Articolo metodologico

Cattura di Interactome mRNA da protoplasti vegetali

DOI:

10.3791/56011

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28 luglio 2017

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1Department of Biology, KU Leuven

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un protocollo di cattura di interazione applicato ai protoplasti a foglia di Arabidopsis thaliana . Questo metodo si basa fondamentalmente sulla creazione di reticolazione UV in vivo e consente l'isolamento e l'identificazione delle proteine ​​legate alla mRNA da un ambiente fisiologico.

Abstract

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Le proteine ​​legate all'RNA (RBPs) determinano le sorti degli RNA. Essi partecipano a tutte le vie di biogenesi dell'RNA e contribuiscono in particolare alla regolazione del gene post-trascrizionale (PTGR) di messaggeri RNA (mRNA). Negli ultimi anni, un certo numero di proteomi legati al mRNA da linee di cellule di lieviti e mammiferi sono stati isolati con l'utilizzo di un nuovo metodo chiamato "capture di intercommunicazione mRNA", che consente l'identificazione di proteine ​​legate alla mRNA (mRBPs) Direttamente da un ambiente fisiologico. Il metodo è composto da in-vivo ultravioletto (UV) reticolazione, abbattimento e purificazione di complessi ribonucleoproteine ​​messicani (mRNPs) da brani oligo (dT) e successiva identificazione delle proteine ​​reticolate mediante spettrometria di massa (MS). Molto recentemente, applicando lo stesso metodo, sono stati riportati simultaneamente diversi proteomi legati al mRNA vegetale provenienti da diverse origini tessutali di Arabidopsis : piantine etiolate, tessuti fogliari,Protoplasse della mesofila della foglia e cellule radicate coltivate. Qui presentiamo il metodo ottimizzato per la cattura di interoomi di mRNA per i protoplasti di mezophyll a foglia Arabidopsis thaliana , un tipo di cellule che serve come uno strumento versatile per esperimenti che comprendono diversi dosaggi cellulari. Le condizioni per la resa proteica ottimale includono la quantità di tessuto di partenza e la durata dell'irradiazione UV. Nel proteome legato al mRNA ottenuto da un esperimento di media scala (10 7 cellule), i RBP notati per avere capacità di legame di RNA sono stati sovrapresentati e sono stati identificati molti nuovi RBP. L'esperimento può essere scalato (10 9 cellule) e il metodo ottimizzato può essere applicato ad altri tipi di cellule vegetali e specie per isolare, catalogare e confrontare generalmente proteomi legati alle mRNA nelle piante.

Introduzione

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Gli eukarioti utilizzano percorsi di regolazione della biogenesi multipla di RNA per mantenere i processi biologici cellulari. Tra i tipi noti di RNA, l'mRNA è molto diversificato e porta la capacità di codifica delle proteine ​​e delle loro isoforme. 1. Il percorso PTGR indirizza le sorti dei pre-mRNA 2 , 3 . I RBP di diverse famiglie geniche controllano la regolazione dell'RNA, e in PTGR, mRBP specifici guidano mRNA attraverso interazioni fisiche dirette, formando mRNP funzionali. Di conseguenza, l'identificazione e la caratterizzazione dei mRBPs e dei loro mRNPs è fondamentale per la comprensione della regolazione del metabolismo cellulare mRNA 2. Negli ultimi tre decenni, i vari metodi in vitro , inclusi i REMSA (REMSA), l'evoluzione sistematica dei ligandi mediante esami di arricchimento esponenziale (SELEX) basato su costruzioni derivate dalla biblioteca, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radiomarcato o quantitativoI campioni di RNA di fluorescenza, la cristallografia a raggi X e la spettroscopia NMR 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 sono stati ampiamente applicati agli studi di RBP, principalmente da cellule di mammiferi. I risultati di questi studi su RBP mammiferi possono essere ricercati tramite la RNA-binding Protein DataBase (RBPDB), che raccoglie le osservazioni pubblicate 10 .

Anche se questi approcci in vitro sono strumenti potenti, determinano i motivi di RNA vincolati da un dato pool di sequenze di RNA e quindi sono limitate nella loro capacità di scoprire nuovi target RNA. Lo stesso vale per le strategie di calcolo per prevedere RBP a livello genomico, che si basano sulla conservazione della sequenza e della struttura proteica 15 . Per superare questo, un nuovo metodo sperimentale haÈ stato stabilito che consente l'identificazione dei motivi RNA che interviene un RBP di interesse, nonché per la determinazione della posizione precisa di legame. Questo metodo, chiamato "crosslinking e immunoprecipitazione" (CLIP), è composto da in-vivo reticolazione UV seguito da immunoprecipitazione 11 . Studi iniziali hanno dimostrato che la fotoattivazione di nucleotidi di DNA e RNA può verificarsi a lunghezze d'onda UV di eccitazione maggiore di 245 nm. La reazione attraverso la timidina sembra essere favorita (rango in ordine di diminuzione della fotoreattività: dT ≥ dC> rU> rC, dA, dG) 12 . Utilizzando la luce UV con una lunghezza d'onda di 254 nm (UV-C), è stato osservato che i legami covalenti tra nucleotidi RNA e residui di proteine ​​sono creati quando nell'ambito di pochi Angstroms (Å). Il fenomeno è dunque chiamato "crosslinking" a zero lunghezza di RNA e RBP. Questo può essere seguito da una procedura di purificazione rigorosa Dura con poco sfondo 13 , 14 .

Una strategia complementare al CLIP è quella di combinare in vivo la reticolazione UV con l'identificazione delle proteine ​​per descrivere il paesaggio dei RBP. Un certo numero di tali proteomi legati al mRNA a livello genomico sono stati isolati da cellule staminali embrionali (ESCs) e linee cellulari umane ( cioè HEK293 e HeLa) utilizzando questo nuovo approccio sperimentale, chiamato "capture intercommunicazione mRNA" 18 , 19 , 20 , 21 . Il metodo è composto da in-vivo reticolazione UV seguita da purificazione mRNP e proteomica basata su MS. Applicando questa strategia, sono stati scoperti molti nuovi RBP "moonlighting" contenenti RBD non canonici, e è risultato chiaro che più proteine ​​hanno capacità di legame RNA rispetto a quanto precedentemente supposto"> 15 , 16 , 17. L'uso di questo metodo consente di nuove applicazioni e di capacità di rispondere a nuove domande biologiche durante l'analisi di RBP. Ad esempio, uno studio recente ha indagato sulla conservazione del proteome legato all'RNA (il nucleo RBP Proteome) tra il lievito e le cellule umane 22 .

