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Articolo metodologico

Formazione di pellet condensato da cellule staminali pluripotenti indotte dal sangue

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DOI:

10.3791/55988

⸱

19 giugno 2017

 ,  , 
1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Division of Rheumatology, Seoul St. Mary's Hospital, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 2Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary's Hospital, Institute of Medical Science, College of Medicine, The Catholic University of Korea

In questo articolo

Sommario

Qui proponiamo un protocollo di differenziazione condrogenica da cellule staminali pluripotenti indotte da cellule mononucleate del sangue cordonale.

Abstract

La cartilagine articolare umana manca la capacità di ripararsi. La degenerazione di cartilagine viene quindi trattata non da curative ma da trattamenti conservatori. Attualmente si stanno impegnando a rigenerare la cartilagine danneggiata con condrociti espansi ex vivo o cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo (BMSCs). Tuttavia, la restrittività e l'instabilità di queste cellule limitano la loro applicazione nella ricostruzione della cartilagine. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSCs) hanno ricevuto l'attenzione scientifica come una nuova alternativa per le applicazioni rigenerative. Con abilità illimitate di auto-rinnovamento e multipotenza, i hiPSCs sono stati evidenziati come una nuova sorgente di sostituzione cellulare per la riparazione della cartilagine. Tuttavia, l'ottenimento di un'elevata quantità di pellets condizionati di alta qualità è una sfida importante per la loro applicazione clinica. In questo studio abbiamo usato cellule embrionali (EB) derivate per la differenziazione condrogenica. La chondrogenesi di successo è stata confermata da PCRD con blu alcian, toluidina blu e anticorpi contro i tipi di collagene I e II (COL1A1 e COL2A1 rispettivamente). Forniamo un metodo dettagliato per la differenziazione dei iPSC (CBMC-hiPSCs) derivati ​​da cellule mononucleari di sangue del cordone in pellet condondenso.

Introduzione

L'uso di hiPSC rappresenta una nuova strategia per lo screening dei farmaci e studi meccanistici di varie malattie. Da una prospettiva rigenerativa, i hiPSC sono anche una potenziale fonte per la sostituzione di tessuti danneggiati che hanno capacità di guarigione limitata, come la cartilagine articolare 1 , 2 .

La rigenerazione della cartilagine articolare nativa è stata una sfida per diversi decenni. La cartilagine articolare è un morbido tessuto bianco che copre la fine delle ossa, proteggendole dall'attrito. Tuttavia, ha una capacità di rigenerazione limitata quando è danneggiata, rendendo quasi impossibile l'auto-riparazione. Pertanto, la ricerca incentrata sulla rigenerazione della cartilagine è stata in corso per diversi decenni.

In precedenza, la differenziazione in vitro nel linfodondrogeno è stata normalmente eseguita con BMSC o condrociti naturali isolati dall'articolazione del ginocchio 3 . DovutoO il loro potenziale condrogenico, BMSC e condrociti nativi hanno numerosi meriti che sostengono il loro utilizzo nella condogenesi. Tuttavia, a causa della loro limitata espansione e del fenotipo instabile, queste cellule presentano numerose limitazioni nella ricostruzione dei difetti della cartilagine articolare. Sotto le condizioni di coltura in vitro , queste cellule tendono a perdere le proprie caratteristiche dopo 3-4 passaggi, che infine influenzano le loro capacità di differenziazione 4 . Inoltre, nel caso dei condrociti nativi, un danno aggiuntivo per il ginocchio è inevitabile quando si ottiene queste cellule.

A differenza di BMSC o di condrociti nativi, i hiPSCs possono espandersi indefinitamente in vitro . Con le condizioni di coltura adeguate, i hiPSC hanno un grande potenziale come fonte di ricambio per la differenziazione condrogenica. Tuttavia, è impegnativo cambiare le caratteristiche intrinseche di hiPSCs 5 . Inoltre, ci sono diversi complicati in vitro stePs per dirigere il destino di hiPSCs a un tipo specifico di cella. Nonostante queste complicazioni, l'uso di hiPSC è ancora raccomandato a causa delle loro elevate capacità di auto-rinnovamento e della loro capacità di differenziarsi in cellule mirate, compresi i condrociti 6 .

