Microtissues 3D per la terapia rigenerativa iniettabile e droga di High-throughput Screening

Summary

Questo protocollo descrive la fabbricazione di microcryogels elastico 3D macroporosa integrando microfabbricazione con tecnologia cryogelation. Durante il caricamento con cellule, microtissues 3D vengono generati, che possono essere facilmente iniettate in vivo per facilitare la terapia rigenerativa o assemblati in matrici per in vitro screening di farmaci di alto-rendimento.

Abstract

Per aggiornare coltura cellulare 2D tradizionale a coltura cellulare 3D, abbiamo integrato microfabbricazione con tecnologia cryogelation per produrre macroporosa Microscala Criogel (microcryogels), che può essere caricato con una varietà di tipi di cellule per formare microtissues 3D. Qui, presentiamo il protocollo per fabbricare versatile microtissues 3D e loro applicazioni in terapia rigenerativa e lo screening di stupefacenti. Dimensione e forma-controllabile microcryogels può essere fabbricato in un chip di matrice, che può essere raccolto fuori del chip come singoli vettori cellulare-caricato per la terapia rigenerativa iniettabile o più ulteriormente essere assemblati su chip in matrici di microtessuti 3D per high-throughput screening di stupefacenti. A causa della natura elastica alta di questi Criogel su microscala, il microtissues 3D presentano ottima iniettabilità per terapia minimamente invasiva cellulare proteggendo le cellule dalla forza di taglio meccanico durante l'iniezione. In questo modo una maggiore sopravvivenza ed effetto terapeutico nel modello di ischemia dell'arto del mouse. Nel frattempo, montaggio di matrici di microtessuti 3D in un formato standard di 384-multi-bene facilita l'uso di comuni strutture di laboratorio e attrezzature, abilitazione high throughput screening su questa piattaforma di cultura cellulare 3D versatile di stupefacenti.

Introduction

Coltura cellulare tradizionale su superfici appiattite di (2D) bidimensionali, ad esempio una piastra di coltura o piastre multi-pozzetto, difficilmente può suscitare comportamenti delle cellule vicino ai loro Stati nativi. Accurata ricapitolazione dei microambienti cellulari nativi, che comprendono vari tipi di cellule, matrici extracellulari e fattori bioattivi solubile in tridimensionale (3D) architetture^{1,2,3 ,4}, è essenziale per costruire biomimicking tessuti in vitro per applicazioni in medicina rigenerativa, ingegneria dei tessuti, biologia fondamentale ricerca e droga scoperta^{5,6,7 ,8,9}.

Al posto di coltura cellulare 2D, coltura cellulare 3D è ampiamente usato per avanzare biomimetici micro-architettura e caratteristiche funzionali delle cellule coltivate in vitro. Un metodo di coltura popolare cellulare 3D è quello di cellule aggregate in sferoidi^7,8,9,10. Sferoidi cellulare potrebbero essere iniettati a tessuti danneggiati con una maggiore ritenzione cellulare e la sopravvivenza rispetto ad iniezione di cellule disperse. Tuttavia, non uniforme sferoide dimensioni e inevitabile danno meccanico imposto sulle cellule con la forza di taglio fluido durante l'iniezione conducono al povero cella effetti terapeutici^11,12,13. Allo stesso modo, l'intrinseca non-uniformità durante l'aggregazione di sferoidi ha reso loro traduzione al 3D basati su cellule high throughput screening di stupefacenti impegnativo¹⁰.