I RBP vegetali sono già stati trovati coinvolti nella crescita e nello sviluppo ( ad esempio nella regolazione post-trascrizionale del tempo di fioritura, dell'orologio circadiano e dell'espressione genica in mitocondri e cloroplasti) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . Inoltre, si pensa di svolgere funzioni nei processi cellulari che rispondono a sollecitazioni abiotiche ( ad esempio, freddo, siccità, sLinità e acido abscisico (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . Ci sono più di 200 geni RBP previsti nel genoma Arabidopsis thaliana , basato su motivi di sequenza di dominio RNA (RRM) e K homology (KH); Nel riso, circa 250 sono stati notati 35 , 36 . È notevole che molti RBP previsti sembrano essere unici per le piante ( ad esempio, nessun ortologo metazoico a circa il 50% dei RBP di Arabidopsis previsti contenenti un dominio RRM) 35 , suggerendo che molti potrebbero servire nuove funzioni. Le funzioni dei RBP più previste rimangono inarcabili 23 .

L'isolamento dei proteomi legati al mRNA da Arabidopsis piantine etiolate, tessuti a foglia, cellule radicate coltivate e protoplasti di mezofosina di foglie attraverso l'uso diRecentemente è stata segnalata la cattura di interagenti mRNA 38 , 39 . Questi studi dimostrano il forte potenziale di catalogare sistematicamente i RBP funzionali nelle piante nel prossimo futuro. Qui presentiamo un protocollo per la cattura di intero mRNA da protoplasti vegetali ( cioè cellule senza pareti cellulari). I protoplasti di mezophyll delle foglie Arabidopsis thaliana sono il tipo principale di cellule di foglie. I protoplasti isolati consentono l'accesso ottimale della luce UV alle cellule. Questo tipo di cellula può essere utilizzato in saggi che esprimono transitoriamente proteine ​​per la caratterizzazione funzionale 40 , 41 . Inoltre, la protoplastica è stata applicata a diversi altri tipi di cellule vegetali e specie 42 , 43 , 44 ( es. Petersson et al ., 2009; Bargmann e Birnbaum, 2010; Hong et al ., 2012).

Il metodo comprende un totale di 11 passaggi ( Figura 1A ). I protoplasti di mezophyll a foglia Arabidopsis vengono prima isolati (fase 1) e successivamente irradiati UV per formare mRNPs reticolati (fase 2). Quando i protoplasti vengono lisati in condizioni di denaturazione (fase 3), i mRNP reticolati vengono rilasciati in tampone di lisi / legame e tirati da oligo-d (T) 25 brani (fase 4). Dopo diversi cicli di lavaggi rigorosi, i mRNPs vengono purificati e analizzati ulteriormente. I peptidi denaturati di mRBPs vengono digeriti mediante proteinasi K prima che i mRNA reticolati siano purificati e la qualità RNA è verificata da qRT-PCR (passaggi 5 e 6). Dopo la terapia con RNase e la concentrazione di proteine ​​(fase 7), la qualità della proteina è controllata mediante elettroforesi in poliacrilammide SDS (SDS-PAGE) e colorazione in argento (fase 8). La differenza di pattern di banda proteica può essere facilmente visualizzata tra un campione reticolato (CL) e un campione non reticolato (non CL;Il campione di controllo negativo da protoplasti che non è sottoposto ad irraggiamento UV). L'identificazione delle proteine ​​è ottenuta tramite proteomica basata su MS. Le proteine ​​del campione CL sono separate da un'elettroforesi a gel di poliacrilammide (1D-PAGE) unidimensionale per rimuovere eventuali contaminazioni di fondo, sono "in-gel digerite" in peptidi corti utilizzando la tripsina e vengono purificati (fase 9). La cromatografia liquida a fase inversa di fase nano accoppiata alla spettrometria di massa (nano-LC-MS) permette di determinare la quantità di proteine ​​definitive nel proteome legato al mRNA (fase 10). Infine, i mRBP identificati sono caratterizzati e catalogati utilizzando analisi bioinformatica (fase 11).

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Protocollo

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1. Arabidopsis Leaf Mesophyll Protoplast Isolamento

NOTA: I protoplasti della mesopilita delle foglie Arabidopsis sono essenzialmente isolati come descritto da Yoo et al ., 2007, con diverse modifiche 40 .