La differenziazione condrogenica è di solito effettuata con sistemi di coltura tridimensionali, come la coltura di pellet o la coltura di micromassi, utilizzando le cellule progenitrici MSC. Se si usa hiPSCs, il protocollo per generare le cellule progenie di MSC è diverso dai protocolli esistenti. Alcuni gruppi usano la cultura monolayer di hiPSC per convertire direttamente il fenotipo in cellule simili a MSC 7 . Tuttavia, la maggior parte degli studi utilizza EB per generare cellule di crescita che assomigliano a MSCs 8 , 9 , 10 , 11 .

Vari tipi di fattori di crescita sono utilizzati per indurre il chondrogeNesis. Di solito, le proteine ​​familiari BMP e TGFβ vengono utilizzate, da soli o in combinazione. La differenziazione è stata anche indotta con altri fattori, come GDF5, FGF2 e IGF1 12 , 13 , 14 , 15 . TGFβ1 è stato dimostrato di stimolare la condogenesi in modo dose-dipendente nei MSC 16 . Rispetto all'altro isotipo, TGFβ3, TGFβ1 induce la condogenesi aumentando la condensazione delle cellule mesenchimali pre-cartilagine. TGFβ3 induce la condogenesi aumentando significativamente la proliferazione cellulare mesenchimale 17 . Tuttavia, TGFβ3 viene utilizzato più frequentemente dai ricercatori di TGFβ1 7 , 10 , 18 , 19 . BMP2 aumenta l'espressione di geni relativi ai componenti della matrice condrogenica nell'uomoCondrociti articolari sotto condizioni in vitro 20 . BMP2 aumenta l'espressione di geni critici alla formazione di cartilagine nei MSC in combinazione con le proteine ​​TGFβ 21 . È stato inoltre dimostrato che BMP2 valorizza sinergicamente l'effetto di TGFβ3 attraverso i percorsi Smad e MAPK 22 .

In questo studio CBMC-hiPSCs sono stati aggregati in EB utilizzando mezzo EB in un piatto di Petri a basso assorbimento. Le cellule di crescita sono state indotte collegando i EB a un piatto rivestito di gelatina. La differenziazione condrogenica usando le cellule di crescita è stata eseguita con la coltura del pellet. Il trattamento con entrambi BMP2 e TGFβ3 ha condensato con successo le cellule e l'accumulo di proteine ​​della matrice extracellulare (ECM) indotta per la formazione di pellet condrogenico. Questo studio suggerisce un semplice ma efficace protocollo di differenziazione dei condensatori usando CBMC-hiPSCs.

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Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dal consiglio di revisione istituzionale dell'Università Cattolica della Corea (KC12TISI0861). I CBMC utilizzati per la riprogrammazione sono stati direttamente ottenuti dalla Banca di Cord Blood del Seoul St. Mary's Hospital.