Un altro metodo per la coltura cellulare 3D è realizzato con l'assistenza dei biomateriali, che in genere incapsula le cellule in idrogel acquoso o scaffold porosi. Esso consente una maggiore flessibilità nella costruzione di architetture 3D. Per la terapia, cellule incapsulate in massa ponteggi vengono generalmente recapitate al corpo animale tramite impianto chirurgico, che è invasivo e traumatico, limitando quindi la traduzione ampia al capezzale. D'altra parte, idrogeli acquosi abilitare terapia minimamente invasiva iniettando le cellule sospese in soluzione di idrogel precursore nei corpi degli animali, permettendo la gelificazione in situ tramite termo-, reticolazione chimica o enzimatica¹¹. Tuttavia, come le cellule vengono consegnate mentre i precursori di idrogel sono ancora in uno stato acquoso, essi sono anche esposti a cesoia meccanica durante l'iniezione. Non solo quindi, reticolazione chimica o enzimatica durante la gelificazione in situ di idrogel potrebbe anche imporre il danneggiamento delle cellule all'interno. Per lo screening di stupefacenti, colture cellulari di biomateriale-aiutato affrontano problemi con uniformità, la controllabilità e la velocità effettiva. Utilizzando idrogeli, cellule sono in genere coinvolti durante la gelificazione, da che il processo può colpire la funzione e la vitalità cellulare. Gelificazione durante la semina delle cellule ostacola anche l'utilizzo di maggior parte delle apparecchiature ad alta produttività, poiché potrebbe essere necessario essere tenuta su ghiaccio per evitare la gelificazione prima semina cellulare l'idrogel e l'idrogel potrebbe incepparsi punte di erogazione, che sono solitamente molto sottili per garantire la precisione per High throughput screening. Scaffold preformato potrebbe potenzialmente separare procedure di fabbricazione di biomateriale da coltura cellulare, tuttavia la maggior parte sono disponibili come materiali alla rinfusa con relativamente bassa velocità effettiva¹⁴prodotti basati sul patibolo.

Per superare alcune delle carenze degli attuali metodi di cultura 3D, abbiamo sviluppato una tecnologia di microfabbricazione-cryogelation integrato per fabbricare un chip di matrice standard e facile da usare microcryogel¹⁵. In questo protocollo, la gelatina è selezionata per esemplificare la tecnica di fabbricazione di microcryogel come è biocompatibile, biodegradabile e conveniente, e nessuna ulteriore modifica è necessaria per il collegamento delle cellule. Altri polimeri di fonti naturali o sintetici potrebbero essere utilizzati anche per la fabbricazione, a seconda dell'applicazione. Tramite questa tecnologia, possiamo fabbricare microcryogels miniaturizzati e altamente elastico con controllabile dimensioni, forma e disposizione. Quando caricato con una varietà di tipi cellulari, microtissues 3D potrebbe essere formata per varie applicazioni. Queste caratteristiche uniche permettono iniettabilità desiderata, protezione delle cellule e ritenzione sito diretta dopo iniezione in vivo per ottenere effetti terapeutici migliori. Non solo in questo modo il microcryogels potrebbe essere ulteriormente trattati per formare matrici di microtessuti 3D compatibili con comuni attrezzature di laboratorio e strumenti per realizzare la coltura delle cellule ad alta produttività per lo screening di stupefacenti versatile e altri test cellulari. Qui, ci faremo i dettagli il processo di fabbricazione di microcryogels e il suo post-trattamento come singoli microtissues 3D o 3D microtessuti matrici per due importanti applicazioni, terapia cellulare e lo screening di stupefacenti, rispettivamente^10,15 .

Protocol

esperimenti sugli animali seguito rigoroso protocollo approvato dal comitato di etica animale il centro di analisi biomedica, Università di Tsinghua. Sotto approvazione del comitato etico, tessuto adiposo umano è stato ottenuto dal dipartimento di chirurgia plastica di Peking Union Hospital con consenso informato dai pazienti.