  1. Crescita delle piante
    1. Immergere circa 200 Arabidopsis thaliana Col-0 semi di ecotipo in acqua sterilizzata per 2 giorni a 4 ° C nell'oscurità per la stratificazione.
      NOTA: Questo numero di semi è sufficiente per un campione non CL e un campione CL (vedere passo 1.3).
    2. Preparare le pentole con una miscela del terreno e del vermiculite del 50% ( v / v ) e immergere le pentole con acqua distillata in un vassoio per bagnare il terreno.
    3. Coltivare e distribuire i semi stratificati su terreno bagnato. Non coprire i semi con terreno addizionale perché i semi di Arabidopsis necessitano di luce per la germinazione.
      NOTA: Le condizioni di crescita delle piante sono un ciclo di 12 h di luce / 12 ore scuro a 23 ° C,Con un'intensità luminosa di 100 μmol m -2 s -1 , in una sala di crescita per 5 settimane prima della fioritura. Possono essere utilizzate anche piante di 4 settimane 40 .
      NOTA: Tutti i materiali e reagenti descritti dal punto 1.2.1 al passaggio 3.2.3 sono per due campioni ( cioè un campione non CL (il campione di controllo non sottoposto ad irraggiamento UV) e un campione CL (la ricerca Campione sottoposto ad irraggiamento UV-C)).
  2. Preparazione della soluzione enzimatica isotonica
    1. Preparare 80 ml di soluzione enzimatica primaria isotonica (400 mM di mannitolo, 20 mM KCl e 20 mM di MES buffer (pH 5,7)) e riscaldare immediatamente la soluzione in un incubatore a 60 ° C per 10 min.
    2. Aggiungere 1,2 g di cellulasi R10 (w / v 1,5%) e 0,32 g di Macerozyme R10 (w / v 0,4%) in polvere per soluzione enzimatica isotonica primario caldo.
    3. Portare con cautela la polvere dell'enzima in soluzione applicando una leggera agitazione. RapBruciare calda la soluzione in un incubatore a 60 ° C per 10 minuti fino a quando la soluzione enzimatica è chiara chiara.
    4. Raffreddare la soluzione su ghiaccio per 3 min e aggiungere 800 μl di 1 M CaCl 2 e 800 μl di 10% ( w / v ) BSA alla soluzione.
    5. Homogenizzare la soluzione pipettando e filtrando attraverso un filtro da 0,22 μm. Aliquota questa ultima soluzione enzimatica isotonica in due grandi piatti di Petri (150 mm x 20 mm).
  3. Preparazione delle strisce di foglie rosse Arabidopsis
    NOTA: 150 foglie per ogni piatto Petri sono consigliate per un campione non CL o un campione CL.
    1. Scegliere e tagliare un totale di 300 completamente espansa 2 ° - 3 ° o doppia coppia di foglie vere (media: 3 - 4 per rosetta) in da 0,5 a 1 mm strisce foglio utilizzando un nuovo e tagliente lametta.
    2. Trasferire e sommergere immediatamente le strisce nella soluzione enzimatica isotonica.
      NOTA: per evitare qualsiasi contatto con la luce, coprire sempre tPiatti di Petri con foglio di alluminio. Non schiacciare le foglie. Verificare che tutte le strisce siano sommerse nella soluzione e non galleggiare sulla superficie.
  4. Isolamento dei protoplasti di mesophyll a foglia Arabidopsis
    1. Posizionare i piatti di Petri ricoperti di fogli di alluminio in essiccatori a vuoto e infiltrarsi in strisce di foglia sotto vuoto per 30 min. Successivamente, incubare i piatti di Petri nelle tenebre senza scuotere a temperatura ambiente per 2,5 ore.
    2. Scuotete manualmente e brevemente i piatti orizzontalmente a mano, cercando di liberare completamente i protoplasti nella soluzione enzimatica.
  5. Raccolta e conteggio dei protoplasti
    1. Filtrare la sospensione protoplastica attraverso una maglia in nylon da 35 a 75 μm. Aliquota il filtrato di ciascun campione in due tubi rotondi da 50 mL (circa 20 mL di filtrato in ciascun tubo).
    2. Sciacquare ogni piatto di Petri con 10 mL di tampone W5 (154 mM NaCl, 125 mM CaCl 2, 5 mM KCl e 2 mM MES buffer (pH 5,7) per trasferire il resto dei protoplasti alla soluzione enzimatica. Aggiungere questo filtrato da 10 mL di ciascun campione ai tubi. Coprire i tubi con foglio di alluminio e tenerli su ghiaccio.
    3. Spin tutti i quattro tubi per 5 minuti a 100 xg per pelletare i protoplasti. Scartare il surnatante e riposare delicatamente i pellet protoplast in ciascun tubo con 10 mL di tampone W5.
      NOTA: Quando si sospendono i pellet protoplast, inumidire delicatamente il tubo e ruotare delicatamente il tubo a mano fino a quando i pellet sono scomparsi. Non pipettare direttamente il pellet per evitare di danneggiare le cellule.
    4. Ripetere il passaggio 1.5.3 una volta e combinare la sospensione protoplastica da due tubi di ciascun campione in un tubo da 50 millimetri di fondo rotondo. Mantenere i tubi sul ghiaccio.
    5. Conti i protoplasti usando un emocitometro.
      NOTA: Ogni 20 celle entro 25 cubi corrispondono a 2 x 10 5 protoplasti / ml. 150 foglie dovrebbero produrre circa 1 x 10 7 cellule.Modulare per avere un uguale numero totale di protoplasti nei campioni non CL e CL.
    6. Mantenere i protoplasti in ghiaccio per 30 min. Successivamente, ruotare i tubi per 5 minuti a 100 x g. Eliminare il supernatante e risospendere le protoplasti in ogni provetta con 20 ml di soluzione MMg (400 mM di mannitolo, 15 mM MgCl 2, e 4 mM MES (pH 5,7)).

2. In vivo mRNA-protein Crosslinking mediante irradiazione UV

NOTA: Tenere il tubo di campione non CL sul ghiaccio. Il campione CL deve essere immediatamente irradiato UV.

  1. Trasferire la sospensione protoplastica contenente 1 x 10 7 cellule dal tubo di campione CL a un nuovo piatto di grandi dimensioni di Petri (150 mm x 20 mm) e aggiungere 30 ml di soluzione MMg ghiacciata per coprire la superficie della lastra. Distribuire le cellule in tutto il buffer MMg con pipetta gentile. Immediatamente mettere il piatto di Petri senza la copertura superiore in un apparecchio di reticolazione UV.
    NOTA: L'altezza tra la lampada UVE il piatto di Petri è di 8 cm.
  2. Irradiate il campione con una luce UV a 254 nm e un'intensità UV di 0,00875 W / cm 2 per 1 min, 3 min o 5 min. Dopo l'irraggiamento, rapidamente aliquota la sospensione protoplastica in due nuovi tubi rotondi da 50 mL. Lavare il fondo del piatto con un ulteriore 5 ml di soluzione MMg ghiacciata per raccogliere il resto dei protoplasti e aggiungere questa sospensione cellulare a questi due tubi.
    NOTA: 1 min è stato scelto come la condizione ottimale. La spiegazione può essere trovata nei risultati rappresentativi .

