Articolo metodologico

PCR di fusione ad alta risoluzione per il recettore del complemento 1 lunghezza di polimorfismo Genotipizzazione: uno strumento innovativo per la malattia di Alzheimer Valutazione sulla suscettibilità dei geni

DOI:

10.3791/56012

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18 luglio 2017

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1Department of Immunology, Reims University Hospitals, Robert Debré Hospital, 2Faculty of Medicine, LRN EA 4682, University of Reims Champagne-Ardenne, 3Department of Internal Medicine and Geriatrics, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 4Faculty of Medicine, EA 3797, University of Reims Champagne-Ardenne

In questo articolo

Sommario

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Qui descriviamo un metodo innovativo per determinare i polimorfismi di lunghezza del recettore del recettore 1 (CR1) per l'uso in diverse applicazioni, in particolare la valutazione della suscettibilità a malattie come la malattia di Alzheimer (AD). Questo metodo potrebbe essere utile per comprendere meglio il ruolo delle isoforme CR1 nella patogenesi dell'AD.

Abstract

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Il recettore complementare 1 (CR1), una glicoproteina transmembrana che svolge un ruolo chiave nel sistema immunitario innato, è espressa in molti tipi di cellule, ma in particolare nei globuli rossi (RBCs). Come un recettore per i componenti complementari C3b e C4b, CR1 regola l'attivazione della cascata del complemento e promuove la fagocitosi di complessi immunitari e detriti cellulari, nonché il peptide beta-amiloide (Aβ) nella malattia di Alzheimer (AD). Diversi studi hanno confermato i polimorfismi singoli nucleotidi associati ad AD (SNPs), nonché una variazione di numero di copia (CNV) nel gene CR1 . Qui descriviamo un metodo innovativo per determinare il polimorfismo di lunghezza del recettore CR1. Il recettore comprende tre domini, chiamati lunghi omologhi ripetizioni (LHR) -LHR-A, LHR-C e LHR-D e un dominio n, LHR-B, dove n è un intero compreso tra 0 e 3. Utilizzando una singola coppia Di primer specifici, il materiale genetico viene utilizzato per amplificare un primo frammento del dominio LHR-B (thE l'amplicone B) e un secondo frammento del dominio LHR-C (l'amplicone invariante). L'amplicone B e l'amplicone invariante presentano differenze a cinque nucleotidi al di fuori delle aree di ibridazione di detti primer. I numeri di ampliconi B e degli ampliconi invarianti vengono dedotti utilizzando uno strumento quantitativo (curve di fusione ad alta risoluzione (HRM)) e il rapporto tra l'amplicone B e l'amplicone invariante differisce in base al polimorfismo della lunghezza CR1. Questo metodo offre diversi vantaggi rispetto al metodo del fenotipo canonico, in quanto non richiede materiale fresco ed è più economico, più veloce e quindi applicabile a popolazioni più grandi. Pertanto, l'uso di questo metodo dovrebbe essere utile per comprendere meglio il ruolo delle isoforme CR1 nella patogenesi delle malattie come AD.

Introduzione

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L'AD, la causa più comune di demenza, colpisce più di 30 milioni di persone in tutto il mondo ed è un grave problema di sanità pubblica 1 . Clinicamente, l'AD è caratterizzata da disturbi neurocognitivi che portano ad una progressiva perdita di autonomia 2 . L'AD è caratterizzato da due distintivi neuropatologici, vale a dire i depositi amiloidi extracellulari e i tangoli neurofibrillari intracellulari 3 .