1. Differenziazione condensata da iPSC

  1. Generazione CBMC-iPSC
    1. Generare CBMC-hiPSC utilizzando il protocollo mostrato nel nostro lavoro precedente 23 .
    2. Raccogliere le cellule del sangue in un tubo conico da 15 ml e contare con un emocitometro.
    3. Preparare 3 x 10 5 cellule e centrifugare per 5 minuti a 515 xg e RT. Scartare il surnatante aspirando e risospendere le cellule in 0,5 ml di mezzo di cellule del sangue.
    4. Trasferire le cellule in un pozzetto di una piastra non verniciata a 24 pozzetti e aggiungere la miscela di virus Sendai, seguendo le raccomandazioni del produttore.
    5. Centrifugare la piastra per 30 minuti a 1.150 xg e 30 ° C.
    6. A poppaCentrifugazione, incubare le cellule durante la notte (O / N) a 37 ° C in 5% CO 2 .
    7. Il giorno successivo, trasferire le cellule trasdotte in un pozzetto rivestito in matrice. Centrifugare la piastra a 1.150 xg per 30 minuti a 30 ° C.
    8. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante, aggiungere 1 mL di mezzo iPSC e mantenere le cellule O / N a 37 ° C in 5% CO 2 .
    9. Mantenere le cellule collegate a 37 ° C e 5% CO 2 . Cambiare il supporto giornaliero, sostituendolo con il nuovo mezzo iPSC.
      NOTA: le colonie appaiono il giorno 14-21 dopo la trasduzione.
  2. Generazione di EB
    1. Mantenere i hiPSC a 37 ° C e 5% CO 2 . Cambiare il supporto giornaliero, sostituendolo con un nuovo supporto Essential 8 (E8).
    2. Preparare 2 x 10 6 hiPSC in un piatto da 100 mm rivestito in vitronectina nel mezzo E8.
    3. Rimuovere il mezzo E8 dal piatto di coltura e lavare con la soluzione salina fosfata tamponata sterile (PBS).
    4. Aggiungi 1Ml di 1 mM di acido etilendiammina-tetraacetico (EDTA) e incubare a 37 ° C e 5% di CO 2 per 2 min.
    5. Raccogliere le cellule con 3 ml di media E8 e trasferirle in un nuovo tubo conico da 15 ml. Centrifugare le cellule a 250 xg a temperatura ambiente (RT) per 2 min.
    6. Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet cellulare e risospendere le cellule in 5 ml di mezzo E8.
    7. Conte le cellule usando un emocitometro e preparare 2 x 10 6 cellule per ogni piatto di Petri da 100 mm. Resuspendere le cellule preparate in una miscela da 10 mL di E8 ed EB (1: 1) con 10 μM inibitore rho-associato chinasi (ROCK).
    8. Incubare le cellule O / N per l'aggregazione a 37 ° C e 5% CO 2 .
    9. Il giorno successivo, raccogliere le EB aggregate pipettando. Centrifugare le cellule a 250 xg per 1 min. Rimuovere il surnatante e riposizionare i EB in 10 ml di mezzo fresco E8.
    10. Ingrandire gli EB generati per 5 giorni, eseguendo le modifiche quotidiane con fresH Medio E8. Per ulteriore maturazione, cambiare il terreno di coltura nel mezzo E7. Mantenere i EB a 37 ° C e 5% di CO 2 per altri 5 giorni, effettuando variazioni giornaliere medi con il mezzo fresco E7.
      NOTA: il medium E7 è il mezzo E8 senza FGF2.
  3. Induzione delle cellule di crescita da EB
    1. Aggiungere 6 ml di gelatina 1% a un piatto da 100 mm e incubare a 37 ° C e 5% di CO 2 per 30 min.
    2. Rimuovere la gelatina e asciugare completamente il piatto per 2-3 ore prima dell'uso.
    3. Trasferire l'EB in un tubo conico da 50 ml. Lasciare che i EB si stabiliscano nella parte inferiore del tubo conico. Rimuovere il surnatante senza disturbare le EB.
    4. Resuspendere i EB in 10 ml di Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) con 20% di siero fetale fetale (FBS). Trasferire le EB al piatto da 100 mm rivestito di gelatina. Aggiungere 10 μM inibitore ROCK.
    5. Incubare e mantenere le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per 7 giorni. Cambi la miaDium ogni altro giorno senza aggiungere inibitore di ROCK.
  4. Formazione di pellet condensato
    1. Aspirare il mezzo di coltura dal piatto e lavare le cellule tre volte con PBS.
    2. Applicare 1 mL di 1 mM EDTA e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 2 min.
    3. Raccogliere le cellule usando 5 ml di DMEM con il 20% di FBS e trasferirle in un nuovo tubo conico da 15 ml.
    4. Centrifugare le cellule per 2 min a 250 xg e RT. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di DMEM con il 20% di FBS.
    5. Filtrare e scartare i cluster di cellule utilizzando un filtro da 40 μm e raccogliere le singole cellule. Conte le singole cellule usando un emocitometro.
    6. Centrifugare le cellule per 2 min a 250 xg e RT. Rimuovere il surnatante e le sementi da 3 x 10 5 cellule per pellet in un tubo conico da 15 ml con 300 μl di mezzo di differenziazione condizionale (CDM).
    7. Per la formazione di pellet, centrifugare le cellule per 5 minuti a680 xg e RT.
      NOTA: I pellets vengono mantenuti in tubi conici da 15 ml durante la differenziazione dei pellet condensatori.
    8. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C e 5% CO 2 .
    9. Modificare il CDM ogni 2-3 giorni. Entro 3 giorni, i pellet esporranno morfologie sferoidali appiattite. Mantenere i pellets per 21 giorni a 37 ° C e 5% CO 2 .

