Articolo metodologico

Metodi e consigli per la somministrazione endovenosa di Virus Adeno-associato ai ratti e valutazione di trasduzione del sistema nervoso centrale

DOI:

10.3791/55994

⸱

25 agosto 2017

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1Department of Pharmacology, Toxicology, and Neuroscience, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Department of Molecular & Integrative Physiology, University of Kansas Medical Center

In questo articolo

Sommario

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Metodi per una consegna del gene su larga scala del sistema nervoso centrale nel ratto sono coperti. In questo esempio, lo scopo è quello di imitare una malattia che colpisce l'intero midollo spinale. La trasduzione diffusa può essere utilizzata per fornire una proteina terapeutica al SNC da un'amministrazione periferica, una tantum.

Abstract

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Vettori di virus adeno-associato (AAV) sono un reagente chiave nelle neuroscienze per cluster regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR), optogenetica, cre-lox targeting, ecc. Lo scopo di questo manoscritto è di aiutare l'investigatore tentativo di trasferimento del gene espansiva del sistema nervoso centrale (SNC) nel ratto tramite iniezione della vena della coda di AAV. Espressione su vasta scala è rilevante per le condizioni con patologia diffusa, e un modello del ratto è significativo a causa della sua maggiore dimensione e fisiologiche somiglianze agli esseri umani rispetto ai topi. In questa applicazione di esempio, una trasduzione neuronale su vasta scala è usato per simulare una malattia neurodegenerativa che colpisce l'intero midollo spinale, sclerosi laterale amiotrofica (ALS). La trasduzione di CNS su vasta scala efficiente consente anche di fornire fattori di proteine terapeutiche in studi pre-clinici. Dopo un intervallo di espressione post-iniezione di parecchie settimane, vengono valutati gli effetti di trasduzione. Per un vettore di controllo della proteina fluorescente verde (GFP), l'importo di GFP nel cervelletto è stimato rapidamente e in modo affidabile da un programma di formazione immagine base. Per fenotipi di malattia motore che sono indotte da ALS relativi transactive risposta della proteina del DNA-proteina di kDa 43 (TDP-43), i deficit sono segnati da rotarod e riflesso di fuga. Oltre alla modellazione di malattia e terapia genica, ci sono diverse applicazioni potenziali per la larga scala gene-targeting descritto qui. L'uso esteso di questo metodo sarà di aiuto nel velocizzare in neuroscienze e Neurogenetica di verifica delle ipotesi.

Introduzione

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Vettori ricombinanti virus adeno-associato (AAV) sono strumenti indispensabili per la ricerca di CNS perché sono così efficienti per trasdurre i neuroni in vivo. I vettori AAV sono molto versatili per studiare diversi transgeni e isoforme della proteina, diversi tessuti, ospitano diverse specie e diverse vie di somministrazione. Per esempio, AAV può essere somministrato a topi di una periferica, relativamente non-invasiva, l'iniezione endovenosa di trasdurre neuroni in tutto il sistema nervoso centrale come in primo luogo descritto in Foust et al e Duque et al. (vedere Giove carta da Gombash et al. (2014)). 1 , 2 , 3 questo approccio di consegna del gene viene utilizzato nei ratti per esprimere in modo efficiente una proteina fluorescente verde (GFP) o l'ALS ha collegato la proteina, transactive risposta DNA-proteina di kDa 43 (TDP-43) nel SNC. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 lavorando in ratti è significativo perché i parametri fisiologici e metabolici del ratto sono più vicini agli esseri umani rispetto ai topi e ci sono le analisi tossicologiche e comportamentali progettate specificamente per i ratti. Inoltre, altre linee di ratto transgenico stanno diventando disponibili che possono essere utilizzati in studi di trasferimento del gene AAV.

Metodi sono dettagliate per il trasferimento del gene CNS espansiva nel ratto e quantificazione rapida, affidabile dei risultati. Trasduzione CNS su vasta scala è usato per imitare la sintomatologia di ALS in ratti esprimendo TDP-43 in tutto il midollo spinale. Il metodo è coda vena iniezioni di TDP-43 vector per giovani ratti adulti come usato in Jackson et al. 6 , 8 , 9 dopo diverse settimane, i deficit del motore indotta da TDP-43 sono segnati con due metodi: fuga reflex e rotarod come usato in Dayton et al e Jackson et al. 5 , 6 , 7 , 9 per il vettore GFP di controllo, nelle analisi post-mortem, zona fluorescente del cervelletto è calcolata come un indice di efficienza di trasduzione come usato in Jackson et al. 6 , 8 l'analisi del cervelletto ha dimostrato di essere un indice rapido e affidabile del grado di trasduzione CNS dopo la consegna del gene periferico e dovrebbe essere applicabile a una varietà di approcci di tentare di trasferimento genico centro-periferico.