Tradizionalmente, secondo l'età dell'insorgenza della malattia, l'AD è classificata in due forme. In primo luogo è l'inizio precoce AD ​​(EOAD), dove l'inizio si verifica più spesso prima dell'età di 65 anni; Questo modulo rappresenta meno del 5% dei casi AD. È una rara forma autosomica dominante dell'AD, che produce mutazioni completamente penetranti sia nella proteina del precursore amiloide ( APP) 4 , in presenilina 1 ( PSEN1 ) 5 , sia in presenilina 2 ( PSEN2 )> 6 geni. In secondo luogo, la forma più comune della malattia (> 90% dei casi AD) è chiamata AD sporadica (LOAD) "sporadica" e più spesso si verifica nei soggetti di età compresa tra i 65 anni. Risulta da molti fattori di rischio genetici e ambientali 7 . In LOAD, il 4 allele del gene apolipoproteina E ( APOE ) è il principale fattore di rischio genetico 8 , 9 . Inoltre, più di 20 loci genici sono stati identificati da studi di associazione genome-wide (GWAS) come associati con il rischio di AD, una delle quali è la componente del complemento (3b / 4b) del recettore 1 (CR1) gene 10, situato Cromosoma 1q32 in un cluster di proteine ​​correlate al complemento. Il gene CR1 codifica la proteina del recettore del complemento tipo 1 (CR1), un componente dei regolatori di attività complementare.

CR1 (il recettore C3b / C4b, CD35), una glicoproteina transmembrana di approximatEly 200 kDa 11 , si lega al C3b, C4b, C3bi, C1q, alla lectina legante manna (MBL) e alle proteine ​​complementari di ficolina 12 . La funzione biologica di CR1 varia con i tipi di cellule in cui viene espresso. Nell'uomo, il 90% della CR1 circolante totale si trova nei globuli rossi (RBC) 13 . Presente alla superficie di RBC, CR1 si lega ai microrganismi o ai complessi immunitari C3b- o C4b-opsonizzati, facilitando la loro clearance dalla circolazione. I complessi legati a CR1 sono infatti trasferiti a fagociti quando i RBC attraversano il fegato e la milza 11 , 14 . Limitando la deposizione di C3b e C4b, CR1 potrebbe prevenire l'attivazione eccessiva del complemento. Pertanto l'espressione di CR1 sui RBC è considerata un elemento essenziale nella protezione dei tessuti, come il sistema nervoso cerebrale, contro la deposizione del complesso immunitario e le malattie risultanti. Il CR1 su RBC è anche notoSvolgono un ruolo importante nell'infezione patogena 15 , 16 . Inoltre, CR1, come elemento chiave nell'immunità innata, è coinvolto nella regolazione della cascata di complemento e nel trasporto e nella clearance dei complessi immunitari. CR1 esercita questa attività vincolando i frammenti C3b e C4b e dissociando convergenze classiche e alternative (dissociazione di C2a dal complesso C4b2a e dissociazione di C3b dal complesso C3bBb). Come cofattore del fattore di proteina della serina plasmatica I (FI), CR1 inibisce i percorsi di complemento classico e alternativo aumentando la scissione di C4b e C3b da FI, una proprietà nota come attività cofattore (CA) e inibendo l'anello di amplificazione C3 , A sua volta impedisce l'ulteriore attivazione del complemento. Rogers e colleghi dimostrano che il peptide Aβ può legare e attivare il percorso del complemento in assenza di anticorpi 17 e suggerisce che il peptide Aβ sia clEared dalla circolazione tramite adesione complementare a CR1 espressa su RBCs 18 .

CR1 presenta tre tipi di polimorfismi: polimorfismi strutturali o lunghi, polimorfismi di densità e polimorfismi del gruppo ematico di Knops 11 , 19 . Il polimorfismo strutturale è legato a una variazione del numero di lunghe ricerche omologhe (LHRs) e quindi definisce quattro isoforme. Infatti, il dominio extracellulare della proteina CR1 è composto da una serie di unità ripetitive, chiamate ripetizioni di consenso brevi (SCR) o ripetizioni di controllo complementare (CCPs). Questi SCR sono stati dimostrati dall'acido deossiribonucleico complementare (cDNA) che codifica CR1. Gli SCR sono disposti in gruppi tandem di sette, conosciuti come LHR. CR1 è disposto in quattro LHR, designati come LHR-A, -B, -C e -D, derivanti dalla duplicazione di una unità a sette SCR 19 , 20 ,21 .

