Metodi e consigli per la somministrazione endovenosa di Virus Adeno-associato ai ratti e valutazione di trasduzione del sistema nervoso centrale

Sommario

Metodi per una consegna del gene su larga scala del sistema nervoso centrale nel ratto sono coperti. In questo esempio, lo scopo è quello di imitare una malattia che colpisce l'intero midollo spinale. La trasduzione diffusa può essere utilizzata per fornire una proteina terapeutica al SNC da un'amministrazione periferica, una tantum.

Abstract

Vettori di virus adeno-associato (AAV) sono un reagente chiave nelle neuroscienze per cluster regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR), optogenetica, cre-lox targeting, ecc. Lo scopo di questo manoscritto è di aiutare l'investigatore tentativo di trasferimento del gene espansiva del sistema nervoso centrale (SNC) nel ratto tramite iniezione della vena della coda di AAV. Espressione su vasta scala è rilevante per le condizioni con patologia diffusa, e un modello del ratto è significativo a causa della sua maggiore dimensione e fisiologiche somiglianze agli esseri umani rispetto ai topi. In questa applicazione di esempio, una trasduzione neuronale su vasta scala è usato per simulare una malattia neurodegenerativa che colpisce l'intero midollo spinale, sclerosi laterale amiotrofica (ALS). La trasduzione di CNS su vasta scala efficiente consente anche di fornire fattori di proteine terapeutiche in studi pre-clinici. Dopo un intervallo di espressione post-iniezione di parecchie settimane, vengono valutati gli effetti di trasduzione. Per un vettore di controllo della proteina fluorescente verde (GFP), l'importo di GFP nel cervelletto è stimato rapidamente e in modo affidabile da un programma di formazione immagine base. Per fenotipi di malattia motore che sono indotte da ALS relativi transactive risposta della proteina del DNA-proteina di kDa 43 (TDP-43), i deficit sono segnati da rotarod e riflesso di fuga. Oltre alla modellazione di malattia e terapia genica, ci sono diverse applicazioni potenziali per la larga scala gene-targeting descritto qui. L'uso esteso di questo metodo sarà di aiuto nel velocizzare in neuroscienze e Neurogenetica di verifica delle ipotesi.

Introduzione

Vettori ricombinanti virus adeno-associato (AAV) sono strumenti indispensabili per la ricerca di CNS perché sono così efficienti per trasdurre i neuroni in vivo. I vettori AAV sono molto versatili per studiare diversi transgeni e isoforme della proteina, diversi tessuti, ospitano diverse specie e diverse vie di somministrazione. Per esempio, AAV può essere somministrato a topi di una periferica, relativamente non-invasiva, l'iniezione endovenosa di trasdurre neuroni in tutto il sistema nervoso centrale come in primo luogo descritto in Foust et al e Duque et al. (vedere Giove carta da Gombash et al. (2014)). ^{1 ,}

Protocollo

tutte le procedure seguite le opportune linee guida NIH. Tutte le procedure di seguito protocolli degli animali che sono stati approvati dal comitato di utilizzo LSU Health Sciences Center a Shreveport e cura degli animali. Ratti Sprague-Dawley femminili a 6 settimane dell'età sono stati utilizzati per questa procedura.

1. determinare le dosi/volumi del vettore necessaria

1. pesare i ratti per essere iniettato e determinare la quantità di vettore virale necessari per ogni animale basati sul titolo (concentrazione) della preparazione vettoriale. Utilizzare dosi di vettore che hanno avuto successo per efficiente espressione nel ratto....

Risultati

TDP-43 motorie indotte dovrebbero sorgere entro 2-6 settimane a seconda della dose dell'AAV TDP-43 utilizzato (Figura 1). Iniezioni di vena infruttuoso coda si tradurrà in parziale o nessuna disabilità; l'AAV deve raggiungere il flusso sanguigno per produrre l'effetto. Un'iniezione di successo di AAV GFP si tradurrà nell'espressione di GFP in tutto il cervello e il midollo spinale in modo vettoriale-dose dipendente. Quando si utilizza il promotore ricombinant.......

Discussione

Una varietà di percorsi di consegna sono stati testati per i vettori di AAV: intra-parenchimali, intra-intracerebroventricolare, intra-tecale, endovenosa, intranasale, intra-muscolare, ecc. Ogni itinerario può avere vantaggi specifici, così come gli svantaggi. Amministrazione di coda vena di AAV ai ratti adulti è un metodo affidabile per la realizzazione coerente trasduzione dello SNC. Il metodo di iniezione periferica evita l'introduzione di una cannula di iniezione nei tessuti CNS e pertanto è come minimo dilagante. L'.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bilancia	Pelouze	SP5
Nalgene secchio	Thermo Scientific	12014000	4000 mL
	USA Scientific	1615-5500
Soluzione di ringer lattato	Baxter Healthcare	0338-0114-04
Mini vortexer	Fisher Scientific	128101
Centrifuga	Eppendorf	22624415
Pellicola da laboratorio	Bemis	PM996
Siringa	BD	309626	Viene fornita con un ago da 25 g attaccato. Sostituire con ago da 27-30 g per iniezione
Ago da 30 g	BD	305106
Isoflurano	Piramal Healthcare	66794-013-25	Isoflurano USP 250 ml
Maschera per anestesia	Kopf Instruments	906
Garza	Henry Schein	100-2524	2" x 2" (5 cm x 5 cm)
Punte per pipette	USA Scientific	1111-0816
Micropipetta	Gilson	4642080
Vaporizzatore per anestesia a gas	SurgiVet	4214322	Classic T3
Scavenger per anestesia a gas	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
Termoforo	Sears	17280
Tappetino da banco	VWR	56617-006
Rotarod	Panlab/Harvard Apparatus	76-0772	4 ratti/ 4 topi
70% Etanolo	Decon Laboratories, Inc.	2401	140 proof
70% Isopropanolo	VWR	89108-160
Scion Image Scion	Corporation
GFP Tag Anticorpo policlonale	Invitrogen	A11122	Anticorpo primario - diluizione 1:500
AlexaFluor 488	Invitrogen	A11070	Anticorpo secondario - diluizione 1:300
Axioskop 40 microscopio	Zeiss

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