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Protocollo

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tutte le procedure seguite le opportune linee guida NIH. Tutte le procedure di seguito protocolli degli animali che sono stati approvati dal comitato di utilizzo LSU Health Sciences Center a Shreveport e cura degli animali. Ratti Sprague-Dawley femminili a 6 settimane dell'età sono stati utilizzati per questa procedura.

1. determinare le dosi/volumi del vettore necessaria

  1. pesare i ratti per essere iniettato e determinare la quantità di vettore virale necessari per ogni animale basati sul titolo (concentrazione) della preparazione vettoriale. Utilizzare dosi di vettore che hanno avuto successo per efficiente espressione nel ratto CNS in precedenza (vedere Jackson et al. 6).
    Nota: per AAV9 TDP-43 o AAV9 GFP, una dose tipica è tra 3 x 10 13 - 1x10 14 vettoriale genomi/kg. I giovani ratti adulti a 6 settimane dell'età pesano circa 150 g.
  2. Fare dosi equivalenti / kg in tutti gli animali per sistematici raffronti. Assicurarsi che il volume non superi volumi di iniezione standard consigliato (250-500 µ l per un ratto di 250 g). Un volume di iniezione tipica è 200 μl di un ratto adulto giovane.

2. Preparare la postazione di lavoro

  1. raccogliere tutte le necessarie forniture: un film di paraffina quadrato (circa 5 x 5 cm) per animale, un batuffolo di preparazione per animale, compresse di garza (2-3 per animale), dispensare consigli e una micropipetta.
  2. Preparare la superficie di lavoro di pulizia della superficie con etanolo al 70%. Posizionare un rilievo di riscaldamento verso il basso con la temperatura impostata su bassa (~ 37 ° C). Posizionare un cuscinetto di banco sopra il termocuscino.
  3. Preparare l'anestesia di gas (isoflurano). Garantire sufficiente ossigeno e gas anestesia per la procedura. Pulire la maschera di anestesia e camera di induzione con etanolo al 70% e collocare la maschera di anestesia sul tappetino di panca.

3. Preparare il vettore

  1. scongelare il vettore a temperatura ambiente ed etichettare una microcentrifuga sterile per ciascun animale.
  2. Dispensare il volume di AAV determinato nel passaggio 1.1 nel tubo appropriato e portare il volume a volume iniezione desiderato (qui, 200 μl) con Ringer lattato ' s soluzione o soluzione fisiologica.
  3. Impulsi Vortexare il campione per 1-2 s e quindi di impulso Centrifugare per 5 s per portare il campione alla parte inferiore del tubo.
  4. Dispensare il volume totale iniettato per il ratto fuori dal tubo e sulla Piazza della pellicola di paraffina.
  5. Inserire un ago da 30 gauge su una siringa da 1 mL.
  6. Inserire l'ago con lo smusso rivolto verso il basso nel vettore sulla pellicola di paraffina. Tirare indietro lo stantuffo della siringa fino a quando tutti i virus è nell'ago e la siringa. Fare attenzione a evitare bolle d'aria di disegno nell'ago, che diventa più facile con pratica.

4. Preparare il ratto

  1. girare l'ossigeno fino a 1 L/min e impostare l'anestesia di isoflurane al 5%. Garantire che l'anestesia di gas fluisce nella camera di induzione di controllando tutti i tubi di collegamento e rubinetto orientamenti.
  2. Mettere il ratto nella camera a gas anestesia induzione circa 3 min, fino a quando il ratto è insensibile.
  3. Garantire adeguata profondità dell'anestesia pizzicando la punta. Non ci dovrebbe essere alcun movimento del piede o la gamba dopo il pizzico di toe.
  4. Ridurre l'anestesia di isoflurane al 2% per il mantenimento dell'anestesia e regolare il rubinetto in modo che l'anestesia sta fluendo alla maschera anestesia.
  5. Posto il ratto ' s naso nella maschera di anestesia e regolare il ratto, in modo che è sdraiato su un lato.
  6. Identificare la vena caudale laterale.
    Nota: Le vene di coda laterale si trovano a circa 10 e 2 o ' orologio con parte superiore dorsale della coda come 12 o ' orologio. Con il topo sdraiato su un lato, la vena caudale laterale deve essere rivolto verso up.
  7. Pulire la zona di iniezione con il rilievo della preparazione dell'alcool. Il sito di iniezione è due terzi giù la lunghezza della coda.

