accedere all'interiore della camera.
8. Posizionare un tappo in plastica sull'estremità superiore di ciascun elemento d'angolo per servire come piedi per il telaio completato. Ruotare il telaio a destra. Inserire due supporti del pannello per lato all'interno dello strato di base del telaio e ruotare per fissarli in posizione ( figura 1B , livello 3). Posizionare un 12 x 12 pollici ² pezzo di acrilico trasparente sulla sommità dei supporti parti per realizzare uno stadio di piastre di saggio (Figura 1B, strato 3).

2. Posizionamento del modello e della fotocamera

1. Scaricare e installare il software di acquisizione video della videocamera a microscopio sul computerDal sito web del produttore.
2. Slip una fotocamera a microscopi in ognuno dei tre telecamere con l'ottica della fotocamera punta verso lo stadio acrilico e la retroilluminazione. Collegare le telecamere alle porte USB del computer. Posizionare il pannello di retroilluminazione LED a infrarossi sotto il telaio, centrando sotto lo stadio. Accendere il pannello di retroilluminazione per accendere.
3. Stampare i modelli di soluzioni di posizionamento e di allineamento delle lastre su fogli di trasparenza (vedere Supplemental File ).
   NOTA: Sul modello di posizionamento della soluzione, il cerchio del perimetro della piastra è di 3,8 cm di diametro e la regione interna di cerchio di interesse è di 0,9 cm di diametro.
4. Tagliare lungo le griglie per ottenere pezzi di trasparenza rettangolare che racchiudono i modelli circolari.
5. Avviare il software di acquisizione video e fare clic sulle miniature numerate nella parte superiore della finestra per visualizzare i feed di macchine fotografiche.
6. Regolare l'allineamento e l'ingrandimento della telecamera del microscopio.
7. Posizionare un modello di allineamento delle lastre sotto un obiettivo della fotocamera a microscopio ( Figura 2B ).
8. Cambiare la distanza di lavoro spostando verticalmente la custodia della fotocamera lungo l'asta della telecamera e regolare l'ingrandimento della fotocamera ruotando la manopola di ingrandimento della fotocamera finché i marcatori numerici del modello non sono chiaramente visibili ai bordi del campo visivo della fotocamera.
9. Nastro il modello di allineamento della lastra al livello acrilico.
10. Posizionare una lastra di campioni di worm sul modello di allineamento delle lastre sotto la fotocamera a microscopio e perfezionare ulteriormente l'ingrandimento e la distanza di lavoro fino a ottenere un'immagine nitida dei worm mantenendo comunque i marcatori di numero nel campo visivo.
11. Ripetere i passaggi 2.6.1-2.6.4 per le altre due telecamere a microscopio.

3. Crescita e sincronizzazione di Nematode

1. Quattro giorni prima degli esperimenti, il seme di ventiquattresimi di 60 mmPiastre agar di NAT (Nematode Growth Media) con 50 μL di OP50 Escherichia coli nel brodo Luria-Bertani (LB) (vedere la sezione 5 per la ricetta).
   NOTA: ogni piastra da 60 mm fornisce abbastanza worm per una piastrina di dosaggio. Si raccomanda l'acquisizione di sei repliche per trattamento o genotipo.
2. Lasciare le piastre seminate per asciugare in posizione verticale con coperchi, per notte, a temperatura ambiente.
3. Il giorno dopo, trasferire quindici ermafroditi gravidati ben alimentati su ciascuna piastra seminata e consentire ai vermi di gettare le uova per sei ore. Questo produrrà> 360 uova per piastra.
4. Dopo 6 h, rimuovere i vermi dalle piastre semilavorate e lasciare che i progenie crescano per tre giorni negli adulti a 20 ° C.