In ordine crescente di frequenza, queste isoforme CR1 determinate da Western blot (WB) sono CR1 * 1 (A / F) (migrazione rapida sull'elettroforesi a gel), CR1 * 2 (B / S) (migrazione lenta sull'elettroforesi a gel), CR1 * 3 (C / F`) e CR1 * 4 (D). Le due isoforme più comuni, CR1 * 1 (A / F) e CR1 * 2 (B / S), sono composte da quattro e cinque LHR rispettivamente, mentre CR1 * 3 (C / F`) e CR1 * 4 ) Sono composti da 3 e 6 LHR rispettivamente. L'isoforma più comune (CR1 * 1), composta da 30 SCR, contiene tre siti di legame C4b (SCRs 1-3, 8-10 e 15-17) e due siti di legame C3b (SCRs 8-10 e 15-17) , Mentre i SCR 22-28 legano C1q, ficolini e MBL 12 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 . Così, CR1 * 2 contiene un ulteriore sito di rilegatura C3b / C4bD a CR1 * 1. La figura 1 illustra le strutture, le nomenclature ei pesi molecolari delle quattro diverse isoforme di CR1.

Il polimorfismo di densità corrisponde a un fenotipo stabile che rappresenta il livello dell'espressione costitutiva di CR1 sulle RBCs. Nei soggetti caucasici sani è stato dimostrato che il numero di molecole CR1 per RBC può variare fino ad un fattore di dieci (variabili da 150 a 1.200 molecole per cella) 26 . RBC del fenotipo Helgeson hanno una bassissima densità CR1, che ha dimostrato di essere inferiore a 150 molecole per cella 27, 28. La densità CR1 su RBC è geneticamente associata ad un sistema biallelico autosomico codominante sul gene CR1 , correlato con un polimorfismo di lunghezza del frammento di restringimento Hin dIII (RFLP) 29 . Una mutazione a punto singolo in Intron 27 del gene CR1, tra gli esoni che codificano il secondoSCR in LHR-D, ha come risultato la generazione di un sito polinormale Hin dIII all'interno di questa regione 30 . I frammenti Genomic Hin dIII di 7,4 e 6,9 ​​kDa identificano alleles associati ad alta (H allele) o bassa densità (L allele) CR1 sulle RBC rispettivamente. Tuttavia, non è stata riscontrata alcuna correlazione tra la densità CR1 nei polmorfismi di RBC e Hin dIII in alcune popolazioni dell'Africa occidentale 31 , 32 . Il meccanismo che collega la regolazione della densità CR1 ad un polimorfismo Hin dIII non codificato rimane sconosciuto. Tra diversi polimorfismi, Q981H in SCR16 e P1786R in SCR28 sono stati riportati per essere collegati alla densità CR1 sulle RBC 30 , 33 .

Il polimorfismo Knops (KN), secondo la nomenclatura internazionale, è il sistema di 22 gruppi di sangue da indicizzare dalla Società Internazionale di Trasfusione di Sangue. Contiene 9 specie antigenicheCifre espresse dal CR1 su RBC, incluse tre coppie antigeniche antitetiche KN1 / KN2, KN3 / KN6 e KN4 / KN7, nonché 3 antigeni isolati KN5, KN8 e KN9. I KN1, KN3, KN4 e antigeni KN5 sono antigeni ad alta frequenza del sistema KN (cioè, espresso in più del 99% della popolazione generale). Tuttavia, il ruolo di questo polimorfismo in AD deve ancora essere determinato 13 .

Il protocollo descritto in questo lavoro è stato progettato per determinare i genotipi di polimorfismo di lunghezza CR1 coinvolti nella suscettibilità a diverse malattie, come AD, lupus eritematoso sistemico e malaria. Il nostro metodo per la determinazione del polimorfismo di lunghezza CR1 approfitta del numero di LHR-B che comprendono le isoforme CR1 e delle differenze di sequenza tra LHR-B e LHR-C ( Figura 2 ).

Protocollo

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Il protocollo per la raccolta e la manipolazione del sangue umano è stato riesaminato e approvato dal comitato di etica regionale (CPP Est II) e il numero del protocollo è 2011-A00594-37.

NOTA: Il seguente protocollo descrive la manipolazione del sangue umano. Si prega di seguire le istruzioni istituzionali, smaltendo di materiale bio-hazardous. Devono essere indossate attrezzature di sicurezza del laboratorio, come cappotti di laboratorio e guanti. Un diagramma di flusso che descrive il protocollo è visualizzato in Figura 3 .