1. fabbricazione di 3D Microcryogels

1. progettazione e fabbricazione di chip array microstencil
   1. uso un software commerciale a matrici di progettazione di geometrie specifiche, quali cerchi, ellissi, triangoli o trifogli ¹⁴, a seconda della successiva applicazione.
      Nota: Fare riferimento alla sezione 2 del protocollo per la medicina rigenerativa e, sezione 3, del protocollo per lo screening di stupefacenti per dettagli di design.
   2. Importare il disegno per il laser incisione software che accompagna la macchina per incisione laser. Utilizzando le impostazioni di laser secondo le raccomandazioni di fabbrica per la macchina per incisione laser, incisione laser il disegno importato sulla Poly (methymethacrylate) (PMMA) fogli.
   3. Lavare i chip di matrice microstencil con acqua deionizzata per pulire i detriti da incisione laser. Secca la matrice microstencil chip a 60 ° C. conservare in un sacchetto sigillato a temperatura ambiente per mesi.
2. Fabbricazione di chip array microcryogel
   1. microstencil Place 4 chip sul vassoio di campione di matrice e inserire nel plasma pulitore. Chiudere la porta del pulitore e accendere la pompa del vuoto per 2 min, quindi accendere la potenza RF massima (18 W) per trattare il chip array microstencil nel plasma pulitore per 3 min a temperatura ambiente per aumentare l'idrofilia.
   2. Aggiungi 0,06 g di gelatina per 1 mL di acqua deionizzata al modulo soluzione di precursore del gelatina 6% (wt/vol) (abbastanza per fare 5 fiches). Calda a 60 ° C in bagnomaria a sciogliere adeguatamente. Incubare in ghiaccio per 5 min.
   3. Add 3 µ l di glutaraldeide nella soluzione del precursore di gelatina a una concentrazione finale di 0.3%. Mescolare accuratamente.
   4. Pipetta 200 µ l di soluzione precursore con glutaraldeide sulla superficie superiore del chip array microstencil.
      Nota: 200 µ l è sufficiente per un chip di 75 mm x 25 mm indipendentemente dal disegno. Aumentare la quantità proporzionalmente quando viene aumentata la superficie del chip.
   5. Manualmente distribuire la soluzione uniformemente sopra il chip da raschiare indietro avanti e indietro con una bacchetta di vetro piegato 2 o 3 volte.
      Nota: Ogni micro-pozzetto sul chip microstencil può essere riempito con soluzione di precursore a causa della loro natura idrofila dopo trattamento al plasma.
   6. Collocare immediatamente il chip matrice precursore-soluzione-riempita in un congelatore a-20 ° C per 16 h per cryogelation.
   7. Regola i liofilizzatori a-40 ° C per 30 min. Posizionare il chip array dopo cryogelation nei liofilizzatori e lyophilize il chip array per 2 h in vuoto.
      Nota: Microcryogels di gelatina con macropori interconnessi si formano perché il ghiaccio formatosi durante cryogelation sublimes nei liofilizzatori.
   8. Procedere alla sezione 2 per il trattamento dell'ischemia critica dell'arto (CLI) e sezione 3 per lo screening di stupefacenti di alto-rendimento.