4. Valutazione della preferenza chemosensoriale

1. Il giorno prima dell'esperimento preparare 35 mm di NGM agar test plates.
   1. Preparare 250 ml di agar NGM (vedere la sezione 5 per la ricetta).
   2. Organizzare ventotto piatti vuoti da 35 mm in pile di cinque o meno su una piatta surfaccia. Riempire ogni piastra di dosaggio con 5 ml di agar NGM. Lasciare le piastre di dosaggio per asciugare in posizione verticale con coperchi, per notte, a temperatura ambiente.
      NOTA: come regola generale, preparare una piastra di dosaggio aggiuntiva per ogni trattamento o genotipo da analizzare in caso di contingenze.
2. Nel giorno dell'esperimento, attivare la retroilluminazione, avviare il computer e avviare il software di cattura video della fotocamera a microscopio.
3. Collegare una fotocamera a microscopio al computer e regolare le impostazioni di registrazione video.
   1. Fai clic sulla miniatura della telecamera numerata nella parte superiore della finestra del software per visualizzare il feed live della fotocamera.
   2. Tirare in giù il menu 'Video Format' nell'angolo superiore sinistro della fotocamera e selezionare 'MJPG 1280 x 1024'. Tieni giù il menu 'Cartella' accanto al menu 'Video Format' e seleziona una cartella in cui salvare i file video.
   3. Fai clic sull'icona 'Esposizione automatica' nell'angolo in alto a destra diL'alimentazione della fotocamera e disattivare l'esposizione automatica. Fai clic sull'icona 'LED' immediatamente a destra dell'icona 'Esposizione automatica' per spegnere i LED della fotocamera in microscopio incorporato. Fai clic sull'icona adiacente "Impostazioni": seleziona 'Monocromatico', ottimizza 'Contrasto' e regola 'Luminosità' finché i worm non appaiono distinti dal fondo.
4. Acquisisci i video di calibrazione.
   1. Allineare un modello di posizionamento della soluzione sulla parte superiore di un modello di allineamento delle lastre di fase ( Figura 2A ). Fai clic sull'icona di registrazione "Time-Lapsed Video" sul lato sinistro dell'alimentazione della fotocamera e digita '5' per la durata e '1' per intervallo per registrare un video a 5 s a 1 frame / s. Fai clic su 'Start' per iniziare la registrazione video.
5. Ripetere i passaggi in 4.3 e 4.4 per le altre due telecamere a microscopio.
6. Rimuovere il modello di posizionamento della soluzione dalla camera.
8. Utilizzare una pipetta di vetro da 5 ml per aggiungere 1,2 mL di tampone NGM a una piastra di vermi sincronizzati e agitare leggermente la piastra per spostare i vermi nel tampone. Pipettare il tampone dalla piastra e dispensare i vermi in tampone in un tubo di microcentrifuga pulito.
   NOTA: I vermi sono sensibili alle deviazioni dalla loro concentrazione di sale agar ¹⁴ . Per ridurre al minimo le variazioni della concentrazione di sale agar dopo il collocamento dei vermi, è consigliabile utilizzare il buffer NGM per il processo di lavaggio (vedere la sezione 5 per la ricetta). Non utilizzare pipette di plastica per rimuovere i vermi dalle piastre, poiché i vermi rimarranno ai lati. Preparare un numero equivalente di tubi come il numero di piastre di dosaggio da eseguire contemporaneamente.
9. Lasciate che i tre tubi stessero per 1-2 minuti per permettere ai worm di saldarsi verso il basso. Utilizzare una punta di pipetta di plastica per rimuovere il più possibile il tampone di lavaggio dai tubi senza pregiudicare il pellet dell'aggregatoI worm in fondo ai tubi. Riempire i tubi con 1 ml di tampone pulito NGM ciascuno.
10. Ripetere la fase 4.7.2 una volta.

Aggiungere 10 mM CuCl ₂ e M13 soluzioni tampone per saggiare piastre (vedi sezione 5 per le ricette).

1. Nastro un modello di soluzione-collocazione in cima alla fase del microscopio di dissezione.
2. Posizionare una striscia di nastro biadesivo su entrambi i lati di un modello di allineamento delle lastre. Assicurarsi che il nastro si sovrapponga con il cerchio del perimetro della piastra, ma non occluda la regione di registrazione di interesse al centro del modello.
3. Allineare il perimetro della lastra di dosaggio con il cerchio sul modello di allineamento delle piastre e premere fino a che il modello non si aderisce al fondo della piastra. Allineare i marcatori del numero di modello della lastra di dosaggio con i marcatori del modello di posizionamento della soluzione sul microscopio di dissezione.
4. Utilizzare una pipetta P2 e una punta di plastica per inserire 1 μl del buffer M13 nei quadranti 1 e 4 ( 2 ciascuna nei quadranti 2 e 3 ( Figura 2A ).
5. Ripetere i passaggi 4.8.2-4.8.4 per le altre due lastre di dosaggio.