1. Estrazione del DNA del sangue e del corpo fluido

  1. Pipettare 20 μL di proteinasi K (15 μg / μL) nel fondo di un tubo da 1,5 ml.
  2. Aggiungere 200 μL di campione al tubo da 1,5 ml. Utilizzare fino a 200 μL di sangue intero, plasma, siero, buffy coat o fluidi corporei o fino a 5 x 10 6 linfociti in 200 μL di PBS.
  3. Aggiungere 200 μl di tampone di lisi al campione. Mescolare per vortex di impulsi per 15 s.
  4. Incubare a 56 ° C per 10 minuti in un bagno d'acqua.
  5. Centrifugare brevemente il tubo da 1,5 ml per rimuovere le gocce dall'interno del coperchio.
  6. Aggiungere 200 μL di etanolo (96-100%) al campione e mescolare nuovamente per vorticamento a impulsi per 15 s. Dopo la miscelazione, centrifugare brevemente il tubo da 1,5 ml per rimuovere le gocce dall'interno del coperchio.
  7. Applicare con cautela la miscela dal punto 1.6 alla colonna di membrana (in un tubo di raccolta da 2 mL). Senza bagnare il cerchio, chiudere il tappo e centrifugare a 6000 xg per 1 minuto. Posizionare la colonna di membrana in un tubo di raccolta pulito da 2 ml e scartare il tubo contenente il filtrato.
  8. Aprire con cautela la colonna della membrana e aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio 1 senza bagnare il cerchio. Chiudere il tappo e centrifugare a 6000 xg per 1 minuto. Posizionare la colonna di membrana in un tubo di raccolta pulito da 2 ml e scartare il tubo contenente il filtrato.
  9. Aprire con cautela la colonna della membrana e aggiungere 500 μL di tampone di lavaggio 2 senza bagnare la tBordo. Chiudere il tappo e centrifugare alla massima velocità (20.000 xg) per 3 minuti.
  10. Posizionare la colonna di membrana in un nuovo tubo di raccolta da 2 ml e scartare il tubo di raccolta con il filtrato. Centrifugare a 20.000 xg per 1 min.
  11. Posizionare la colonna di membrana in un tubo pulito da 1,5 ml e scartare il tubo di raccolta contenente il filtrato.
  12. Aprire con cautela la colonna della membrana e aggiungere 200 μL di acqua distillata. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti e poi centrifugare a 6000 xg per 1 min.
  13. Procedere alla determinazione della fase di concentrazione del DNA o congelare i campioni di DNA a -20 ° C

2. Determinazione della concentrazione del DNA

NOTA: Vedere la Figura 4 .

  1. Premere 1 per selezionare la modalità DNA su uno spettrofotometro. Selezionare una lunghezza del percorso di 5 mm usando le frecce sinistro e destro. Selezionare un fattore di diluizione 1 utilizzando le frecce di sinistra e di destra.
  2. Selezionare l'unità (μg / mL) usando thE frecce di sinistra e di destra. Selezionare un fattore di 50 utilizzando le frecce di sinistra e di destra. Premere OK .
  3. Pipettare 10 μL di acqua distillata nella cuvetta. Mettere la cuvetta nello spettrofotometro. Premere il pulsante OA / 100% T.
  4. Pipettare 10 μL del campione di DNA (1/4 diluizione in acqua distillata) nella cuvetta. Mettere la cuvetta nello spettrofotometro. Premere il pulsante verde (lettura / avvio). Si noti la concentrazione.
  5. Freeze il campione di DNA a -20 ° C.

3. Protocollo HRM-PCR

  1. Scuotere i campioni del DNA. Diluire i campioni di DNA in tubi da 1,5 ml con acqua per adattarli ad una concentrazione di 10 ng / μL
    NOTA: Il volume totale del DNA diluito deve essere compreso tra 2 μL e 10 μL.
  2. Scongelare le soluzioni primer. Diluire le soluzioni primer in tubi da 1,5 ml con acqua per adattarle alla stessa concentrazione di 6 μM.
    NOTA: Le sequenze di primer e le condizioni di reazione sono fornite in TIn grado 1.