2. Raccolta individuale Microcryogels per Microtissues 3D forma iniettabile per il trattamento di CLI

1. microcryogels individuale di raccolta
   1. Design matrici (75 mm x 25 mm) di 600 cerchi, ciascuno con 400 µm di diametro, in software commerciale per la costruzione di microtessuti 3D iniettabili. Utilizzare PMMA di 300 µm spessore per la fabbricazione di chip array microstencil come descritto in dettaglio nella sezione 1.1.
   2. Fabbricare chip array microcryogel come descritto in sezione 1.2.
   3. Fabbricare una matrice di PDMS estrattore con lo stesso design come passaggio 2.1.1 da litografia soft standard ^{16 , 17}.
   4. Overlay il chip di matrice microcryogel sulla parte superiore della matrice di estrattore di PDMS, allineando ogni microcryogel con un estrattore sulla matrice. Premere il chip di matrice microcryogel verso la matrice di perno espulsore per spingere il microcryogels fuori i micropozzetti con i perni sporgenti sulla matrice PDMS eiettore pin per la raccolta individuale microcryogels.
   5. Raccolto il microcryogel nell'acqua e raccoglierli con l'ausilio di filtri a cella. Utilizzare un filtro per raccogliere microcryogels da un unico chip (cioè, 600 microcryogels).
   6. Microcryogels di lavaggio con 0,1 M NaBH ₄ il ghiaccio per 20 min placare ogni residuo reticolato aldeide. Uso 5 mL di 0,1 M NaBH ₄ per il circuito integrato. Scartare NaBH ₄ e lavare con 5 mL di acqua deionizzata per 15 min 3 a 5 volte, ogni volta.
   7. Gettare l'acqua dal filtro cella e raccogliere microcryogels in un cluster per filtro cella e posizionare un cluster in una capsula di Petri 35 mm utilizzando una pinzetta curva. Aggiungere 50-70 µ l deionizzata acqua per ogni cluster e coprire il coperchio del piatto Petri. Picchiettare delicatamente la capsula di Petri sul tavolo per livellare tutti i microcryogels, così che nessun microcryogels sono sdraiata sopra un altro microcryogel per formare un monostrato di microcryogels sulla superficie del piatto Petri.
   8. Congelare il raccolto microcryogels a-20 ° C per 4-16 h prima li liofilizzazione per 2 h (Vedi punto 1.2.7). Conservare microcryogels in un vuoto a temperatura ambiente fino a ulteriore uso.
2. Caratterizzazione di microcryogels
   1. valutare i pori della microcryogels tramite la scansione di formazione immagine di microscopia elettronica (SEM).
      1. Immobilizzare il microcryogels raccolto e liofilizzato sulla porta campione di nastro adesivo doppio-lato e cappotto con oro con un velo di polverizzazione per 90 s, prima di formazione immagine di SEM ¹¹. Valutare e analizzare la distribuzione dei diametri dei pori in microcryogel da sette diverse immagini di SEM utilizzando software di analisi di immagine.
   2. Pesare un cluster di 600 microcryogels liofilizzato in una capsula Petri 35mm per il peso di gelatina secca microcryogels (GMs). Aggiungere 60 µ l deionizzata acqua al cluster di microcryogels liofilizzati e attendere 30 s per microcryogels completamente assorbire acqua e gonfiarsi. Pesare il microcryogels gonfie. Rapporto gonfiore
      1. determinare l'equilibrio e la porosità del microcryogels, come il rapporto del peso di gonfio microcryogels a quella di gelatina secchi microcryogels e il rapporto del peso di acqua tenuta in microcryogels a quella di microcryogels idratata, rispettivamente ¹³.