Una volta che le gocce di soluzione sono state completamente assorbite nell'agar, utilizzare una pipetta di vetro Pasteur per trasferire i vermi lavati da ciascun tubo di microcentrifuga alla corrispondente piastra di dosaggio.

Mettere una goccia di worm ciascuno nella zona sopra e sotto la regione trattata circolare. Piegare un tessuto quattro volte e utilizzare il bordo smussato per assorbire il tampone di lavaggio in eccesso su tutte le piastre di dosaggio.

Immediatamente organizzare le tre lastre di analisi sotto le telecamere microscopiche nella camera di comportamento allineando i numeri agli angoli del modello. Attendere 2-3 minuti per permettere ai vermi di acclimatarsi sulle piastre di dosaggio.
NOTA: Assicurarsi che la linguetta del portello della camera di comportamento sia chiusa prima di avviare la registrazione video nella fase successiva.

Ripetere i passaggi 4.7-4.12 per il prossimo giro di piastrine. Acquisire almeno sei repliche o due giri di registrazione per ogni trattamento o genotipo.

5. Preparazione del reagente

1. Preparare agar e tampone NGM.
   1. In una bottiglia di vetro da 1 L, aggiungere 1,5 g di cloruro di sodio, 8,5 g di agar e 1,25 g di pepton. Aggiungere 500 ml di acqua distillata e una barra di agitazione alla bottiglia. Bottiglia di autoclave con contenuti.
   2. Posizionare la bottiglia su una piastra di agitazione e attivare la funzione di agitazione.
   3. Aggiungere con ordine utilizzando la tecnica sterile: 0,5 mL di 5 mg / mL colesterolo, 0,5 mL di 1 M di calcioCloruro, 0,5 mi di 1 M di solfato di magnesio e 12,5 ml di 1 M fosfato di potassio.
   4. Ripetere i passaggi da 5.1.1 a 5.1.2 per eseguire il buffer NGM ma lasciare fuori l'agar e il peptone nel passaggio 5.1.1.
2. Preparare il brodo LB.
   1. In una bottiglia di vetro da 1 L aggiungere 5 g di tryptone, 2,5 g di estratto di lievito, 2,5 g di cloruro di sodio, 500 ml di acqua distillata e 0,5 ml di 1 N di idrossido di sodio. Bottiglia di autoclave con contenuti.
3. Preparare il buffer M13.
   1. In una bottiglia di vetro da 1 litro aggiungere 1,817 g di Tris, 2,922 g di cloruro di sodio, 0,373 g di cloruro di potassio e 500 ml di acqua distillata. Autoclave la bottiglia con i contenuti.
4. Preparare ₍₂ CuCl) soluzione di rame cloruro.
   1. Ponderate 0,134 g di CuCl ₂ . Aggiungere soluto a 10 mL di tampone M13 in un tubo di plastica da 15 mL per ottenere una soluzione di stock di 100 mM di CuCl ₂ . Invertire il tubo di plastica fino a quando tutto il soluto ha dissolved.
   2. Utilizzare una siringa e filtro a membrana 0,2 micron per filtrare purificare il mM CuCl ₂ soluzione 100 in una provetta di plastica pulita 15 mL.
   3. Per rendere 10 mM soluzione CuCl _2, aggiungere 900 microlitri di tampone M13 e 100 ml di 100 mM CuCl ₂ soluzione madre in una provetta. Invertire il tubo di microcentrifuga per mescolare bene.