3. Lysis di protoplast in condizioni di denaturazione

  1. Preparazione di pellet protoplast per lisi
    1. Spin il tubo di campione non CL insieme ai due campioni di campione CL dal passo 2 a 100 xg per 5 minuti e scartare il supernatante. Posizionare il tubo del pellet protoplast del campione non CL sul ghiaccio.
    2. Aggiungere 10 ml di soluzione MMg ghiacciata a ciascuna provetta CL, genRiutilizzare i pellets e ricomponirli in un tubo rotondo da 50 ml. Spin il tubo a 100 xg per 5 minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, mantenere il pallone protoplast del tubo di campione CL sul ghiaccio.
  2. Protoplast lisi e omogeneizzazione del protoplast lisato
    1. Aggiungere 9 mi di lysis / buffer di legame ghiacciato (500 mM LiCl, 0,5% ( w / v ) di dodecil solfato di litio (LiDS), 5 mM Dithiothreitol (DTT), 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) e 1 mM EDTA (pH 8,0)) al pellet di cellule di ciascun campione. Approssimativamente lipe i protoplasti pipettando verso l'alto e verso il basso circa 20 volte fino a quando la sospensione è verde omogeneamente chiaro.
    2. Passare il lisato protoplastico due volte attraverso una siringa da 50 ml con un ago stretto (0,9 x 25 mm 2 ) per l'omogeneizzazione. Incubare il lisato su ghiaccio per 10 min. Freeze i lisati in azoto liquido e conservare a -80 ° C per un massimo di 3 settimane.

4. mRNP di abbattimento e di purificazioneDa Oligo-d (T) 25 Perline

NOTA: Tutti i seguenti materiali e reagenti descritti, dal punto 4.1 al punto 4.4, sono soltanto per un campione (ad esempio, un campione non-CL oppure un campione CL). Il lisato protoplast deve essere aggiunto immediatamente ai tubi contenenti perline dopo che il lozo / legante di legame di supernatante di branco viene scartato.

  1. Preparazione di branelli magnetici oligo-d (T) 25 per la cattura di oligo (dT)
    1. Sciogliere il lisato protoplastico congelato a temperatura ambiente. Quando il lisato è completamente scongelato, mantenere il tubo di lisato sul ghiaccio.
    2. Aliquota 1,8 ml di oligo-d (T) 25 branelli magnetici (5 mg / ml) in 6 nuovi tubi microcentrifuga da 2 ml di fondo tondo su ghiaccio. In ogni tubo, lavare la sospensione del tallone omogeneamente con 600 μl di tampone di lisi / legame brevemente pipettando su e giù e ruotando delicatamente a 4 ° C per 2 min. Tenere le perline sul ghiaccio.
  2. Rilegatura
    1. PostoTutti i 6 tubi che contengono le perline in una cremagliera magnetica a 4 ° C per 3 minuti, che provocherà la cattura magnetica delle perle e la radura della sospensione.
      NOTA: quando i tubi sono posizionati nel rack magnetico, attendere che le perle siano completamente catturate, almeno 3 min.
    2. Scartare il supernatante e immediatamente aliquota 9 ml di lisato protoplastico in questi 6 tubi. Mescolare bene pipettando finché non appare una sospensione omogenea e incubare le perle in lisato protoplastico a 4 ° C per 1 h applicando una leggera rotazione.
      NOTA: Si consiglia un tempo di incubazione da 30 minuti a 1 ora.
  3. Lavaggio
    1. Riposizionare i tubi nel rack magnetico a 4 ° C per 3 min. Quando tutte le perle vengono bloccate sul lato dei tubi, raccogliere il lisato protoplastico in 6 nuovi tubi di microcentrifuga a due millimetri e memorizzarli temporaneamente a 4 ° C. NON scartare subito il lisato protoplastico; Mantenere il lisatoA 4 ° C.
    2. Aggiungere 1,5 ml di tampone di lavaggio ghiacciato 1 (500 mM LiCl, 0,1% ( w / v ) LiDS, 5 mM DTT, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) e 1 mM EDTA (pH 8,0) In ogni tubo. Riposizionare le perle e applicare una rotazione delicata per 1 minuto. Riposizionare i tubi nel rack magnetico a 4 ° C per 3 minuti e scartare il surnatante. Ripetere questa fase di lavaggio con un tampone di lavaggio una volta.
    3. Ripetere la stessa procedura di questo periodo di lavaggio due volte utilizzando 1,5 ml di tampone di lavaggio ghiacciato 2 (500 mM LiCl, 5 mM DTT, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) e 1 mM EDTA (pH 8,0) 1,5 ml di tampone a basso contenuto di sale ghiacciato (200 mM LiCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) e 1 mM EDTA (pH 8,0).
      NOTA: se i mRNPs sono stati isolati in modo efficace dal lisato protoplastico, dovrebbe esserci un "aureo" visibile attorno al pellet di perle nel campione CL durante la fase di lavaggio con il tampone di lavaggio 2 ( figura 1B ).
  4. eluizione
    1. Aggiungere 500 μLDi tampone di eluizione (20 mM Tris-HCl (pH 7,5) e 1 mM EDTA (pH 8,0)) alle perline in ogni tubo. Riposare delicatamente le perle e incubare a 50 ° C per 3 min per rilasciare i RNA poli (A). Riposizionare delicatamente le perle una volta pipettando. Riposizionare i tubi nella cremagliera magnetica a 4 ° C per 5 min.
    2. Trasferire e combinare tutti gli eluenti (circa 3 ml in totale) ad un tubo sterile a fondo conico da 15 ml, privo di RNasi, a ghiaccio.
      NOTA: la qualità e la quantità di RNA possono essere immediatamente determinati utilizzando un dispositivo di spettrofotometro.
      NOTA: La concentrazione di RNA di ciascun campione è di circa 10 ng / μL, con un rapporto A 260 / A 280 di 1,9. Il rapporto A 260 / A 280 deve essere compreso tra 1,6 e 2,0, in quanto gli RNA isolati da poli (A) sono solitamente superiori al 70% puro. Se la concentrazione di RNA è troppo bassa, aumentare il numero di protoplasti di partenza fino ad un massimo di 10 9 . CampioniPossono essere congelati in azoto liquido e mantenuti a 80 ° C per l'immagazzinamento a lungo termine.
    3. Ripetere il passaggio 4.2 al punto 4.4 per altri due turni e riutilizzare le perline oligo-d (T) 25 per ridurre i RNA poli (A) dal lattato protoplastico.
      NOTA: Dopo tre cicli di allontanamento, devono essere complessivamente 9 mL di eluente per ogni campione non CL o CL. Eseguire tutto il lavoro a 4 ° C per evitare il degrado dell'RNA. Seguire il passo 4.5 o il passaggio 4.6 per riutilizzare o rigenerare le perle.
  5. Preparazione di oligo-d (T) 25 riutilizzati
    1. Lavare le perline due volte con 1 ml di tampone di eluizione gelato e una volta con 1 ml di lysis / legame di legame ghiacciato per regolare la concentrazione di LiCl in sale a 500 mM.
    2. Seguire il punto 4.1, scartare il surnatante, trasferire il lisato protoplastico conservato in ogni tubo e ripetere l'intera procedura dal punto 4.2 al punto 4.4 per altri due cicli.
  6. Rigenerazione di oligo-d (T) 25 perline
    NOTA: i branelli possono essere memorizzati e utilizzati per un altro esperimento (il riutilizzo massimo è tre volte).
    1. Seguire il punto 4.4, aggiungere 1 mL di 0,1 M NaOH ai branchi e incubare ruotando a temperatura ambiente per 5 minuti. Per ogni tubo, lavare due volte con 1 mL di tampone di lavaggio 1 e tre volte con 1x PBS (pH 7,4) contenente 0,1% Tween-20 per l'equilibrazione. Tenere le perle da ogni tubo in 300 μL di sterile RNase-free 1x PBS (pH 7.4) contenente 0,1% di Tween-20 a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.
      NOTA: i branelli utilizzati per i campioni Arabidopsis CL in questo esperimento possono essere utilizzati solo per gli stessi campioni di piante la prossima volta.

