È necessaria per monitorare attecchimento dopo trapianto di cellule staminali in pazienti con emoglobinopatie quantificazione delle cellule derivate dal donatore. Una combinazione di flusso cytometry-base cella ordinamento, analisi di formazione della Colonia e successiva analisi del tandem brevi ripetizioni possono essere utilizzati per valutare la proliferazione e il differenziamento dei progenitori nel vano degli eritrociti.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Rilevamento di cellule progenitrici eritroidi di donatore residua dopo trapianto di cellule staminali ematopoietiche per i pazienti con emoglobinopatie
In questo articolo
Sommario
Abstract
La presenza di chimerismo incompleto è notata in una grande percentuale di pazienti dopo trapianto di midollo osseo per talassemia major o malattia di cellule di falce. Questa osservazione ha implicazioni tremende, come strategie di immunomodulazione terapeutica successiva possono migliorare il risultato clinico. Convenzionalmente, analisi reazione-basata catena della polimerasi di brevi ripetizioni in tandem è utilizzato per identificare il chimerismo in cellule di sangue donatore-derivate. Tuttavia, questo metodo si limita alle cellule nucleate e non può distinguere tra dissociate unicellulare lignaggi. Abbiamo applicato l'analisi di brevi ripetizioni in tandem di cellule progenitrici ematopoietiche ordinato cytometric di flusso e confrontato questo con l'analisi di brevi ripetizioni in tandem ottenuti da unità selezionata burst-forming - colonie eritroidi, entrambi raccolti dall'osso midollo osseo. Con questo metodo siamo in grado di dimostrare la diversa proliferazione e differenziazione delle cellule donatrici nel vano degli eritrociti. Questa tecnica è idonea per la realizzazione di monitoraggio della corrente di chimerismo nel trapianto di cellule staminali impostazione e quindi può essere applicato in futuro studi, ricerca sulle cellule staminali e progettazione di prove di terapia genica.
Introduzione
Trapianto di cellule staminali emopoietiche allogeniche (HSCT) è l'approccio curativo solo disponibile per una varietà di disordini genetici innati del sistema ematopoietico, realizzando i tassi di sopravvivenza libera da malattia superiore al 90% per altrimenti altamente compromessa e vita limitata pazienti1. L'efficacia di questo importante strumento terapeutico è stato ottimizzato limitando la tossicità di pre- e post-trapianto i regimi2, ma anche di interventi volti a sostenere la funzione dell'innesto stabile, che è quantificato da attento monitoraggio dei donatore-derivate cellule3,
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. isolamento di cellule del midollo osseo ematopoietico di multi-parametro fluorescenza-attivato ordinamento delle cellule
- campione colorazione
- prima di iniziare il processo, i seguenti elementi devono essere raccolti e pronti:
- media pendenza per la preparazione di mononucleari cellule tubi (GM), 50 mL conica
- 12x75 mm tubi di flusso per la macchiatura delle cellule
- buffer di colorazione: tampone fosfato salino (PBS) + 3% siero fetale di vitello (FCS)
- pipette < / l Ho >
- FC blocco e macchiatura anticorpi (CD34 APC, CD36 FITC, V450 CD45, BD Biosciences). Con questa combinazione di fluorocromo c'è....
- prima di iniziare il processo, i seguenti elementi devono essere raccolti e pronti:
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Separazione dei progenitori linfoematopoietico ordinando delle cellule di FACS
Dimostriamo qui risultati da ordinamento le popolazioni delle cellule necessarie per analisi STR a valle. Cellule del midollo osseo sono state macchiate con V450-coniugato anti-CD45, FITC Coniugato anti-CD36 e APC-coniugato anti-CD34. La popolazione di interesse è il responsabile dello sviluppo degli eritrociti cellule progenitori (ME.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
L'obiettivo di questo studio è quello di fornire al pubblico una combinazione dei due approcci per l'analisi di chimerismo donatore/ricevente nei progenitori eritroidi dopo HSCT nei pazienti trattati per emoglobinopatie: 1.) l'ordinamento fluorescenza-attivato delle cellule di cellule progenitrici ematopoietiche nei campioni di midollo osseo, seguiti dall'analisi di brevi ripetizioni in tandem e 2.) unità formanti colonie di crescita delle cellule del midollo osseo, classificazione delle colonie in vari tipi di cellule p.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Kinderkrebshilfe Regenbogen Südtirol.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | GE17-1440-02 | Rimuovi RBC |
| Provette coniche da 50 mL | Falcon | 14-432-22 | Preparazione del campione |
| Provette di flusso da 12 x 75 mm | Falcon | 352002 | Smistamento FACS |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Gibco | 10010023 | PBS |
| Siero fetale di vitello | Invitrogen Inc. | 16000-044 | FCS (inattivato termicamente) |
| CD34 APC | BD Bioscience | 561209 | FACS-Ab |
| CD36 FITC | BD Bioscience | 555454 | FACS-Ab |
| CD45 V450 | BD Bioscience | 642275 | FACS-Ab |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Hemocytometer | Invitrogen Inc. | C10227 | Conteggio automatico delle celle |
| Hank' s Soluzione salina bilanciata | Gibco | 14025092 | Tampone di sospensione nell'analisi FACS |
| HEPES | Gibco | 15630080 | Componente del tampone di sospensione |
| FcR | BD Bioscience | 564220 | Blocco FCR |
| FACS Aria I | BD Bioscience | 23-11539-00 | FACS Sorter |
| Ricombinante eritropoietina umana | Affimetrix eBioscience | 14-8992-80 | EPO |
| Isocove' s Dulbecco' modificato s Medium | Gibco | 12440053 | IMDM |
| L-Glutammina | Invitrogen | 25030-081 | Componente del terreno di coltura |
| CD34+ perle magnetiche | Milteny Biotech | 130-046-702 | Purificazione CD34+ |
| Ricombinante umano G-CSF | Gibco | PHC2031 | CFU-Assay |
| Ricombinante umano SCF | Gibco | CTP2113 | CFU-Assay |
| Ricombinante umano GM-CSF | Gibco | PHC2015 | CFU-Assay |
| Recombinant umano IL-3 | BD Bioscience 554604 | CFU-Assay | |
| Recombinant umano IL-6 | BD Bioscience | 550071 | CFU-Assay |
| Methocult H4434 Medium | Stemcell Technologies | 4444 | CFU-Assay |
| QiAmp DNA Kit di estrazione del sangue | Qiagen | 51306 | Fotometro |
| spettro Nanodrop ND-1000 | Thermo Scientific | ND 1000 | Quantificazione del DNA |
| senza H2O | FEREN0521 | Preparazione del DNA | |
| AmplTaq Gold DNA Polimerasi | Applied Bioscience | N8080240 | PCR |
| Eppendorf mastercycler gradiente | Eppendorf | 6321000019 | PCR |
| Hi-Di Formamid | Applied Bioscience | 4311320 | PCR |
| GeneScan 500 ROX Dimensioni Standard | Applied Bioscience | 4310361 | PCR |
| 3130 Analizzatore genetico | Applied Bioscience | 313001R | PCR |
Riferimenti
- Angelucci, E., et al. Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel. Haematologica. 99, 811-820 (2014).
- Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Tag
Smistamento cellulare tramite citometria a flussoanalisi delle ripetizioni in tandem cortecellule mononucleate del midollo osseosaggio delle unit formanti coloniegating cellulare CD36 CD45estrazione del DNA e analisi PCRtecnica di monitoraggio del chimerismoattecchimento in pazienti con emoglobinopatie