6. Analisi video

1. Scarica Python 3 (https://www.python.org/downloads/) e la libreria del software OpenCV (http://opencv.org/downloads.html).
2. Scaricare i tre script Python per l'analisi (https://github.com/WormLabCaltech/ResidentWorm).
   NOTA: Assicurarsi che tutti i file video da utilizzare siano in formato mp4 prima di procedere.
3. Per visualizzare le funzioni e le descrizioni dei parametri, digitare 'aiuto (inserisci nome funzione') nella console e premere enter. Ad esempio, digitare 'aiuto (calibrazione)' e premere enter.
4. Eseguire la funzione di taraturaCon i parametri di input per definire le aree video di interesse (ROI).
   1. Immettere il nome del video di calibrazione preso nella sezione 4 per la variabile 'mp4filename'. Includere le virgolette quando si inserisce il nome del file.
   2. Iniziare con i valori 600 e 360 ​​per le variabili 'Q * x' e 'Q * y'. * Immettere i numeri del quadrante da 1 a 4. Iniziare con il valore 310 per la variabile 'rad'. Regolare i valori delle variabili finché le maschere ROI non si allineano con i contorni quadranti sul modello.
   3. Registrare il numero totale di pixel in ogni ROI che verrà stampato nella console all'esecuzione di questa funzione. Inserisci questo valore per il parametro 'ROI_size' nella funzione preference_index.
5. Esegui la funzione di soglia_constant per determinare la costante di soglia appropriata. Regolare il valore "costante" fino a quando i worms (bianco) possono essere visti chiaramente e c'è un minimo rumore di sale e pepe in background (nero).
6. Esegui la funzione preference_index per generare un foglio dati csv, l'indice di preferenza del video e l'apposita trama di occupazione del worm.
   1. Utilizzare i valori 'Q * x', 'Q * y', 'rad', 'ROI_size' e 'costanti' determinati dai passaggi 6.4 e 6.5 come parametri di input per la funzione preference_index.
      NOTA: per ogni frame video, la funzione preference_index conta il numero di pixel di worm in ogni ROI e calcola la percentuale di pixel di worm rispetto al numero totale di pixel ROI. La funzione genera quindi un valore di indice di preferenza per ogni fotogramma video utilizzando la formula:
      
      NOTA: una volta che il programma ha analizzato tutti i fotogrammi nel video, viene generato un valore medio dell'indice di preferenza per il video. Un diagramma di occupazione di worm con l'indice di preferenza del video stampato in alto e un foglio elettronico che contieneIl pixel worm, i valori di occupazione della percentuale di worm e l'indice di preferenza per ciascun frame video verranno salvati nella cartella indicata una volta che il programma è terminato.

Risultati

La Figura 3A mostra i valori di indice di preferenza ottenuti per accoppiamenti diversi di genotipi e di trattamento. Un valore di indice di preferenza di 1 indica una forte attrazione verso la soluzione collocata nel ROI sperimentale mentre un valore di indice di preferenza di -1 indica una forte repulsione. Un indice di preferenza di 0,02 è stato ottenuto quando la soluzione tampone M13 è stata collocata sia nei controlli ROI che nei controlli sperimentali, dimostrando che non vi è alcuna propensione spaziale verso il ROI. I vermi N2 hanno evitato fortemente gli ioni di rame che hanno portato ad un indice di preferenza di -0.67, che conferma i risultati precedenti che gli ioni di rame sono un forte repellente ( Movie Supplementary 1 ) ⁴ . Mutanti osm-3 , che non hanno una corretta formazione dei segmenti distali di ciglia sensoriali, hanno mostrato una riduzione significativamente ridotta degli ioni di rame (PI = -0,19) ¹⁵ . Mutanti ocr-2 , che sono de In molte risposte nociceptive mediate da ASH, tra cui l'evasione di rame, presentano anche una diminuzione significativa di evitamenti e anche una lieve attrazione verso gli ioni di rame (PI = 0,19) ( Supplementary Movie 2 ) ¹⁶ .

La Figura 3B riporta i diagrammi rappresentativi di occupazione del worm, che indicano nel tempo la densità dei worm nel controllo rispetto ai ROI sperimentali. Più scuro è il colore dell'area di disegno, maggiore è il numero di pixel di worm nel ROI. La trama di occupazione dei worm N2 trattati con il controllo tampone M13 mostra che il numero di worm in entrambi i ROI rimane simile per tutto il saggio. Tuttavia, la trama di occupazione dei vermi N2 trattati con ioni di rame indica che i worm bloccano fortemente e costantemente il ROI sperimentale durante tutto il test.