5. Proteinasi K trattamento e purificazione mRNA

  1. Proteinasi K trattamento
    1. Aggiungere 8 μL di soluzione proteinacea K (2 μg / μL) a 1 ml di eluente da ogni campione per digerire le proteine ​​reticolate UV. BrVortice iefly.
  2. Purificazione di mRNA
    1. Incubare l'eluente a 37 ° C per 1 h. Purificare l'RNA utilizzando il kit di purificazione RNA per rimuovere contaminanti residui.
      NOTA: Dopo la depurazione, gli RNA sono pronti per il test di qualità RNA utilizzando il test qRT-PCR.
      NOTA: Altri kit, come il kit RNA mini e il reagente TRIzol, possono anche essere utilizzati 14 .

6. Analisi qRT-PCR

  1. Trascrizione inversa
    1. Realizzare una sintesi efficiente del cDNA di primo strato utilizzando il sistema di trascrizione inversa, con 1 μg di RNA come modello. Diluire il campione a 5 ng / μl con acqua priva di nucleasi.
  2. CDNA quantificazione usando qRT-PCR
    1. Amplificare e quantificare il cDNA usando il mix master master qPCR e il ciclatore PCR in tempo reale, con 10 g di cDNA come modello. Utilizzare il seguente programma PCR: 95 ° C per 10 min(Fase 1, un ciclo) e 95 ° C per 15 s e 60 ° C per 1 min (fase 2, 40 cicli).
      NOTA: Il gene di riferimento utilizzato qui è stato un gene di controllo interno endogeno, UBQ10 (AT4G05320). I primer di qRT-PCR per URQ10 e 18R rRNA sono stati descritti in Li et al ., 2014 e Durut et al ., 2014, rispettivamente 45 , 46 . Le sequenze di primer sono elencate nella tabella dei materiali .

7. Trattamento RNase e concentrazione mRBP

  1. RNase trattamento
    1. Aggiungere circa 100 U di cocktail RNase contenente RNasi A e RNasi T1 in 8 mL di eluente. Includere un campione di controllo negativo con cocktail RNase in cui l'eluente è sostituito da acqua priva di nucleasi. Brevemente vortice e incubare a 37 ° C per 1 ora.
  2. Concentrazione mRBP
    1. Dopo la digestione della RNasi, concentrare la usin dell'eluaG unità filtranti centrifughe. Il volume finale è di 75 μL, con una resa proteica totale di circa 2 μg di ciascun campione dopo la concentrazione. Posizionare i campioni a -80 ° C per la conservazione a lungo termine.

8. SDS-PAGE e colorazione d'argento

  1. SDS-PAGE
    1. Mescolare 25 μL dell'elemento concentrato (campione CL) o del campione di controllo (campione non CL) con 15 μL di 2x colorante di caricamento. Riscaldare il campione a 95 ° C per 5 minuti e caricarla su un gel SDS-PAGE contenente gel di impilamento del 5% e gel di risoluzione del 12%, compreso un marcatore proteico.
    2. Condensare le proteine ​​a 60 V per 40 minuti e separare a 160 V per circa 1 h finché il colorante di carica raggiunge la fine del gel di risolvimento.
  2. Saggio di colorazione d'argento
    1. Lavare il gel SDS-PAGE due volte con acqua ultrapura per 5 minuti ogni volta. Eseguire la colorazione d'argento delle proteine ​​usando un kit di macchia argentina commerciale.
      NOTA: Le bande proteiche devono essere visualizzate entro 5 min. Se le bande sono visibili dopo 5 minuti con un colore molto chiaro, si consiglia di aumentare il numero di protoplasti di partenza fino al massimo di 10 9 .