2. Caratterizzazione di pellet condensato mediante colorazione

  1. Incorporazione condrogenica
    1. Prima di incollare, preparare e sciogliere la paraffina a 58 ° C.
    2. Fissare i pellets in 1 ml di 4% di paraformaldeide per 2 ore a RT in un tubo da 1,5 ml.
      Attenzione: la paraformaldeide è altamente tossica. Evitare il contatto con gli occhi, la pelle o le mucose. Ridurre al minimo l'esposizione e evitare l'inalazione durante la preparazione.
    3. Posizionare uno strato di garza sulla cassetta e trasferire i pellet fissi utilizzando una pipetta. Coprire il pellet piegando thE garza e chiudere il coperchio della cassetta.
    4. Avviare la disidratazione in 100 mL di etanolo al 70% (EtOH) due volte, 10 minuti ciascuno. Dehidrate i pellet attraverso lavaggi sequenziali di 10 min in 80% e 95% EtOH.
    5. Trasferire i pellets al 100% EtOH per 10 min. Ripetere tre volte con EtOH fresco.
    6. Per "compensazione", scambiare la soluzione per una miscela di EtOH e xilene da 100 mL, 1: 1, seguita da una miscela 1: 2 di EtOH e xilene per 10 minuti ciascuno. Eliminare il restante EtOH incubando i pellet due volte in 100% xilene, 10 minuti ciascuno.
    7. Per l'infiltrazione di paraffina, incubare i pellet in miscele sequenziali di xilene e paraffine. Eseguire l'intero processo di infiltrazione di paraffina a 58 ° C. Incubare i pellets in 100 ml di una miscela di xilene e paraffina 2: 1 per 30 min.
    8. Scambiare la soluzione per 100 ml di una miscela 1: 1 di xilene e paraffina e incubare per 30 min.
    9. Scambiare la soluzione per 100 ml di miscela 1: 2 di xilene e paraffina e incubare per 30 min.
    10. Per l'infiltrazione finale, trasferire i pellet al primo bagno di 100% paraffina e incubare per 2 ore.
    11. Trasferire i pellet al secondo bagno di 100% paraffina e incubare O / N a 58 ° C.
    12. Il giorno dopo, delicatamente trasferire i pellet in uno stampo con un tweezer. Aggiungere paraffina allo stampo dall'erogatore di paraffina. Rafforzare la paraffina per 30 minuti a 4 ° C.
    13. Fate tagliare le sezioni a 7 μm e trasferire le sezioni sulla slitta. Lasciare che le diapositive si asciugano durante la notte e conservino le diapositive a RT finché non siano pronte per l'uso.
  2. Preparazione di diapositive
    1. Deparaffinare le diapositive spostandole attraverso 100 mL di 100%, 90%, 80% e 70% EtOH in sequenza per 5 minuti ciascuno.
    2. Posizionare le diapositive in un vaso di vetro e sciacquare con acqua del rubinetto per 5 minuti.
  3. Colorazione blu alciana
    1. Incubare le diapositive in 50 ml di soluzione 1% di azoto blu per 30 min.