   3. Iniettabilità di misura di microcryogels utilizzando una pompa a siringa programmabile integrata con una forza digitale calibro ¹⁴.
      1. Macchia 600 pezzi di microcryogels di Trypan blue e sospendere a 600 µ l 15% di soluzione di gelatina per ottenere una distribuzione omogenea. Caricare microcryogel 1 mL di sospensione in siringa da 1 mL. Iniettare la miscela attraverso un ago calibro 27 collegato alla siringa 1 mL utilizzando una pompa a siringa programmabile con portata di 1 mL/min
      2. Iniezione in tempo reale monitor forza con la forza digital gauge test e tracciare la curva forza-tempo. Dopo l'iniezione, osservare l'integrità del microcryogels sotto un microscopio.
         Nota: GMs sospese in soluzione di gelatina del 15% (wt/vol) possono essere agevolmente iniettato e rimasto intatto dopo l'iniezione.
   4. Caratterizzano la degradabilità del microcryogels.
      1. In primo luogo, misurare il peso di un cluster di 600 microcryogels liofilizzato in una capsula Petri 35 mm come il peso a secco. Quindi, immergere 600 microcryogels liofilizzato in 2ml 0,025% (vol/vol) tripsina/EDTA.
      2. Raccolta microcryogels dalla soluzione utilizzando un colino di cella in diversi momenti (vale a dire, 10, 20, 30, 40, 50, 60 e 70 min). Stoppino via soluzione in eccesso con un fazzoletto. Misurare il peso di microcryogels in diversi momenti e calcolare il grado di degradazione, come il rapporto del peso di microcryogel ad un certo punto del tempo a quello di microcryogel all'istante zero.
3. Autoloading delle cellule in microcryogels al modulo 3D microtissues
   1. microcryogels da passo 2.1.8 per sistema di sterilizzazione di ossido di etilene con l'esposizione di gas 12 h seguita da 12h degasaggio sotto vac di sterilizzareUUM.
   2. Scelgono adiposo-derivate cellule mesenchimali umane stromali (hMSCs) per il trattamento del hindlimb ischemico del mouse. Isolare cellule seguendo procedure come precedentemente segnalato ¹⁸.
   Supporto di
   3. cultura hMSCs nella crescita contenente 2% siero bovino fetale (FBS), 10 ng/mL fattore crescita epidermico (EGF), 10 ng/mL bb fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF-bb), 1 X selenio di insulina transferrina (ITS), 10 ^-8 M desametasone, 10 ^-4 M 2-fosfato dell'acido ascorbico, 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina in DMEM/F12. Passaggio le cellule al rapporto di 1:3 quando confluenti. Utilizzare le celle di passaggio 3 di 5 nei seguenti esperimenti.
   4. Harvest hMSCs con tripsina e quantificare il numero di cellulare utilizzando una camera di conteggio di Fuchs-Rosenthal e risospendere ad una densità di 8 x 10 ⁶ cellule/mL nel terreno di crescita hMSCs.
   5. Sospensione hMSCs di pipetta 60 µ l sul monostrato di 600 microcryogels con diametro di 400 µm in un piatto di 35 mm di sezione 2.1. Cellule sono automaticamente assorbite nel micro-strutture porose della microcryogels.
   6. Mantenere in una camera umidificata e incubare a 37 ° C per 2 h consentire alle cellule di allegare. Dopo 2 h di incubazione, aggiungere 2 mL terreno di coltura. Modificare il mezzo ogni 2 giorni. Cultura microcryogels hMSCs-caricato per 2 giorni formare 3D microtissues.