9. Trypsin Digest di proteine ​​e purificazione peptidica

  1. La digestione del Trypsin
    NOTA: eseguire un secondo gel 1D-PAGE prendendo altri 25 μL di soluzione mRBP concentrata da ciascun campione per l'identificazione mRBP; I gel gelati in argento non possono essere usati poiché non sono compatibili con l'analisi MS.
    1. Dopo aver eseguito il gel 1D-PAGE, fissare il gel in soluzione di fissazione (50% ( v / v ) metanolo e 10% ( v / v ) acido acetico) per 1 h. Macinare il gel in soluzione di macchia (0,1% ( w / v ) Coomassie Brilliant Blue R-250, 50% ( v / v ) metanolo e 10% ( v / v ) acido acetico) per 20 minuti con agitazione leggera. Destain il gel in soluzione destain (40% ( v / v ) metanolo e 10% ( v/ V) acido acetico) per 1 h. Dopo destaining, mantenere il gel nell'acido acetico del 5% ( v / v ).
      NOTA: Durante il destainamento, la nuova soluzione destain può essere sostituita fino a che il fondo non sia completamente destainato.
    2. Tagliate le bande di interesse fuori dal gel. Tagliare le fasce ulteriormente in pezzi di circa 1 mm 3 per la successiva digestione ottimale della trippa e estrazione dei peptidi. Idratare i pezzi di gel con 50 μl di bicarbonato di ammonio 100 mM (NH 4 HCO 3 ) per 10 min. Coprire completamente i pezzi del gel.
      1. Rimuovere attentamente la soluzione idratante e disidratare i pezzi del gel con acetonitrile (CH 3 CN) per 10 min. Rimuovere con cautela la soluzione acetonitrile.
      2. Ripetere il processo dall'idratazione alla disidratazione due volte. Infine, rimuovere la soluzione acetonitrile.
        NOTA: Il tempo di esecuzione del gel dipende dallo scopo dell'esperimento. I tempi lunghi permettono una buona separazione delle proteine, quindi il divieto specifico del gel macchiatoDs può essere tagliato per ulteriori analisi. Se lo scopo è mantenere le proteine ​​e rimuovere i contaminanti, è sufficiente un breve periodo di tempo.
    3. Aggiungere 500 μl di soluzione DTT da 6.6 mM ed incubare i pezzi di gel per 10 min. Rimuovere la soluzione DTT e lavare due volte il gel con 500 μl di soluzione acetonitrile al 95% ( v / v ).
      1. Dopo il lavaggio, rimuovere la soluzione di acetonitrile e incubare i pezzi di gel con 500 μl di soluzione di acido iodoacetico (IAA) di 55 mM per 10 minuti nell'oscurità.
      2. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione e lavare nuovamente i pezzi di gel con 500 μl di soluzione acetonitrile al 95% ( v / v ). Asciugare i pezzi del gel.
    4. Incorporare i pezzi di gel completamente con 25 ml di tampone di digestione (50 mM NH 4 HCO 3, 5 mM CaCl 2, e 6 ng / mL tripsina) e mantenere in ghiaccio per 45 minuti per consentire la tripsina permeare nel gel. Incubare i pezzi di gel overnight a 37 ° C per en Digestione zymatic.
  2. Purificazione del peptide
    1. Aggiungere 80 μl di 50 mM di NH 4 HCO 3 ai pezzi del gel nel tampone di digestione e vorticarsi ripetutamente per estrarre i peptidi tryptici. Raccogliere l'estratto. Ripetere questo passo di estrazione due volte con 80 μl di 50% ( v / v ) CH 3 CN e 5% ( v / v ) acido formico (FA).
      NOTA: L'estratto finale totale dovrebbe essere di circa 240 μL.
    2. Stabilire e concentrare gli estratti in circa 10 μL per concentrazione sotto vuoto o liofilizzazione e aggiungere 25 μl di soluzione trifluoroacetica (TFA) acquoso 0,1% ( v / v ). Desaltare i campioni con le colonne μ-C18, seguendo il protocollo del produttore.
    3. Eluire i peptidi con 4 - 10 μL di 60% ( w / v ) CH 3 CN e 0,1% ( v / v ) FA. Liofilizzare (liofilizzare) i peptidi e conservarli a -20 ° C fino all'analisi.
Titolo "> 10. Nano-LC-MS

  1. Cromatografia liquida a fase inversa di Nano
    NOTA: eseguire l'analisi LC-MS con uno spettrometro di massa che è online-accoppiato con uno strumento di cromatografia liquida. Questo strumento deve essere dotato di una colonna C18 (particella di 2 μm, dimensioni di pori di 100 μ e dimensione di 50 μm x 15 cm).
    1. Risospendere i peptidi liofilizzati in 16 ml di soluzione (2% (v / v) CH 3 CN e 0,1% (v / v) FA). Iniettare e caricare 5 μL di soluzione peptidica a una portata di 5 μL / min su una precolonna C18 (dimensione delle particelle di 3 μm, dimensione di pori di 100 μ, nanoviper e 75 μm x 2 cm in dimensione).
    2. 10.1.2. Separare i peptidi usando un gradiente di 95 min con una portata di 300 nL / min. Durante questo gradiente di separazione aumentare la fase mobile B dal 4% al 10%, dal 10% al 25% e dal 25% al ​​45% rispettivamente in 5 min, 50 min e 18 min. Infine, aumenta notevolmente la fase mobile B al 95% in 1 min. DopoCiascun gradiente di separazione di 95 min, applicare un passo di risciacquo intrinseco contenente un gradiente di 10 min dal 4% al 95% in 5 min.
      NOTA: Fase mobile A è del 99,9% H 2 O e 0,1% (v / v) FA, e mobile la fase B è 19.92% H 2 O, 80% (w / v) CH 3 CN, e 0,08% (v / v ) FA.
  2. Saggio di spettrometria di massa
    1. Funziona lo spettrometro di massa in modalità dati dipendente con una gamma di massa da 400 a 1.600 m / z.
    2. Selezionare fino a dieci degli ioni più intensi in MS1 ​​per generare gli spettri di frammentazione. Impostare la risoluzione a 70.000 di larghezza massima a metà massimo (FWHM) per MS1 e 17.000 per MS2 con un target di controllo di guadagno automatico (AGC) di 3.000.000 e 1.000.000 ioni e un tempo di iniezione massimo di 256 ms e 64 ms per MS1 E MS2, rispettivamente.
    3. Impostare l'esclusione dinamica a 10 s per evitare la ripetuta frammentazione degli ioni più abbondanti.
      NOTA: qui, gli ioni con uno o più di sei cariche sono eXcluded per MS2.
  3. Proteomica qualitativa: identificazione di peptide e proteine
    1. Analizzare gli spettri di frammentazione usando software come il software Peaks studio 47 , 48 , 49 .
      NOTA: Altri pacchetti software sono disponibili per l'identificazione dei peptidi, come NovoHMM 30 e PepNovo 37 per la sequenza de novo e SEQUEST 54 e Mascot 55 per la ricerca del database.
    2. Combinare gli spettri con la stessa massa (<2 ppm di differenza) e tempi di ritenzione (<2 min) e mantenere solo gli spettri con una soglia di qualità superiore a 0,65 per ricercare il database Swiss-Prot (versione: dicembre 2013) per la tassonomia impostata sul modello Pianta Arabidopsis thaliana . Utilizzare i seguenti parametri di ricerca: una tolleranza di massa del precursore di 10 ppm con l'utilizzo del monMassa oisotopica; Una tolleranza di massa di frammenti di 20 mmu; La tripsina come enzima della digestione, con un massimo di 2 divisioni mancanti; Cisina carbamidometilazione come modifica fissa; Ossidazione della metionina come modifica variabile; E un massimo di 3 variazioni post-traduzionali variabili per peptide. Dopo l'identificazione, impostare manualmente le soglie di punteggio per l'identificazione affidabile del peptide e della proteina in modo che si acquisisca un tasso di scoperta falso (FDR) <5%.
  4. Proteomica quantitativa: analisi statistica dei dati di spettrometria di massa
    1. Utilizzare LC-MS ( ad es. Progenesis) per la quantitazione senza etichetta dei dati proteomici.
      NOTA: le aree di picco del peptide MS1 (o intensità) sono collegate ai peptidi identificati dal software dello studio in base alla loro massa, con l'errore tollerato ad un massimo di 10 ppm.
      NOTA: Questo software calcola l'abbondanza di un peptide integrando le aree di picco di tutti gli stati di carica tra 2 + e 8 + . I dati quantitativi sono collegati all'identificazione del peptide PEAKS mediante uno script inhouse (corrispondenza in massa con l'errore tollerato al massimo di 10 ppm).
    2. Calcolare le variazioni medio log2 (CL / non-CL) per ogni peptide. Raggruppare le modifiche dei peptidi unici per proteine.
      NOTA: in ciascun gruppo, il cambiamento finale di una proteina è uguale al cambio medio dei suoi peptidi.
    3. Calcolare il valore p utilizzando la t- test di Student per ciascun gruppo per valutare il significato statistico. Applicare il pacchetto software R (versione 3.3.0) per correggere i valori p per l'FDR di tutti i gruppi utilizzando il metodo Benjamini-Hochberg (BH).
    4. Disegnare la trama vulcanica utilizzando il pacchetto funzione "calibrare" (versione 1.7.2) compatibile con il pacchetto software R (versione 3.3.0).
      NOTA: qui i valori p-adjusted (-log10 (valore p-aggiuntivo)) -log10 sono una funzione delle modifiche log2-fold di tutte le proteine ​​identificate. Le proteine ​​sonoTrattati come colpi positivi nel proteome legato al mRNA se i loro cambiamenti log2 sono più di 2, con o senza significato.