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Figura 1: Rappresentazione fotografica e schematica del comportamento della camera. ( A ) Vista frontale della configurazione della camera di comportamento (a sinistra) e corrispondente rappresentazione schematica del telaio della camera (a destra). I fogli di poliestere opaco racchiudono la camera su tutte le facce, tranne la faccia inferiore, che consente la luce attraverso il pannello a infrarossi. I numeri 1, 2 e 3 corrispondono agli strati di estrusione in (B). ( B ) Schema della vista superiore degli strati di estrusione comprendente il telaio della camera di comportamento. Questo include lo strato superiore (1), lo strato di montaggio della telecamera centrale (2) e lo strato inferiore (3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Modelli di posizionamento e di allineamento delle piastre. ( A ) Il modello di posizionamento della soluzione ha quattro quadranti e marcatori di allineamento numerico. La soluzione di controllo è posizionata nei quadranti destra destra e sinistra, mentre la soluzione sperimentale è posizionata nei quadranti in alto a destra e in basso a sinistra. ( B ) Il modello di allineamento delle piastre ha solo marcatori di allineamento numerico per ridurre al minimo l'occlusione dei vermi nel campo visivo durante la registrazione e l'analisi video. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: dati di esempio raccolti utilizzando questo test. ( A ) i valori di indice di preferenza (PI) per il tipo selvatico N2 e il mutante C. elegans m> in risposta al buffer M13 e 10 mM CuCl _2. I vermi N2 non hanno mostrato preferenze tra i controlli e le ROI sperimentali quando la soluzione di controllo M13 è stata collocata in entrambi i ROI ma ha fortemente evitato il ROI sperimentale quando sono stati inseriti ioni di rame (PI = 0,02 e -0,67 rispettivamente). I mutanti osm-3 (p802) e gli ocr-2 (ak47) mutanti hanno mostrato una diminuzione significativamente ridotta degli ioni di rame rispetto a N2 (PI = -0,1 e 0,2 rispettivamente). N = 6 assaggi per ogni accoppiamento di trattamento genotipo,> 360 worm per assay, barre di errore indicano ± 1 SEM, *** p <0,001, ANOVA a senso unico seguita da test Tukey onestamente significativa differenza (HSD) post-hoc. ( B ) Per i worm N2 con buffer M13 in entrambi i ROI (top) e N2 worm con buffer M13 nel ROI di controllo e ioni di rame nel ROI sperimentale (bottom). La scala di colore sotto ogni trama di occupazione rappresenta il numero di pixel di worm.Pload / 55963 / 55963fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Film supplementare 1: risposta comportamentale dei worm N2 a 10 mM di rame cloruro. I vermi vengono attratti dai quadranti di controllo con il buffer M13 (in alto a sinistra e in basso a destra) ma evitare fortemente i quadranti contenenti ioni di rame disciolti nel buffer M13 (in alto a destra e in basso a sinistra). Il video è stato registrato a 1 fotogramma al secondo e aumentato di 15 volte. Clicca qui per scaricare questo file.

Film aggiuntivo 2: Responsabilità comportamentale di ocr-2 (ak47) Worms a 10 mM Cloruro di rame. I worms vagano in misura uguale in entrambi i quadranti di controllo con buffer M13 (in alto a sinistra e in basso a destra) e il quadranteContenenti ioni di rame disciolti nel buffer M13 (in alto a destra e in basso a sinistra) durante la durata della registrazione. I mutanti presentano una leggera preferenza per i quadranti contenenti ioni di rame all'inizio della registrazione. Il video è stato registrato a 1 fotogramma al secondo e aumentato di 15 volte. Clicca qui per scaricare questo file.

File aggiuntivo: Modelli di soluzioni e modelli di allineamento delle piastre. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Un passo critico nel protocollo è garantire che le lastre di dosaggio abbiano un livello di asciugatura uniforme in diversi giorni sperimentali. Diversi livelli di secchezza provocheranno differenti velocità di diffusione della soluzione nell'agar e, di conseguenza, variazioni nell'esito comportamentale. Quindi le piastre di dosaggio dovrebbero essere sempre fresche nel pomeriggio prima di esperimenti. Il numero di worm testati per ogni analisi dovrebbe essere regolato anche per facilitare il confronto tra i trattamenti. Per riferimento, un worm di tipo selvatico mette in media 4-10 uova / h che producono> 360 worm per ogni analisi se il protocollo di sincronizzazione worm è seguito ¹⁷ . Se alcuni ceppi mutanti sono difettosi di uovo, scelgono più verme adulte gravide per l'uovo per raggiungere il numero di progenie. Un altro passo importante del protocollo è quello di gestire delicatamente i worm durante il processo di lavaggio e il collocamento di worm. I vermi sono sensibili agli stimoli meccanici, che suscitano risposte di stress S inversioni e inibizione dell'ovaio ¹⁸ . Inoltre, occorre prestare attenzione a definire con precisione il ROI e determinare il valore costante di soglia ottimale per condizioni specifiche di illuminazione prima di procedere all'analisi video. Si consiglia inoltre di ripetere i processi di calibrazione e di soglia se è trascorso un lungo periodo dall'ultimo esperimento.

