Abbiamo dimostrato un metodo per l'immagine di molteplici molecole all'interno di nano-strutture eterogenee alla precisione di una singola molecola utilizzando il legame sequenziale e l'eluzione di anticorpi a fluorescenza.
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Articolo metodologico
Molto multiplo, la risoluzione super-risoluzione delle celle T utilizzando la madSTORM
In questo articolo
Sommario
Abstract
Imaging di strutture cellulari eterogenee utilizzando la microscopia di localizzazione a singola molecola è stata ostacolata da inadeguate capacità di localizzazione e di multiplexing. Utilizzando marcatori fiduciari a fluorescenza nano-diamante, descriviamo le procedure di correzione e di allineamento necessarie per ottenere un'elevata precisione nella microscopia di localizzazione singola molecola. Inoltre, viene descritta una nuova strategia di multiplexing, madSTORM, in cui molecole multiple sono mirate nella stessa cellula usando sequenziali e eluendo degli anticorpi fluorescenti. MadSTORM è dimostrato su una cellula T attivata per visualizzare le posizioni di diversi componenti all'interno di una struttura a più proteine legata alla membrana chiamata microcluster del recettore cellulare T. Inoltre, viene discussa l'applicazione di madSTORM come strumento generale per la visualizzazione di strutture multi-proteine.
Introduzione
Sono state sviluppate varie tecniche di microscopia super-risoluzione per superare il limite di diffrazione della microscopia leggera (~ 200 nm). Tra queste è una categoria di tecniche chiamate microscopia di localizzazione singola (SMLM) che comprende microscopia di localizzazione foto-attivazione (PALM) e microscopia ottica stoccastica di ricostruzione (STORM). Le tecniche SMLM condividono l'uso di fluorofori che possono essere commutati tra stati (fluorescenti) e fuori (scuri / foto-commutati), consentendo la localizzazione sequenziale della fluorescenza da singole molecole 1 , 2 ,
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Protocollo
Attenzione: Prima dell'utilizzo, consultare tutti i fogli di sicurezza relativi ai materiali di sicurezza (MSDS). Molte delle sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo sono tossiche e cancerogene. Utilizzare tutte le appropriate pratiche di sicurezza durante l'esecuzione del protocollo, compresa l'uso di controlli ingegneristici (cappa di fumo, custodia di guanto) e dispositivi di protezione individuale (occhiali di protezione, guanti, cappotto di laboratorio, pantaloni lunghi, scarpe chiuse).
1. Imaging multiplo delle cellule T attivate
- Anticorpi coniugati direttamente con il colorante Alexa-647 (A647) util....
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Risultati
L'eluizione sequenziale e il metodo di colorazione sono stati utilizzati per produrre l'immagine madstorm multiplex di microclustri e altre strutture in una cella di Jurkat T attivata ( Figura 1 , allineamenti della cifra di controllo). Ogni immagine pseudo-colorata rappresenta un ciclo di imaging madSTORM acquisito nei passaggi da 1.1.1 a 1.3.13. Come descritto in precedenza 10 , il campo visivo dovrebbe essere monitorato per.......
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Discussione
Le procedure di multiplexing sequenziali, di correzione della deriva e di allineamento in madSTORM consentono una visualizzazione precisa e altamente multipleplazionale delle strutture eterogenee nelle cellule. 10 Inoltre, madSTORM evita le limitazioni di STORM multicolore, come l'aberrazione cromatica e le proprietà di scambio fotovoltaico / emissioni sub-ottimali di coloranti rossi non lontani 9 , 12 . Poiché la fase di eluizione ri.......
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Dichiarazioni
Non abbiamo niente da divulgare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Xufeng Wu per l'accesso al microscopio STORM. Questa ricerca è stata sostenuta dal Programma Intramurale di Ricerca del National Cancer Institute (NCI) Centro per la Ricerca sul Cancro e dal National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Camera di vetrino coprioggetti a 8 pozzetti | Lab-tek | 155409 | |
| soluzione di poli-L-lisina allo 0,1% | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100 nm Nano-diamante fluorescente | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε anticorpo | BD Biosciences | 555329 | |
| Albumina sierica bovina, frazione V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldeide | EMS | 15712 | cancerogena |
| da pelle di pesce d'acqua dolce | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 kit di etichettatura degli anticorpi | Thermo Fisher | A20186 | |
| cloruro di magnesio esaidrato | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| TUBI | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoetanolo | Sigma-Aldrich | M7154 | Cisteamina altamente tossica e sensibile all'aria |
| Sigma-Aldrich | 30070 | ||
| Cicloottatetraene altamente tossico 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Altamente tossico, sensibile all'aria |
| 10x PBS | KD Medico | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medico | RGF-3385 |
Riferimenti
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. ....
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Ristampe e permessi