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Tabella 1: Primer e parametri utilizzati nell'analisi di fusione ad alta risoluzione.

  1. Sciogli le soluzioni HRM-PCR e mescolate attentamente vortexando per assicurare il ripristino di tutti i contenuti. Brevemente girare le tre fiale contenenti la miscela enzimatica con DNA colorante legante, MgCl 2, e l'acqua in una microcentrifuga prima di aprirli. Conservare a temperatura ambiente.
  2. In un tubo da 1,5 mL a temperatura ambiente, preparare il mix PCR per una reazione di 20 μl aggiungendo i seguenti componenti nell'ordine elencato di seguito:
    1. 10 μl di miscela enzimatica con colorante legante del DNA;
    2. 2 ml di 25 mM MgCl 2;
    3. 1 μl di primer 1, 6 μM (concentrazione finale: 300 nM);
    4. 1 μl di primer 2, 6 μM (concentrazione finale: 300nM); e
    5. 5 μl di acqua.
      NOTA: per preparare il mix PCR per più di una reazione, moltiplicare i volumi sopra indicati per il numero di reazioni da eseguire, più una reazione aggiuntiva.
  3. Mescolare accuratamente vorticando.
  4. Pipettare 19 μL di miscela PCR, preparata sopra, in ciascun pozzetto di una piastra bianca multipla.
  5. Aggiungere 1 μl di template di DNA ad elevata concentrazione, preparato al punto 3.1.
    NOTA: per le reazioni di controllo, eseguire sempre un controllo negativo con i campioni. Per preparare un controllo negativo, sostituire il template DNA con acqua.
  6. Sigillare la piastra bianca multifilo con foglio di tenuta.
  7. Posizionare la piastra bianca multipla nella centrifuga e bilanciarla con un adeguato contrappeso ( cioè un'altra piastra multietnica). Centrifugare per 1 min a 1.500 xg in una centrifuga standard con swing-bucket contenente un rotore per piastre multivibranti con appositi adattatori.
  8. Caricare la piastra bianca multifunzione nello strumento HRM-PCR.
  9. Avviare il programma HRM-PCR con le seguenti condizioni di PCR:

    Denaturazione: 95 ° C per 10 min; 1 ciclo.
    Amplificazione: 95 ° C per 10 s, 62 ° C per 15s e 72 ° C per 20s; 47 cicli.
    Curva di fusione: 95 ° C; Velocità di rampa: 0,02 ° C / s; 25 acquisizioni per ° C; 1 ciclo.
    Raffreddamento: 40 ° C per 30 s; Velocità di rotazione 2,2 ° C / s; 1 ciclo.

4. Analisi HRM per determinare il polimorfismo della lunghezza CR1

NOTA: La metodologia descritta ( figura 5 ) è specifica del nostro software (vedere la tabella dei materiali ), sebbene possono essere utilizzati altri pacchetti software.

  1. Aprire un software di scansione genica per eseguire l'analisi di scansione del polimorfismo della lunghezza CR1.
  2. Aprire l'esperimento contenente il programma di amplificazione e il programma di curva di fusione.
  3. Fare clic su Editor campione nella barra Modulo e quindi selezionare SCanning workflow .
  4. Definire le proprietà dei campioni ( vale a dire, nome, controllo ignoto o negativo).
  5. Fare clic su Analisi nella barra Modulo .
  6. Nell'elenco Crea nuova analisi , selezionare Gene Scanning.
  7. Fare clic sulla scheda Normalizzazione per normalizzare le curve di fusione.
  8. Fare clic sulla linguetta di spostamento della temperatura per azzerare l'asse della temperatura (asse x) delle curve di fusione.
    NOTA: Il grafico inferiore mostra le curve di fusione sia normalizzate che spostate in temperatura.
  9. Fai clic sul pulsante Calcola per analizzare i risultati e determinare il raggruppamento.
  10. Fare clic sulla scheda Plot di differenza nell'area grafici per visualizzare le curve di fusione normalizzate e spostate e il diagramma di differenza normalizzato e temperato .