11. Catalogo del proteomico legato al mRNA identificato

  1. Classificare le proteine ​​identificate dal punto 10 in tre categorie in base agli elementi di "funzioni molecolari e processo biologico" tramite il database di Ontologia (GO) e "famiglia e dominio" tramite il database InterPro.
  2. Poiché la categoria I, o le "proteine ​​ribosomali", contengono tutte le proteine ​​ribosomali rilevate, definiscono le proteine ​​della categoria II o "RBP principali", come contenenti domini proteici annotati che interagiscono con RNA o collegano l'associazione RNA con funzioni note o sconosciute in biologia RNA .
  3. Poichè le proteine ​​con funzioni conosciute o sconosciute nella biologia di RNA senza domini di legame RNA annotato vengono inseriti nella categoria III o "RBPs candidati" definiscono gli enzimi della categoria III basati su annotazioni del gruppo INtEnz database.

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Risultati

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Abbiamo osservato un aureo caratteristico che circonda il pellet di perle nel campione CL, nel punto di lavaggio 4.3 con il tampone di lavaggio 2 ( figura 1B ). Anche se non è stato studiato, questo fenomeno può probabilmente essere spiegato dall'interferenza dei complessi mRNP reticolati con l'aggregazione del branco durante la cattura magnetica, causando un aggregato più diffuso. Indica che la cattura di bead di oligo-d (T) 25 è stata efficace <...

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Discussione

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Abbiamo applicato con successo la cattura di interazione di mRNA, sviluppata per le cellule di lievito e umano, per protoplasti di mesofila a foglia vegetale. Le cellule mezofiliche dei fogli sono il principale tipo di tessuto a base di foglie vegetali. Il principale vantaggio di questo metodo è che utilizza in-vivo incrociando per scoprire le proteine ​​da un ambiente fisiologico.

