Defensine pianta gioca un ruolo importante nella difesa delle piante contro gli agenti patogeni. Per un uso efficace di questi peptidi antimicotici come agenti antifungini, comprendere le loro modalità di azione (MOA) è critico. Qui, è descritto un metodo di imaging di cellule vive per studiare aspetti critici di MOA di questi peptidi.
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Articolo metodologico
Imaging di cellule vive di cellule fungine per studiare modalità di entrata e localizzazione subcellulare delle defensine antifungino pianta
In questo articolo
Sommario
Abstract
Piccoli ricche di cisteina defensine sono uno dei più grandi gruppi di peptidi di difesa ospite presente in tutte le piante. Molti pianta defensine esibiscono potente in vitro attività antifungina contro un ampio spettro di patogeni fungini e pertanto hanno il potenziale per essere utilizzati come agenti antifungini in coltivazioni transgeniche. Al fine di sfruttare appieno il potenziale delle defensine impianto per controllo di malattie, è fondamentale per chiarire i loro meccanismi di azione (MOA). Con l'avvento delle tecniche di microscopia avanzata, formazione immagine della vivere-cella è diventato un potente strumento per comprendere le dinamiche di MOA antifungina della pianta defensine. Qui, un metodo di imaging microscopia confocale basato su cellule vive è descritti tramite due pianta fluorescente contrassegnati defensine (MtDef4 e MtDef5) in combinazione con le tinture fluorescenti vitale. Questa tecnica consente la visualizzazione in tempo reale e analisi degli eventi dinamici dell'internalizzazione di MtDef4 e MtDef5 nelle cellule fungine. D'importanza, questo test genera una ricchezza di informazioni, compresa interiorizzazione cinetica, modalità di entrata e localizzazione subcellulare di questi peptidi. Insieme ad altri strumenti biologici delle cellule, questi metodi hanno fornito approfondimenti critici la dinamica e la complessità di MOA di questi peptidi. Questi strumenti è utilizzabile anche per confrontare il MOA di questi peptidi contro funghi differenti.
Introduzione
Le piante hanno sviluppato un sofisticato sistema immunitario innato per difesa contro agenti patogeni microbici pianta1. Essi esprimono numerosi peptidi di difesa ospite codificato dal gene con attività antimicrobica presunta2. Infatti, molti di questi peptidi visualizzare attività antimicrobica in vitro3. Defensine costituiscono uno dei più grandi gruppi di peptidi di difesa ospite in pianta Unito4. Questi peptidi ricchi di cisteina, cationici presentano attività inibitoria della crescita potente contro fungine e Oomycota patogeni alle concentrazioni micromolar e....
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Protocollo
1. etichettatura delle defensine con fluorofori
- Selezionare un fluoroforo che ha minimo effetto sulla proprietà antimicrobiche, nonché l'assorbimento e la localizzazione delle defensine all'interno della cellula vivente.
Nota: Selezionando il fluoroforo ottima dipende da specifici obiettivi sperimentali. Le proprietà spettrali e chimica, fotostabilità, dimensioni e carica del fluoroforo dovrebbe anche essere considerate. - Etichetta defensine con il fluoroforo selezionato utilizzando un peptide appropriato etichettatura kit disponibili dai fornitori commerciali. In alternativa, di sintetizzare chimicamente fluoroforo defensine. In questo studio,....
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Risultati
Live imaging cellulare è stato effettuato per monitorare e confrontare l'internalizzazione e la localizzazione subcellulare delle due defensine, MtDef4 e MtDef5, da Medicago truncatula; in cellule fungine. TMR-MtDef4 è stato sintetizzato chimicamente mentre MtDef5 fu etichettata con Dylight550 (Dylight550-MtDef5). Conidi sono state incubate con entrambi defensine in combinazione con la tintura di membrana selettiva FM4-64. La figura 1 Mostra che TMR-.......
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Discussione
In questo studio, una metodologia di imaging affidabile cellule vive con l'uso delle defensine antifungine fluorescente identificate è stato descritta per studiare la cinetica di interiorizzazione di questi peptidi in cellule fungine e per determinare i loro obiettivi sottocellulari. Questo metodo è un potente strumento per visualizzare le dinamiche dell'interazione tra cellule fungine e defensine temporalmente e spazialmente.
Vari metodi sono stati usati per studiare l'internalizzazione e la .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Si ringraziano il Dr. R. Howard Berg, direttore del centro di microscopia integrato presso il Donald Danforth Plant Science Center, per la sua guida e aiutare con la microscopia confocale. Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi per dichiarare.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| FM4-64 Dye | Life Technologies | T13320 | |
| DyLight 550 Kit di etichettatura degli anticorpi | Thermo Scientific | 84530 | |
| Tappetino per piatti per micropozzetti con fondo in vetro | TeK | P35G-1.5-10-C | |
| Panno Mira | EMD Millipore Corp | 475855-1R | |
| SP8-X Microscopio confocale | Software Leica | ||
| ImageJ | FiJi | per l'analisi delle immagini | |
| Software Imaris | Bitplane | per l'analisi delle immagini |
Riferimenti
- Jones, J. D. G., Dangl, J. L. The plant immune system. Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).
- Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions. Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).
- Van Der ....
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Ristampe e permessi