   7. Dopo 2 giorni di coltura, pipettare 100 microcryogels hMSCs-caricato per pozzetto su una piastra a 96 pozzetti, 120 µ l di soluzione di lavoro resazurin preparata secondo il produttore ' Istruzione s in ciascun pozzetto. Incubare per 2 ore a 37 ° C. Fluorescenza
      1. rileva problemi di resazurin metabolizzato dalle cellule vitali in un lettore di micropiastre con una lunghezza d'onda luce di eccitazione di 560 nm ed emissione luce lunghezza d'onda di 590 nm. Stabilire una curva standard del numero di cell vs fluorescenza usando hMSCs per interpolare il numero di cellulare da intensità di fluorescenza per futuro esperimento secondo il protocollo di kit ¹³.
   8. Valutare il numero di hMSCs in microcryogels dal giorno 0 al giorno 4 utilizzando resazurin come descritto nel passo 2.3.7 dal giorno 0 al giorno 4.
   9. Macchia cellule in microcryogels con diluizione 1: 500 di calceina e diluizione di 1: 250 di ioduro di propidio (conosciuto come live/dead macchiatura) in tampone fosfato salino (PBS) e osservare al microscopio a fluorescenza o microscopio a fluorescenza confocale.
4. Iniezione di microtissues 3D in vivo per il trattamento del CLI nel modello del topo
   1. stabilire ischemia critica hindlimb dei topi nudi femminili di BALB/c come segnalati ^{11 , 19} per determinare l'effetto terapeutico della terapia a base di microtessuti 3D.
   2. Trasferire la microtissues dal passaggio 2.3.6 utilizzando una pipetta 5 mL in un colino di cella e filtrare via coltura.
   3. Risospendere il microtissues 3D hMSCs-caricato in soluzione di gelatina di 15%, con una densità di 100 microcryogels a 100 µ l di soluzione.
   4. Prima di chirurgia, sterilizzare gli strumenti chirurgici in autoclave ed eseguire un intervento chirurgico in una sala operatoria animale in un centro animale.
   5. Posizionare il mouse nella camera di induzione di anestesia contenenti 1-3% isoflurane in 100% di ossigeno ad un flusso di 1 L/min eritromicina applica sugli occhi del mouse per evitare l'essiccazione. Attraverso un'incisione della pelle lunga 1 cm, legare l'arteria femorale e dei relativi rami con 5-10 punti di sutura seta ed accise ¹⁹.
   6. Inject indocianina verde (ICG) (0,1 mL di 100 µ g/mL) attraverso la vena caudale iniezione per monitorare il flusso di sangue. Eseguire imaging di fluorescenza di ICG utilizzando un sistema di formazione immagine di fluorescenza (qui, sistema artigianale) in riflettanza geometria ¹¹.
   7. Iniettare per via intramuscolare microtissues in tre siti del muscolo gracilis attorno all'incisione dell'arteria usando una siringa da 1 mL con un ago di 23 gauge.
   8. Dopo la chirurgia, tenere il mouse caldo con un pad riscaldato nella gabbia recupero. Iniettare per via sottocutanea meloxicam per alleviare il dolore e monitorare continuamente fino a quando sveglio.
   9. Dopo 28 giorni, per monitorare l'efficacia terapeutica dell'arto trattato microtessuti 3D fluorescenza imaging ¹¹.
      Nota: Iniettare per via sottocutanea meloxicam per alleviare il dolore quando il mouse ha mostrato amputazione spontanea.
   10. Euthanize topi con anidride carbonica dopo il completamento degli esperimenti.
       Nota: Qui, l'eutanasia con l'anidride carbonica è stata eseguita secondo un rigido protocollo approvato dal comitato di etica animale il centro di analisi biomedica, Università di Tsinghua.