5. Iniettare il vettore

  1. fermamente tenere la coda leggermente sopra l'area di iniezione con un dito direttamente sopra la vena caudale laterale; questo sarà dilatare la vena.
  2. Con lo smusso rivolto verso l'alto, allineare l'ago con la vena di coda visibile nella stessa direzione.
  3. Bucare la pelle sopra la vena della coda mentre facendo grande attenzione a evitare l'altra mano tenendo la coda e premendo sulla vena caudale.
  4. Scaricare la pressione dalla vena caudale per consentire il flusso sanguigno normale.
  5. Spostare l'ago nella vena. Per assicurarsi che l'ago ha perforato la vena caudale, tirare leggermente indietro lo stantuffo. Se l'ago è in vena, il sangue scorrerà nell'ago.
    1. Riposizionare l'ago come necessario. Quindi, per stabilizzare l'ago, spostare la mano sopra il sito di iniezione per sotto il sito di iniezione e tenere l'estremità della siringa contro la coda.
  6. Iniettare lentamente il vettore nella coda (circa 20 µ l/s).
    Nota: La vena può perdere il colore come il vettore scorre attraverso di essa. I segni che la soluzione è stata iniettata di fuori della vena includono blebbing, sbiancamento della pelle, o resistenza quando si inietta il vettore. Con la pratica, può essere minimizzato l'esposizione extravascolare.
  7. Dopo che il vettore è stato somministrato, rimuovere l'ago dal ratto e premere un tampone di garza contro il sito di iniezione per contribuire ad arginare l'emorragia per 30-60 s.

6. Pulizia

  1. spegnere l'isoflurano anestesia e ossigeno. Monitorare il ratto fino a quando riprende conoscenza e poi restituirlo alla sua gabbia.
  2. Posto con attenzione tutti gli aghi nell'apposito contenitore. Smaltire tutti i altri materiali usa e getta che sono potenzialmente contaminati con AAV in un contenitore appropriato biohazard. Pulire le stazioni di lavoro con etanolo al 70%.

7. Valutare il riflesso di fuga del hindlimb

Nota: i deficit Hindlimb presentano solitamente 2-6 settimane dopo il trasferimento del gene di TDP-43, a seconda della dose di vettore.

  1. Su una superficie piana libera da detriti, con due dita afferra il ratto ' s coda di circa 2 cm dal corpo. Sollevare delicatamente il ratto fino a quando gli arti anteriori sono appesi durante la visualizzazione lato ventrale del ratto.
    1. Eseguire la procedura settimanale durante tutto il tempo-corso sperimentale dopo trasferimento genico (ad es., fino a 12 settimane dopo il trasferimento del gene).
      Nota: Punteggio ottenuto anche i deficit degli arti anteriori in questo modo, ma i deficit hindlimb sono più probabile che si verificano in questo modello, a seconda della dose di vettore utilizzato.
  2. Osservare le zampe posteriori per 10 s. Nota Se uno o entrambi posteriori stringono verso la linea mediana durante il 10 s.
  3. Ripetere questo test per un totale di tre volte con 30 s tra le prove. Se uno o entrambi posteriori sono serrati per ciascuna delle tre prove, il ratto sta mostrando la disfunzione del motore. Registrare i dati (manualmente nelle note) come entrambi deficit unilaterale o bilaterale hindlimb presenti se c'è coerente stringendo attraverso tutte le tre prove.