Una limitazione di questo metodo è che non è adatta per analizzare piccole popolazioni di vermi. Tuttavia, se vengono eseguiti i comandi appropriati per determinare l'influenza della presenza di cibo sul comportamento sensoriale, è possibile anche utilizzare l'alimento per limitare la localizzazione esplorativa spaziale dei vermi come nel dosaggio di ritenzione. Inoltre, questo metodo non è destinato a studiare la navigazione a gradiente dello stimolo a causa della vicinanza e delle piccole quantità delle gocce di controllo e di sperimentazione utilizzate.

E_content "> In futuro, il software di programmazione che consente il tracciamento multi-worm e l'estrazione funzionale di singolo worm può essere integrato in questo sistema ^{19 , 20. La} registrazione di parametri di comportamento sottile di singoli comportamenti di worm, quali velocità di inversione e ampiezza delle curve del corpo, Un quadro più dettagliato del comportamento chemosensoriale di un singolo worm nel contesto di un dosaggio basato sulla popolazione.Il saggio può essere modificato anche per studiare l'abitudine mediante fori di foratura attraverso il ROI usando aghi siringa con la dimensione del misuratore appropriato e riempendo i fori con agar infuso Con il composto sperimentale o il tampone di controllo, in modo da garantire una concentrazione superficiale più consistente del composto per un periodo di tempo più lungo di registrazione, come è necessario durante gli studi di abitudinazione.Un'altra potenziale applicazione di questo metodo è condurre studi comportamentali comparativi su diverse specie di nematodi. Inoltre, la camera di comportamentoPuò essere modificato in più modi per studiare le risposte comportamentali a stimoli multimodali. Per applicazioni optogenetiche, array di LED ad alta intensità possono essere fissati accanto al supporto della fotocamera per attivare selettivamente i neuroni di interesse durante il test. Gli elementi di riscaldamento, i sistemi di raffreddamento e sensori di temperatura possono anche essere aggiunti alla configurazione per studiare gli effetti della temperatura sui comportamenti sensoriali. Inoltre, i sistemi di erogazione dell'odore possono essere installati all'interno della camera per studiare le interazioni tra modalità odorsensoria e chemosensoria.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Estrusi per intelaiature in alluminio con scanalatura a T	McMaster-Carr	47065T101	Profilo singolo, misura 1", solido
Staffe	McMaster-Carr	47065T236	1" lungo per estrusi a profilo singolo alto 1"
Elementi di fissaggio compatti per l'alimentazione finale	McMaster-Carr	47065T139	1" (singolo), confezione da 4
supporti per pannelli solidi Twist-in	McMaster-Carr	47065T251	ad alta estrusione da 1
"	McMaster-Carr	47065T91	Per 1" ad alta estrusione
Foglio acrilico colato otticamente trasparente	McMaster-Carr	8560K211	3/16" di spessore, 12" x 12"
Tessuto in poliestere rivestito in vinile	McMaster-Carr	88505K57	0,027" di spessore, 61" di larghezza,
gommini	in ottone neroMcMaster-Carr	9604K22	Misura commerciale 0, diametro esterno 0,545"
Rondelle in acciaio	McMaster-Carr	90107A029	Vite da 1/4"
Viti a testa arrotondata	McMaster-Carr	90272A546	Filettatura da 1/4" - 20, lunga 1 - 1/2"
Retroilluminazione operativa standard	Luci Smart Vision	Vedi fornitore locale	8" x 8", infrarossi 850 nm
IVP-C1	Luci Smart Vision	Vedi il fornitore
Alimentatore T1	Luci Smart Vision	Vedi il fornitore
Dino lite Pro AM4113T	Microscopio digitale Dino-Lite	Vedi il fornitore
MS09B supporto per microscopio	Microscopio digitale Dino-Lite	Vedi il fornitore locale