Risultati

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La Figura 6 A mostra la fenotipizzazione del polimorfismo di lunghezza CR1 da parte di WB. La Figura 6 B e C illustrano le curve ottenute durante l'analisi HRM-PCR, consentendo la determinazione del polimorfismo della lunghezza CR1. L'analisi delle curve di fusione usando il software dopo la fusione ad alta risoluzione degli ampliconi derivanti da PCR dal DNA genomico di soggetti con differenti isoforme CR1 produce curve che discriminano i soggetti in base ai loro fenotipi di espressione CR1 allotipici.

La Figura 6 B mostra una prima modalità di presentazione, chiamata "Curve di fusione normalizzate e spostate", mentre la Figura 6 C mostra una seconda modalità di presentazione, chiamata "Plot di Differenza Normalizzata e Temp-Spostata".

Figura 6 A : (CR1 * 3, CR1 * 1); (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; E (CR1 * 2, CR1 * 4). Ciò consente la genotipizzazione del polimorfismo di lunghezza CR1 utilizzando questo nuovo metodo di biologia molecolare.

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Figura 1: Rappresentazione schematica della struttura e polimorfismi della proteina del recettore 1 del complemento. Ogni breve ripetizione di consenso (SCR) o complemento di controllo di controllo (CCP) è rappresentata da un cerchio. Gli SCR sono raggruppati in strutture ripetitive e di ordine superiore chiamate LHR. Dal dominio extracellulare alla membrana cellulare, i LHR sono: LHR-A, -B, -C, -D e -S (LHR supplementari o addizionali). Nella più comune isoforma CR1(CR1 * 1), il sito di legame C4b / decadimento accelerante (DAA) è localizzato a LHR-A (SCRs 1-3, cerchi verdi), il sito di legame di attività C3b / C4b / cofattore (CA) si trova nel 3 Le SCRs di N-terminale di LHR-B (SCRs 8-10, cerchi rossi) e LHR-C (SCRs 15-17, cerchi viola) e il sito di legame per C1q / MBL e ficolina si trovano nel LHR-D 22-28, cerchi blu). Le strutture omologhe sono colorate in modo identico. L'isoforma CR1 * 2 (S) presenta un ulteriore LHR (LHR-S) e quindi contiene un ulteriore sito di legame C3b / C4b. KDa, kilodalton. NRC, condizioni non ridotte. RC, condizioni ridotte. TM, dominio transmembrane. Questa figura è stata adattata da Brouwers et al. 36 con l'autorizzazione del Nature Publishing Group. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2 : Rappresentazione schematica della struttura isoforme CR1 con posizioni di amplicon di sequenze ottenute da HRM-PCR. Ogni casella rappresenta un SCR. Gli SCR sono raggruppati in LHR: LHR-A, -B, -C e -D. Le strutture omologhe sono colorate in modo identico. Le isoforme CR1 * 2 e CR1 * 4 presentano LHR supplementari (LHR-B) e contengono quindi un'area di amplicon aggiuntiva (amplicon B, in rosso). CR1 * 3 manca di LHR-B e contiene meno amplicon (mancanza di amplicon B). Le differenze nucleotidiche tra l'amplicone B (196 bp) e l'amplicone invariante (197 bp) sono rappresentate rispettivamente in rosso e in blu. Le differenze nel rapporto: (amplicon B, in amplicone rosso / invariante, in blu) tra ciascuna isoforma CR1 sono determinate dal HRM-PCR, che permettono la genotipizzazione. Le sequenze di primer CN3 e CN3re sono sottolineate. TM, dominio transmembrane. CYT, coda citoplasmatica.Pg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Diagramma di flusso del protocollo per la genotipizzazione del polimorfismo di lunghezza CR1 