      NONE: l'azzurro alciano viene diluito in soluzione al 3% di acido acetico. Regolare il pH a 2,5 usando acido acetico.
    2. Posizionare le diapositive in un vaso di vetro e sciacquare con acqua del rubinetto per 2 min.
    3. Sciacquare le diapositive in acqua deionizzata (DW) e contare con soluzione nucleare veloce rapida per 2 min.
    4. Posizionare le diapositive in un vaso di vetro e sciacquare con acqua del rubinetto per 1 minuto.
    5. 2.3.5) Procedere per disidratare e montare le diapositive nella fase 2.6.
  4. Toluidine blu colorazione
    1. Incubare le diapositive in 50 ml di soluzione toluidina blu per 4 min.
    2. Posizionare le diapositive in un vaso di vetro e sciacquare con acqua del rubinetto per 5 minuti.
    3. Procedere per disidratare e montare le diapositive nella fase 2.6.
  5. Colorazione immunohistochemica
    1. Incubare le diapositive in 3% di H 2 O 2 per 15 minuti per bloccare la perossidasi endogena.
    2. Applicare 200 μL di anticorpi primari (anti-COL1A1 e -COL2A1) diluiti 1: 100 in tris-bu(TBS) contenente 1% di albumina bovina serba (BSA) e 5% di siero di capra normale (NGS) alle diapositive e incubare O / N a 4 ° C.
    3. Il giorno dopo, posizionare le diapositive in un vaso di vetro e lavare con 50 ml di TBS contenente 0,1% di polisorbato 20 (TBST) tre volte per 5 minuti ciascuno.
    4. Applicare 200 μL di anticorpi secondari (anticorpi IgG anti-coniglio caprino, diluiti 1: 200 in TBS contenente 1% BSA e 5% NGS) e incubare a RT per 40 min.
    5. Posizionare le diapositive in un vaso di vetro e lavarle tre volte con 50 ml, 5 minuti ciascuno.
    6. Per l'amplificazione del segnale, applicare la soluzione streptavidina coniugata con HRP alle diapositive e incubare per 10 min.
    7. Posizionare le diapositive in un vaso di vetro e lavarle tre volte con 50 ml, 5 minuti ciascuno.
    8. Mescolare la soluzione di substrato DAB-perossidasi, applicare 200 μL di soluzione a ciascuna scivola e incubare per 1 min.
    9. Posizionare le diapositive in un vaso di vetro e sciacquare con acqua del rubinetto per 5 minuti.
    10. di contrastoCon l'ematossilina di Mayer per 1 minuto.
    11. Lavare le diapositive con DW.
    12. Procedere per disidratare e montare le diapositive nella fase 2.6.
  6. Disidratazione e montaggio
    1. Dehidrate le diapositive spostandole sequenzialmente attraverso 100 mL di 70%, 80%, 90% e 100% EtOH, 30 sec ciascuno.
    2. Immergere le diapositive in due cambi di xilene per 1 min ciascuno.
    3. Aggiungere 50 μL di soluzione di montaggio ai coperchi e posizionare le diapositive in alto.