8. Valutare la funzione motoria sul rotarod

  1. per impostare il rotarod, posizionare un cuscinetto di banco sotto il rotarod e impostare accelerazione su 4-40 giri al minuto (rpm) in 2 minuti (il tasso aumenta di ~0.3 giri/s). Per un tempo-corso di 12 settimane, eseguire i soggetti a 2, 4, 8 e 12 settimane dopo gene transfer.
  2. Consentire il ratto di acclimatare per la sala di collaudo per 20 min.
  3. Addestrare il topo a utilizzare il rotarod per la prima volta, prima di avviare il rotarod ad una velocità impostata di 4 giri/min, poi appoggiate il ratto il rotarod. Consentono il topo a camminare per un giro completo a 4 giri, poi avviare l'accelerazione e consentono il topo a calpestare il rotarod finché non cade fuori. Continuare la formazione fino a quando il ratto può camminare costantemente per almeno 40 s. Un ratto adulto sano, giovane sarà prontamente addestrato in questo modo.
    1. Nel caso di un topo con un evidente danno del motore, che può impedire il ratto dal raggiungimento di una latenza di linea di base alla caduta di 40 s, fornire il ratto 3-5 tentativi di formazione prima di iniziare a segnare rotarod.
  4. Per iniziare il rotarod test, appoggiate il ratto il rotarod e avviare accelerazione del rotarod. Nota la data in cui il ratto cade dal rotarod; Questa è la latenza a cadere. Se il topo rimane il rotarod dopo 120 s, cap la sessione a questo punto, rimuovere il ratto dal rotarod e registrare una latenza di caduta di 120 s.
  5. Ripetere il test due volte per un totale di tre prove. Per ridurre al minimo l'effetto di affaticamento, spazio le prove almeno 5 min apart. Media i punteggi delle tre prove. Un ratto adulto unimpaired in genere ha una latenza media di cadere di > 40 s.
  6. Inserire il topo nella gabbia e pulire il rotarod e zone circostanti con etanolo al 70%.

9. Quantificazione dell'espressione di GFP nel cervelletto

  1. anestetizzare i ratti e irrorare con tampone fosfato salino (PBS) e poi con paraformaldeide al 4%. Sezionare il cervello e il midollo spinale e immergere i tessuti nel fissativo durante la notte e quindi spostarli in una soluzione di saccarosio 30%. Dopo l'equilibratura, tagliare 50 μm sezioni coronali su un microtomo scorrevole con congelamento fase 4 , 5 , 6.
  2. Scegliere le sezioni di 3-6 del cervelletto che sono distribuiti uniformemente nei vermis, il lobo centrale del cervelletto. Etichetta fluorescente GFP per massimizzare il segnale. Utilizzare l'anticorpo primario per GFP a 1: 500 e utilizzare l'anticorpo secondario coniugato di Alexa-488 a una diluizione di 1: 300 4 , 5 , 6.
    Nota: Vedi riferimenti 4 , 5 , 6 per maggiori dettagli sul campionamento, sezionamento e le procedure di colorazione.
  3. Photomicrograph ogni sezione della regione definiti di interesse con una lente di ingrandimento basso usando un microscopio. Uso un obiettivo X 2.5 (N.A. 0.12) e filtro impostato 10, eccitazione 450-490/515-565/emissione). Mantenere le impostazioni della fotocamera (i tempi di esposizione, per esempio, 2 s) lo stesso attraverso campioni da analizzare. Salvare come un. File TIF.
  4. Aprire la microfotografia nel programma di immagine Scion ampiamente disponibile; due finestre si apriranno. Chiudi la finestra indicata come " scala di colore ".
  5. Scegli " opzioni ", poi " densità SliceŔ una gamma di tonalità sarà indicata in rosso sulla finestra di look-up Table (LUT). Nella finestra, utilizzare il cursore per riempire la GFP un'etichettatura specifica solo e fermarsi quando il fondo comincia a essere prelevati nell'immagine.
    Nota: Questo metterà in evidenza l'area fluorescente sul Fotomicrografo da quantificare. Le impostazioni dovrebbero essere ottimizzate per acquisire specificamente tutte le cellule visibilmente fluorescente. Con la pratica, questo metodo può proprio evidenziare la fluorescenza specifica.
  6. Prima fluorescente area di misurazione, prima assicurarsi che le misurazioni effettuate sono espressi nelle unità corrette (pixel). Per effettuare questa operazione, fare clic su " Analyze ", poi " Set ScaleŔ la quarta riga dovrebbe dire " unità ". Dall'elenco a discesa, scegliere pixel misura in pixel, quindi fare clic su " OK ". Attivare o disattivare le opzioni di analisi di " includono fori interni " per garantire l'inclusione di tutto il corpo delle cellule nell'analisi.
    7. Fare clic
  7. di misurare l'area fluorescente, " analizza " e quindi fare clic su " misura ". Per visualizzare questo valore, fare clic " Analyze " quindi fare clic su " ResultsŔ Show verrà visualizzata una finestra di risultati. La misura di superficie fluorescente sarà sotto l'intestazione con l'etichetta " zona ".
  8. Per garantire la standardizzazione attraverso le misurazioni, non modificare i valori evidenziati nella finestra LUT.
  9. Una volta che tutte le misurazioni sono state registrate, media dei valori per ciascun animale (da 3-6 sezioni per animale). Utilizzare un appropriato test statistico per confrontare le aree trasdotte fra i gruppi. 6