3. Assemblea di microtessuti Chip Array per droga di High-throughput Screening

1. assemblaggio della matrice di microcryogel per la coltura cellulare su chip
   1. modifica la struttura nella sezione 1.1 secondo dimensioni piastre multi-pozzetto convenzionali, cioè, per formato 384-multi-pozzo, progettare una matrice di 16 × 24 pozzetti (riga di colonna), ciascuno di 2 mm di diametro e 4,5 mm di distanza centro--centro.
   2. Laser incide su una lastra di PMMA spessore 500 µm, come descritto nella sezione 1.1.
   Microcryogels
   3. fabbrichi come descritto in sezione 1.2 utilizzando da che il chip di matrice 384-multi-bene ottenuto punto 3.1.2. Questa matrice contenenti microcryogel è designata come il chip di matrice microcryogel.
   4. Lavare il chip di matrice microcryogel con 50 mL 0,1 M NaBH ₄ per placare qualsiasi aldeide residuo reticolato, quindi sciacquare ripetutamente con 50 mL di acqua deionizzata per 3 volte, 2 h ogni volta.
   5. Gettare l'acqua, congelare il chip di matrice microcryogel a-20 ° C per 4-16 h prima liofilizzazione secondo punto 1.2.7.
   6. Design di array modifica 384-multi-pozzo al punto 3.1.1 per contenere 16 × 24 pozzetti, ciascuna della spaziatura di 3 mm di diametro e 4,5 mm da centro a centro.
   7. Rimuovere un lato del supporto da un foglio di ultra-sottile (10 µm) biocompatibili doppio nastro biadesivo e incollarlo su un lato di un pezzo di foglio di PMMA spessore 3 mm. Laser incide il disegno dal punto 3.1.4 su questo strato di PMMA spessore mm 3 conformemente al punto 1.1. Questa matrice viene designata come la matrice serbatoio.
   8. Allinea la matrice microcryogel chip con il chip di matrice serbatoio e aderire insieme strettamente per assemblare il chip di matrice 3D microcryogel per la coltura delle cellule su chip. Sterilizzi con radiazione ultravioletta per 1 h.
   9. Matrice 3D microcryogel store scheggia nel vuoto a temperatura ambiente per ulteriori esperimenti.
2. Drug screening 3D microtessuti matrici
   1. riempire una casella bagnata con 25 mL di acqua deionizzata sterile per servire come una camera umida per la coltura cellulare. Pre-riscaldare in un umidificata 5% CO ₂ incubatore a 37 ° C.
   2. Raccolta di cellule di cancro del polmone non a piccole cellule (NCI-H460) e cellule di carcinoma epatocellulare (HepG2) dalle piastre di coltura del tessuto secondo protocollo standard e risospendere in terreni di coltura ad una densità finale di 1.0 x 10 ⁶ cellule/mL. Mescolare accuratamente.
      Nota: RPM1640 con 10% FBS, 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina viene utilizzato per NCI-H460. Utilizzare DMEM con 10% FBS, 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina per HepG2.
   3. Rimuovere la camera di umidità da incubatrice. Utilizzare una pinzetta per attentamente posto il 3D assemblato microcryogel chip array dal punto 3.1.9 in camera umidostatica. Fare attenzione di non bagnare la microcryogels con acqua nella camera di.
   4. Mescolare la sospensione cellulare accuratamente, quindi aliquota 3 µ l di sospensione cellulare direttamente sul microcryogel in ciascun pozzetto.
      Nota: La punta della pipetta deve toccare leggermente la superficie della microcryogel prima di espellere la sospensione cellulare. Le cellule sono auto-caricato in microcryogel di assorbimento. Non effettuare il seeding cellule nei pozzetti periferici.
   5. Aggiungere 10 μL di media in ciascun pozzetto dopo che le cellule sono seminate in microcryogel utilizzando la pipetta multicanale, ad esempio un gestore di liquido 96 canali. Medio è anche aggiunto ai pozzetti periferici.
      Nota: Uso RPM1640 media con 10% FBS, 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL streptomycin per le cellule H460. Utilizzare supporti DMEM con 10% FBS, 100 U/mL di penicillina e streptomicina 100 µ g/mL per le cellule di HepaG2.
   6. Cultura la matrice cellulare-caricato microcryogel chip in camera umidostatica per 24 h in un umidificata 5% CO ₂ incubatore a 37 ° C per matrice di microtessuti 3D form.
   7. Sciogliere doxorubicina e IMMLG-8439 ⁹ a solfossido dimetilico (DMSO) per formare una soluzione stock di 10 mM. Diluire farmaci con terreno di coltura per formare un gradiente di concentrazione di 10 volte diluizione da 2 nM a 200 µM.
   Beh
   8. aggiungere 10 µ l delle soluzioni di droga in ciascuno. Utilizzare 0,1% DMSO (diluito in mezzo) come controllo. Incubare la matrice di microtessuti 3D caricati di droga in un umidificata 5% CO ₂ incubatore a 37 ° C per 24 h.
   9. Aggiungere 4 µ l di soluzione di riserva di resazurin in ciascun pozzetto. Incubare a 37 ° C per la matrice di 2 h. posto il 3D microtessuti nel lettore di micropiastre e rilevare la fluorescenza di resazurin metabolizzato dalle cellule vitali ad una lunghezza d'onda luce di eccitazione di 560 nm ed emissione luce lunghezza d'onda di 590 nm.
   10. Sottrarre il segnale di linea di base di resazurin da tutti i pozzetti prima di ulteriore elaborazione dei dati. Calcolare la frazione di attuabilità delle cellule di ciascun pozzetto dividendo il segnale di fluorescenza dal segnale di fluorescenza media nei pozzetti di controllo.
   11. Tracciare la curva dose-risposta nel software di tracciato con la frazione di attuabilità delle cellule come l'asse y e il logaritmo in base 10 della concentrazione di farmaco come l'asse x. Interpolare la concentrazione di inibizione di 50% (IC50) presso la frazione di attuabilità delle cellule di 0,5.