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Risultati

In questo studio, abbiamo generato pellet condensatori da CBMC-hiPSCs indurre cellule outgrowth da EBs. La differenziazione condrogenica è stata indotta usando CBMC-hiPSC con elevata pluripotenza 11 confermata. Uno schema semplice del nostro protocollo è mostrato in Figura 1A . Prima della differenziazione, le colonie iPSC sono state ampliate ( Figura 1B ). IPSC espansi sono stati assemblati come EB per i...

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Discussione

Questo protocollo ha generato hiPSC da CBMC. Abbiamo riprogrammato i CBMC a hiPSC utilizzando un vettore virale Sendai contenente fattori Yamanaka 24 . Tre casi sono stati utilizzati nella differenziazione, e tutti gli esperimenti hanno generato con successo i pellet condrodotti utilizzando questo protocollo. Numerosi studi hanno riportato protocolli per la differenziazione dei hiPSC nei condrociti 25 , 26 , 2...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del progetto R & D di tecnologia della Corea del Sud, Ministero della Sanità, del Welfare & Famiglia, della Repubblica di Corea (HI16C2177).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Plastica
100 mm PiattoTPP93100
Piastra a 6 pozzettiTPP92006
Provetta cornica da 50 mLSPL50050
Provetta cornica da 15 mLSPL50015
Pipetta monouso da 10 mLFalcon7551
5 mL Pipetta monousoFalcon7543
Piastra a 12 pozzettiTPP92012
NomeAziendaNumero di catalogo>Description
E8 Medium Materials
DMEM/F12, HEPESLife Technologies11330-057E8 Medium (500 mL)
Bicarbonato di sodioLife Technologies25080-094E8 Medium (Conc.: 543 μ g/mL)
Selenito di sodioSigma AldrichS5261E8 Medium  (Conc.: 14 ng/mL)
Trasformatore UmanoSigma AldrichT3705E8 Medio (Conc.: 10.7 μ g/mL)
Basic FGF2Peprotech100-18BE8 Medium  (Conc.: 100 ng/mL)
Insulina umanaLife Technologies12585-014E8 Medium (Conc.: 20 μ g/mL)
TGF&beta umano; 1Peprotech100-21E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)
Acido AscorbicoSigma AldrichA8960E8 Medium  (Conc.: 64 μ g/mL)
DPBSLife Technologies14190-144
VitronectinLife TechnologiesA14700
Inibitore ROCKSigma AldrichY0503
Nome<strong>CompanyNumero di catalogoDescription
Controllo di qualità Materiali
18 mm Vetro di coperturaSuperiorHSU-0111580
4% ParaformaldyhydeTech & InnovazioneBPP-9004
Triton X-100BIOSESANG9002-93-1
Siero bovino Albumina vettorialeLabSP-5050
Anticorpo SSEA4MilliporeMAB4304
Anticorpo Anti-Oct4Santa CruzSC9081
Anticorpo TRA-TRA-1-60MilliporeMAB4360
Anticorpo anti-Sox2Biolegend630801
Anticorpo anti-TRA-1-81MilliporeMAB4381
Anticorpo anti-Klf4 Abcamab151733
Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG (H+L) anticorpoSonda molecolareA11029
Alexa Fluor 594 capra anti-coniglio IgG (H+L) anticorpoSonda molecolareA11037
DAPIMolecular ProbeD1306
Reagente antisbiadimento oro prolungatoInvitrogenP36934
4% ParaformaldyhydeTech & InnovazioneBPP-9004
Tween 20BIOSESANGT1027
Siero bovino Albuminavettoriale LabSP-5050
Anti-Collagene II anticorpoabcam ab347121:100
Blu AlcianoSigma AldrichA3157-10G
Verde veloce FCFSigma AldrichF7252-25G
Safranin OSigma Aldrich090m0039v
Nucleare veloce rossoAmericanmastertechSTNFR100 
xileneDuksan115 
EtanoloDuksan64-17-5
soluzione di ematossilina di Mayerwako pure chemical industriesLAK7534
DAPVECTOR LABORATORIESSK-4100
Vetrino scorrevole, rivestitoHyun Il Lab-MateHMA-S9914
TrizolInvitrogen15596-018
CloroformioSigma Aldrich366919
IsoprypylalcoholMillipore109634
EtanoloDuksan64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis KitThermo ScientficK1622
NomeCompanyNumero di catalogo Descrizione
Materiali di differenziazione condrogenica
DMEMLife Technologies11885Componente del terreno condrogenico (500 mL)
Penicilina StreptomicinaLife TechnologiesP4333Componente del mezzo condrogenico (Conc.: 1%)
Acido ascorbicoSigma AldrichA8960Componente condrogenica del terreno (Conc.: 64 μ g/mL) 
Soluzione di aminoacidi non essenziali MEM (100x)Life Technologies11140-050Componente del terreno condrogenico (Conc.: 100 mM)
rhBMP-2R& D355-BM-050Componente del terreno condrogenico (Conc.:100 ng/ml)
Hman ricombinante TGF-beta3R& D243-B3-002Componente del terreno condrogenico (Conc.: 10 ng/ml)
KnockOut Serum ReplacementLife Technologies10828-028Componente del terreno condrogenico (Conc.: 1%)
ITS+ PremixBD354352Componente del terreno condrogenico (Conc.: 1%)
Desametasone-solubile in acqua Sigma AldrichD2915-100MGComponente del terreno condrogenico (Conc.: 10-7 M)
GlutaMAX SupplementLife Technologies35050-061Componente del terreno condrogenico (Conc.: 1%)
Soluzione di piruvato di sodioSigmaAldrich S8636Componente del terreno condrogenico (Conc.: 1%)
L-ProlinaSigma AldrichP5607-25GTerreno condrogenico componente (40 μ g/ml)
La