da campioni di sangue umano. Raccogliere un campione di DNA umano. Estrarre il DNA per ottenere un campione di sangue del DNA. Determinare la concentrazione del DNA e diluire per ottenere la concentrazione del DNA a 10 ng / μL. Usa HRM-PCR per ottenere il genotipo del polimorfismo di lunghezza CR1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4 : Schermate dello spettrofotometro noi Per determinare la concentrazione del DNA. Premere 1 ( A ) per selezionare la modalità del DNA sullo spettrofotometro. Selezionare una lunghezza del percorso di 5 mm ( B ) usando le frecce sinistro e destro ( C ). Selezionare l'unità (μg / mL) ( D ) usando le frecce sinistro e destro ( C ). Selezionare il fattore di diluizione 1 ( E ) utilizzando le frecce sinistro e destro ( C ). Selezionare un fattore di 50 ( F ) utilizzando le frecce di sinistra e di destra. Premere OK ( G ). Pipettare 10 μL di acqua distillata nella cuvetta. Mettere la cuvetta nello spettrofotometro ( H ). Premere il tasto OA / 100% T ( I ). Pipettare 10μl di campione di DNA (1/4 di diluizione in acqua distillata) nella cuvetta. Mettere la cuvetta nello spettrofotometro ( K ). Premere il pulsante verde (lettura / avvio) ( L ). Si noti la concentrazione ( M ).Es / ftp_upload / 56012 / 56012fig4large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Schermate dell'interfaccia grafica del software utilizzato nel passaggio 4 del protocollo. ( A ) Aprire il software di scansione del gene. ( B ) Programma di amplificazione e curva di fusione. ( C ) Fare clic su Editor di esempio nella barra dei moduli . ( D ) Selezionare Scansione . ( E ) Definire le proprietà dei campioni. ( F ) Fare clic su Analisi nella barra Modulo . ( G ) Fare clic sulla scheda Normalizzazione per normalizzare le curve di fusione. ( H ) Fare clic sulla scheda Traslazione temperatura per mostrare le curve di fusione che sono entrambeNormalizzato e spostato in temperatura. ( I ) Fare clic sul pulsante Calcola per analizzare i risultati e determinare il raggruppamento. ( J ) Fare clic sulla scheda Plot di differenza per visualizzare le curve di fusione normalizzate e spostate e il diagramma di differenza normalizzato e temperato . ( K ) raggruppamento colorato dei campioni in base ai genotipi di lunghezza CR1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Fenotipizzazione dei polimorfismi della lunghezza CR1 osservata nel WB e loro corrispondenti curve di profilo ottenute da HRM-PCR. ( A ) Fenotipizzazione dei polimorfismi di lunghezza CR1 utilizzando WB. ( B C ) Genotipizzazione dei polimorfismi di lunghezza CR1 utilizzando l'analisi HRM-PCR. L'analisi della curva HRM di ampliconi PCR ottenuti dal DNA genomico di soggetti che mostrano diverse isoforme CR1 ha determinato l'identificazione di profili curvi specifici: (CR1 * 3, CR1 * 1) (viola); (CR1 * 1, CR1 * 2) (azzurro); CR1 * 1 (verde); CR1 * 2 (rosso); E (CR1 * 2, CR1 * 4) (grigio). Questi corrispondono agli alleli del polimorfismo di lunghezza CR1. Come mostrato dai due modi di presentazione - "Curve di fusione normalizzate e spostate" (B) e "Differenze di livello normalizzate e temporanee" (C) - i profili della curva sono distribuiti in base al (CR1 * 3, CR1 * 1) ; (CR1 * 1, CR1 * 2); CR1 * 1; CR1 * 2; E (CR1 * 2, CR1 * 4). Questa figura è stata adattata da Mahmoudi et al. 38 con l'autorizzazione di Elsevier. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