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Risultati

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TDP-43 motorie indotte dovrebbero sorgere entro 2-6 settimane a seconda della dose dell'AAV TDP-43 utilizzato (Figura 1). Iniezioni di vena infruttuoso coda si tradurrà in parziale o nessuna disabilità; l'AAV deve raggiungere il flusso sanguigno per produrre l'effetto. Un'iniezione di successo di AAV GFP si tradurrà nell'espressione di GFP in tutto il cervello e il midollo spinale in modo vettoriale-dose dipendente. Quando si utilizza il promotore ricombinant...

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Discussione

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Una varietà di percorsi di consegna sono stati testati per i vettori di AAV: intra-parenchimali, intra-intracerebroventricolare, intra-tecale, endovenosa, intranasale, intra-muscolare, ecc. Ogni itinerario può avere vantaggi specifici, così come gli svantaggi. Amministrazione di coda vena di AAV ai ratti adulti è un metodo affidabile per la realizzazione coerente trasduzione dello SNC. Il metodo di iniezione periferica evita l'introduzione di una cannula di iniezione nei tessuti CNS e pertanto è come minimo dilagante. L'...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato da ALS Association, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx e una donazione di beneficenza per la ricerca sulla SLA da Thomas Lawson, per cui siamo grati. Ringraziamo Elysse Orchard e Donna Burney per consulenza e formazione. JAS è stata sostenuta dalla Fondazione ha mentito e National Institutes of Health concedere GM103418.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
BilanciaPelouzeSP5
Nalgene secchioThermo Scientific120140004000 mL
USA Scientific1615-5500
Soluzione di ringer lattatoBaxter Healthcare0338-0114-04
Mini vortexerFisher Scientific128101
CentrifugaEppendorf22624415
Pellicola da laboratorioBemisPM996
SiringaBD309626Viene fornita con un ago da 25 g attaccato.
Sostituire con ago da 27-30 g per iniezione
Ago da 30 gBD305106
IsofluranoPiramal Healthcare66794-013-25Isoflurano USP 250 ml
Maschera per anestesiaKopf Instruments906
GarzaHenry Schein100-25242" x 2" (5 cm x 5 cm)
Punte per pipetteUSA Scientific1111-0816
MicropipettaGilson4642080
Vaporizzatore per anestesia a gasSurgiVet4214322Classic T3
Scavenger per anestesia a gasSurgiVet32373B10Enviro-PURE
TermoforoSears17280
Tappetino da bancoVWR56617-006
RotarodPanlab/Harvard Apparatus76-07724 ratti/ 4 topi
70% EtanoloDecon Laboratories, Inc.2401140 proof
70% IsopropanoloVWR89108-160
Scion Image ScionCorporation
GFP Tag Anticorpo policlonaleInvitrogenA11122Anticorpo primario - diluizione 1:500
AlexaFluor 488InvitrogenA11070Anticorpo secondario - diluizione 1:300
Axioskop 40 microscopioZeiss
Provetta per microcentrifuga da

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).
  2. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).
  3. Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037(2014).
  4. Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18 (12), 2064-2074 (2010).
  5. Dayton, R., et al. Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis. Mol. Ther. 21 (7), 1324-1334 (2013).
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  8. Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B. Front. Mol. Neurosci. 9, 116(2016).
  9. Jackson, K., et al. Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats. BMC Neuroscience. 17 (1), 69(2016).
  10. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12 (5), 563-573 (2001).
  11. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. Gene vector "magic bullet": targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter. Expert Opin Ther Targets. 20 (10), 1153-1154 (2016).
  12. van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. Gas embolism: pathophysiology and treatment. Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23 (5), 237-246 (2003).

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