Riferimenti

  1. van Osch, G. J., et al. Cartilage repair: past and future--lessons for regenerative medicine. J Cell Mol Med. 13 (5), 792-810 (2009).
  2. Ahmed, T. A., Hincke, M. T. Strategies for articular cartilage lesion repair and functional restoration. Tissue Eng Part B Rev. 16 (3), 305-329 (2010).
  3. Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
  4. Solchaga, L. A., Penick, K., Goldberg, V. M., Caplan, A. I., Welter, J. F. Fibroblast growth factor-2 enhances proliferation and delays loss of chondrogenic potential in human adult bone-marrow-derived mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1009-1019 (2010).
  5. Guzzo, R. M., Drissi, H. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Chondrocytes. Methods Mol Biol. 1340, 79-95 (2015).
  6. Drissi, H., Gibson, J. D., Guzzo, R. M., Xu, R. H. Derivation and Chondrogenic Commitment of Human Embryonic Stem Cell-Derived Mesenchymal Progenitors. Methods Mol Biol. 1340, 65-78 (2015).
  7. Nejadnik, H., et al. Improved approach for chondrogenic differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 11 (2), 242-253 (2015).
  8. Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
  9. Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
  10. Ko, J. Y., Kim, K. I., Park, S., Im, G. I. In vitro chondrogenesis and in vivo repair of osteochondral defect with human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (11), 3571-3581 (2014).
  11. Nam, Y., Rim, Y. A., Jung, S. M., Ju, J. H. Cord blood cell-derived iPSCs as a new candidate for chondrogenic differentiation and cartilage regeneration. Stem Cell Res Ther. 8 (1), 16(2017).
  12. Hotten, G. C., et al. Recombinant human growth/differentiation factor 5 stimulates mesenchyme aggregation and chondrogenesis responsible for the skeletal development of limbs. Growth Factors. 13 (1-2), 65-74 (1996).
  13. Murphy, M. K., Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. TGF-beta1, GDF-5, and BMP-2 stimulation induces chondrogenesis in expanded human articular chondrocytes and marrow-derived stromal cells. Stem Cells. 33 (3), 762-773 (2015).
  14. Shintani, N., Siebenrock, K. A., Hunziker, E. B. TGF-ss1 enhances the BMP-2-induced chondrogenesis of bovine synovial explants and arrests downstream differentiation at an early stage of hypertrophy. PLoS One. 8 (1), e53086(2013).
  15. Fukumoto, T., et al. Combined effects of insulin-like growth factor-1 and transforming growth factor-beta1 on periosteal mesenchymal cells during chondrogenesis in vitro. Osteoarthritis Cartilage. 11 (1), 55-64 (2003).
  16. Worster, A. A., Nixon, A. J., Brower-Toland, B. D., Williams, J. Effect of transforming growth factor beta1 on chondrogenic differentiation of cultured equine mesenchymal stem cells. Am J Vet Res. 61 (9), 1003-1010 (2000).
  17. Knippenberg, M., et al. Differential effects of bone morphogenetic protein-2 and transforming growth factor-beta1 on gene expression of collagen-modifying enzymes in human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Tissue Eng Part A. 15 (8), 2213-2225 (2009).
  18. Jang, Y., et al. Centrifugal gravity-induced BMP4 induces chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells via SOX9 upregulation. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 184(2016).
  19. Kang, R., et al. Mesenchymal stem cells derived from human induced pluripotent stem cells retain adequate osteogenicity and chondrogenicity but less adipogenicity. Stem Cell Res Ther. 6, 144(2015).
  20. Tao, H., et al. Biological evaluation of human degenerated nucleus pulposus cells in functionalized self-assembling peptide nanofiber hydrogel scaffold. Tissue Eng Part A. 20 (11-12), 1621-1631 (2014).
  21. Sekiya, I., Larson, B. L., Vuoristo, J. T., Reger, R. L., Prockop, D. J. Comparison of effect of BMP-2, -4, and -6 on in vitro cartilage formation of human adult stem cells from bone marrow stroma. Cell Tissue Res. 320 (2), 269-276 (2005).