In questo protocollo, abbiamo principalmente presentiamo una serie di condizioni sperimentali ottimizz...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Riconosciamo il laboratorio del Prof. Joris Winderickx, che ha fornito l'apparecchio di reticolazione UV equipaggiato con la lampada UV convenzionale. KG è supportato dal fondo di ricerca KU Leuven e riconosce il sostegno della sovvenzione FWO G065713N.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
REAGENTI
0,8 M MannitoloSigmaM1902-500GSoluzione enzimatica isotonica primaria &
soluzione di MMg
2 M KClMERCKArt. 4935Soluzione enzimatica isotonica primaria &
tampone W5
0,2 M MES (pH 5,7)
(acido 4-morfolineetansolfofonico)		Sigma-aldrichM2933Soluzione enzimatica isotonica primaria,
tampone W5 &
soluzione MMg,
Filtrazione sterilizzazione
Cellulasi R10Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.CELLULASI
" ONOZUKA"
R-10, 10 g		Soluzione enzimatica isotonica finale
Macerozyme R10Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.MACEROZYME R-10, 10gSoluzione enzimatica isotonica finale
10% (w/v) BSA
(Albumina sierica bovina)		Sigma-aldrichA7906-100GSoluzione enzimatica isotonica finale &
Sterilizzazione a filtrazione
1 M CaCl2Chem-Lab NVCL00.0317.1000Soluzione enzimatica isotonica finale,
tampone W5 &
Tampone di digestione
1 M NaClFisher ChemicalS/3160/60W5 tampone
2 M MgCl2SigmaM8266-100GMMg soluzione
1 M LiCl
(cloruro di litio)		Acros199885000Tampone di lisi/legante,
Tampone di lavaggio 1,
Tampone di lavaggio 2 &
Tampone a basso contenuto di sale
5% (w/v) LiDS
(solfato di dodecil di litio)		Sigma-aldrichL4632-25GTampone di lisi/legante,
Tampone di lavaggio 1 &
Sterilizzazione a filtrazione
1 M DTT
(Ditiotreitolo)		Thermo Fisher Scientific
Tampone di lavaggio 1 &
Tampone di lavaggio 2		307866Tampone di lisi/legante,
1 M Tris-HCl (pH 7,5) (Tris(idrossimetil)amminometano, acido cloridrico S.G. (HCl))Acros &
Fisher Chemical		167620010 &
H/1200/PB15		Tampone di lisi/legante,
Tampone di lavaggio 1,
Tampone di lavaggio 2,
Tampone a basso contenuto di sale &
tampone di eluizione
0,5 M EDTA (pH 8,0) (acido etilendiamminotetraacetico)Sigma-aldrichED-500GTampone di lisi/legante,
Tampone di lavaggio 1,
Tampone di lavaggio 2,
Tampone a basso contenuto di sale &
Tampone di eluizione
Tween 20MERCK8.22184.0500Rigenerazione di oligo-d(T)25 perle
0,1 M NaOHVWR PROLABO CHEMICALS28244.295Rigenerazione di oligo-d(T)25 perle
1x PBS (pH 7,4)
(soluzione salina tamponata con fosfato)
contenente
(NaCl; Kcl; Na2HPO4; KH2PO4)		Fisher Chemical, MERCK,
Sigma-aldrich & SAFC		S/3160/60,
Art. 4935,
71640-250G &
60230		Rigenerazione di perle di oligo-d(T)25
Soluzione di proteinasi K (2 μ g/μ L)Thermo Fisher Scientific11789020Digestione delle proteine
Colorante di caricamentoInvitrogenLC5925SDS-PAGE
qPCR master mixPromegaA6001qRT-PCR test
RNase CocktailThermo Fisher ScientificAM2286Digestione dell'RNA
MetanoloSigma-aldrich322415Fissazione del gel e decolorazione del gel
Acido aceticoSigma-aldrich537020Fissazione su gel e decolorazione su gel
Coomassie Brilliant Blue R-250Thermo Fisher Scientific20278Colorazione su gel
1 M NH4HCO3
(Bicarbonato di ammonio)
 		Sigma-aldrich09830-500GGel idratazione &
Tampone per digestione
CH3CN
(Acetonitrile)		Sigma-aldrich34851-100MLGel disidratazione &
Soluzione di dissoluzione di peptidi
IAA
(Acido iodoacetico)		Sigma-aldrichI4386-10GAgente alchilante
TFA
(Acido trifluoroacetico)		Sigma-aldrich302031-10X1MLSoluzione di dissoluzione di peptidi
FA
(Acido formico)		Sigma-aldrich06554-5GEstrazione di peptidi
Soluzione di tripsina (6 ng/μ L)PromegaV5280Tampone di digestione
NomeAziendaNumero di catalogoComments
EQUIPMENT
SoilPeltracomLP2DCrescita delle piante
Vermiculite 3Sibli AS05VERMICULIETla crescita delle piante
(150 x 20 mm)Sarstedt82.1184.500Supporto per sospensione protoplasto
0,22 μ m filtroMilliporeSE2M229104Omogeneizzazione della soluzione enzimatica isotonica finale
RazorbladeAgar ScientificT585Rosetta foglie strisce
35-75 μ m rete in nylonSEFAR NITEX74010Protoplast sospensione filtrazione
50 mL provette a fondo tondoSigma-aldrichT1918-10EACarrier per protoplasto sospensione
Emocitometro
(Bü 		MARIENFELD650030Protoplast conteggio delle cellule
Apparecchio di reticolazione UV
(HL-2000 HybriLinker)		UVP, LLCUVP95003101in vivo
UV
(Sankyo-Denki G8T5)		SANKYO
DENKI		SD G8T5in vivo Siringa di
vetro UV da 50 mLFORTUNA OptimaZ314560Omogeneizzazione del lisato di protoplasti
Ago stretto (0,9 x 25 mm)Becton Dickinson microlance 32021-04Omogeneizzazione del lisato di protoplasti
Rotatore Modello L26Labinco BV26110912Incubazione del campione mediante
rotazione Oligo-d(T)25 biglie magnetiche
(5 mg/mL)		New England BioLabsS1419SmRNP e legame di mRNA e pull-down
Rack magneticoInvitrogenCS15000legame e pull-down di mRNP e mRNA
Unità filtranti centrifughe
(unità filtranti centrifughe Amicon Ultra-4)		EMD MilliporeUFC800308concentrazione di mRBP
Pierce Silver Stain KitThermo Fisher Scientific24612saggio di colorazione dell'argento

(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)		la purificazione dell'RNA1064100300STRATEC
(spettrofotometro NanoDrop 1000)Thermo Fisher ScientificND-1000RNA qualità e quantità
Cycler PCR in tempo reale
(cycler PCR in tempo reale StepOne)		Quantificazione del cDNAThermo Fisher Scientific4376600
µ-colonne C18
(Millipore Zip Tip & micro		Sigma-aldrich720046-960EApurificazione dei peptidi

(spettrometro di massa Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap)		Thermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMAZRbasata sulla spettrometria di massa
(strumento per cromatografia liquida ad altissime prestazioni (UHPLC) Ultimate 3000)Thermo Fisher ScientificULTIM3000RSLCNANOProteomica basata sulla spettrometria di massa
C18 colonna
(Easy Spray Pepmap RSLC C18 colonna)		Thermo Fisher ScientificES800Proteomica basata sulla spettrometria di massa
C18 precolonna
(Acclaim Pepmap 100 C18 precolonna)		Thermo Fisher Scientific160321Proteomica basata sulla spettrometria di massa
Name AziendaNumero di catalogoComments
Primers for qRT-PCR assaySequences<
em>UBQ10 mRNA
(Li et al., 2014)		Fw: AACTTTGGTGGTGTGTTGG
Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA
18S rRNA
(Durut et al., 2014)		Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG
Rv: CACGACCCGGCCAATTA
Piastra di Petri per Lampada UV di reticolazione Kit di purificazione dell'RNA con Dispositivo spettrofotometro per molecolare Spettrometro di massa per Strumento per cromatografia liquida

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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