Results

Fabbricazione e caratterizzazione di microcryogels per la formazione di microtessuti 3D.

Secondo questo protocollo, microcryogels sono stati fabbricati a forma il 3D microtissues e microcryogels individuali o matrici di microcryogel e sono state applicate alla terapia rigenerativa e, rispettivamente di screening di stupefacenti (Figura 1). Microstencil chip array fabbricato da PMMA ...

Discussion

Rigenerativi modelli medicina e in vitro per lo screening di stupefacenti sono due importanti applicazioni per tessuto ingegneria^5,6,7,8,9. Mentre queste due applicazioni hanno esigenze molto diverse, un terreno comune tra di loro si trova nella necessità di un più biomimetici coltura condizione per migliorare la cellula funzioni¹⁹

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelatina	sigma	G7041	Tutti gli altri reagenti sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) se non diversamente indicato.
Glutaraldeide	J& K	902042	Utilizzato come reticolante nella preparazione del materiale.
Vetrino coprioggetto (24 x 50 mm)	CITOGLASS, Cina	10212450C	Per raschiare la soluzione prcursor su chip array di microstencil.
Sodio  borohydride, NaBH4	Beijing Chemical Works	116-8	Per lavare via la glutaraldeide rimanente dopo la gelificazione.
Vacuum jar	asperts, Cina	VC8130	Per conservare i microgel sotto vuoto.
Lastre di polimetilmetacrilato (PMMA)	Sunjin Electronics Co., Ltd, Cina		Fogli ordinari in PMMA.
Sistema laser	Rayjet Rayjet, Australia	Rayjet 50 C30	Per incidere fogli di PMMA per formare pozzi.
Pulitore al plasma	Mycro Technologies, USA	PDC-32G	Per rendere il PMMA ifofilo.
Liofilizzatore	Boyikang, Cina	SC21CL	Per liofilizzare i materiali.
Soluzione di tripano blu (0,4%)	Zhongkekeao, Cina	DA0065	Per tingere microgel.
Doxorubicina cloridrato	ENERGY CHEMICAL, Cina	A01E0801360010	Per testare la resistenza ai farmaci delle cellule in microgel 2D o 3D.
Saggio vivo/morto	Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Giappone)	CS01-10	Per distinguere le cellule vive e morte.
Titolo cellulare-Blu	Promega (Wisconsin, USA).	G8080	Per testare la vitalità cellulare.
Filtro cellulare	BD Biosciences, USA	352360	Per raccogliere microgel.
D-luciferina	SYNCHEM (Germania)	s039	Per attaccare le cellule.
Microscopio elettronico a scansione	FEI, USA	Quanta 200	Per caratterizzare la morfologia dei microgel.
Macchina per prove meccaniche	Bose, USA	3230	Per misurare le caratteristiche meccaniche.
Pompa a siringa programmabile	World Precision Instruments, USA	ALADINI 1000	Per testare l'injactability.
Dinamometro digitale	HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., Cina	H-50	Per testare l'inimicizia.
Sistema di sterilizzazione con ossido di etilene	Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC	AN74i	Per sterilizzare microgel con gas di ossido di etilene.
Lettore di micropiastre	Molecular Devices, USA	M5	Per misurare l'intensità della fluorescenza in micro-array.
Microscopio confocale	Nikon, Giappone	A1Rsi	Per osservare la distribuzione cellulare in 3D.
Xenogeno  Sistema di imaging Lumina II	Caliper Life Sciences, USA	IVIS	Per tracciare le cellule negli animali.
Stato di lavoro liquido	Design albicocca, pipetta S USA		Per caricare il mezzo o la sospensione cellulare ad alta velocità.