  22. Shen, B., Wei, A., Tao, H., Diwan, A. D., Ma, D. D. BMP-2 enhances TGF-beta3-mediated chondrogenic differentiation of human bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells in alginate bead culture. Tissue Eng Part A. 15 (6), 1311-1320 (2009).
  23. Rim, Y. A., Nam, Y., Ju, J. H. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J Vis Exp. (118), (2016).
  24. Kim, Y., et al. The Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Blood Cells: An Efficient Protocol Using Serial Plating of Reprogrammed Cells by Centrifugation. Stem Cells Int. 2016, 1329459(2016).
  25. Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
  26. Toh, W. S., et al. Differentiation and enrichment of expandable chondrogenic cells from human embryonic stem cells in vitro. J Cell Mol Med. 13 (9B), 3570-3590 (2009).
  27. Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. Derivation of chondrogenically-committed cells from human embryonic cells for cartilage tissue regeneration. PLoS One. 3 (6), e2498(2008).
  28. Nakagawa, T., Lee, S. Y., Reddi, A. H. Induction of chondrogenesis from human embryonic stem cells without embryoid body formation by bone morphogenetic protein 7 and transforming growth factor beta1. Arthritis Rheum. 60 (12), 3686-3692 (2009).
  29. Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
  30. Rim, Y. A., Park, N., Nam, Y., Ju, J. H. Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients. J Vis Exp. (116), (2016).
  31. Pfaff, N., et al. Efficient hematopoietic redifferentiation of induced pluripotent stem cells derived from primitive murine bone marrow cells. Stem Cells Dev. 21 (5), 689-701 (2012).
  32. Xu, H., et al. Highly efficient derivation of ventricular cardiomyocytes from induced pluripotent stem cells with a distinct epigenetic signature. Cell Res. 22 (1), 142-154 (2012).
  33. Lee, S. B., et al. Contribution of hepatic lineage stage-specific donor memory to the differential potential of induced mouse pluripotent stem cells. Stem Cells. 30 (5), 997-1007 (2012).
  34. Hu, S., et al. Effects of cellular origin on differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells. JCI Insight. 1 (8), 1-12 (2016).
  35. Vonk, L. A., de Windt, T. S., Slaper-Cortenbach, I. C., Saris, D. B. Autologous, allogeneic, induced pluripotent stem cell or a combination stem cell therapy? Where are we headed in cartilage repair and why: a concise review. Stem Cell Res Ther. 6 (94), 1-11 (2015).
  36. Gomez-Leduc, T., et al. Chondrogenic commitment of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in collagen matrices for cartilage engineering. Sci Rep. 6, 32786(2016).
  37. Mareschi, K., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells: bone marrow versus umbilical cord blood. Haematologica. 86 (10), 1099-1100 (2001).
  38. Wexler, S. A., et al. Adult bone marrow is a rich source of human mesenchymal 'stem' cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. Br J Haematol. 121 (2), 368-374 (2003).
  39. Zhang, X., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood: reevaluation of critical factors for successful isolation and high ability to proliferate and differentiate to chondrocytes as compared to mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose tissue. J Cell Biochem. 112 (4), 1206-1218 (2011).
  40. Wagner, W., et al. Replicative senescence of mesenchymal stem cells: a continuous and organized process. PLoS One. 3 (5), e2213(2008).
  41. Tarte, K., et al. Clinical-grade production of human mesenchymal stromal cells: occurrence of aneuploidy without transformation. Blood. 115 (8), 1549-1553 (2010).
  42. Chen, W. C., et al. Prediction of poor survival by cyclooxygenase-2 in patients with T4 nasopharyngeal cancer treated by radiation therapy: clinical and in vitro studies. Head Neck. 27 (6), 503-512 (2005).
  43. Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).

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