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Qui descriviamo una metodologia ampiamente accessibile per studiare polimorfismi di lunghezza CR1. Le tecniche di biologia molecolare per l'amplificazione o l'ibridazione segmentale non hanno mai potuto dare risultati soddisfacenti che consentano la determinazione dei polimorfismi di lunghezza CR1 in tutti gli individui. Ciò è dovuto alla struttura ripetitiva del gene CR1 ( cioè i SCRs di CR1 altamente ripetitivi). Il metodo di biologia molecolare qui descritto sfrutta la distribuzione quantitativa di LHR-B nella molecola CR1. La molecola CR1 comprende n domini LHR-B, dove n è un numero compreso tra 0 e 3 e solo un dominio LHR-C, come descritto e illustrato nella figura 2 . Il rilevamento quantitativo di dominio B consente di discriminare perfettamente un dominio aggiuntivo o mancante B.

Dal materiale genetico estratto, un primo frammento di DNA di LHR-B viene amplificato mediante PCR usando un singolo paio di primer specifici, rappresentanoUna variante caratteristica di LHR-B chiamata "amplicon variante B." Viene inoltre amplificato un secondo frammento di DNA, chiamato "amplicon invariante" e appartenente a LHR-C. Questo secondo frammento di DNA è un frammento di LHR-C, ma un altro frammento invariante di LHR-A o -D potrebbe anche essere utilizzato.

I due frammenti di DNA, l'amplicone variante B e l'amplicone invariante, sono amplificati dagli stessi primers e presentano cinque differenze nelle sequenze di nucleotidi. Questa caratteristica rende possibile nella fase successiva determinare il numero dell'amplicone variante B e il numero di ampliconi invarianti utilizzando uno strumento quantitativo di biologia molecolare, HRM, che è stato adattato a questo scopo. Il rapporto tra il numero di amplicon B e l'amplicone invariante (rapporto: amplicon B / amplicon invariante) varia in funzione della lunghezza della molecola CR1. Infatti, CR1 * 4 visualizza 3 unità di amplicon B a 1 amplicon invariante, CR1 * 2 visualizza 2 unità di amplicon B a 1 amplicone invariante, CR1 * 1 visualizza 1 amplicone B ad 1 amplicone invariante e CR1 * 3 visualizza 0 unità di amplicon B a 1 amplicon invariante ( Figura 2 ). Così, questo metodo HRM-PCR consente la genotipizzazione del polimorfismo della lunghezza CR1.

Tuttavia, all'inizio dello studio, questa tecnica richiede l'uso di soggetti di riferimento i cui fenotipi CR1 sono già noti ( vale a dire precedentemente stabiliti da WB) per poter stabilire la genotipizzazione di CR1 in base al profilo di riferimento delle curve ottenute Da HRM-PCR. Sono disponibili due tipi di rappresentazione, vale a dire "Curve di fusione normalizzate e spostate" e "Differenze di livello normalizzate e temporanee". Esse presentano gruppi distinti di profili di curva colorati secondo la fenotipizzazione polimorfica di lunghezza CR1 ottenuta da WB ( Figura 6 ). Dalla "step Normalized and Shifted Melting Curves", il nostro metodo consente di discriminare il thGruppi distinti di curve corrispondenti alle isoforme di CR1, raggruppate per colore. Tuttavia, il "Differenziale Plot Normalizzato e TEMP", che corrisponde ad una diversa rappresentazione matematica, consente di visualizzare più facilmente i distinti gruppi di curve. Sebbene il software del produttore venisse utilizzato in modo rutile in questo studio, altri software (ad esempio uANALYSE) potrebbero essere utilizzati come programma di estrazione dati per l'analisi della curva.

Ad oggi la tecnica di analisi WB è la tecnica originale che consente di identificare i differenti polimorfismi della lunghezza CR1 a livello della proteina. Tuttavia, questa tecnica presenta numerosi svantaggi. In particolare, l'analisi proteica da WB può essere fatta solo dopo l'estrazione delle membrane cellulari. Di conseguenza, è complesso e richiede molto tempo. Inoltre, questa tecnica richiede l'ottenimento di un campione di sangue fresco in condizioni appropriate all'inizio della procedura per ottenere rese utiliULT. Al contrario, HRM-PCR eseguita sul DNA rende possibile l'utilizzo di macchie o campioni di sangue seccamente secche dopo l'immagazzinamento a lungo termine. HMR-PCR richiede uno strumento specialistico di fusione di DNA, uno strumento dedicato o un termociclatore di capacità HMR con software HRM. La rilevazione di SNP dipende da diversi fattori: i) i SNP inclusi in grandi frammenti di PCR sono più difficili da rilevare che gli stessi SNP in piccoli frammenti di PCR; Ii) le SNP appartenenti a classi III e IV sono più difficili da rilevare rispetto a quelle delle classi I e II 34 ; E iii) le SNP che sono affiancate dalla simmetria di base vicina-vicina ( ad esempio, 5'-G (G / C) C-3 ') non possono essere ordinate mediante fusione, indipendentemente dalla potenza di risoluzione della piattaforma HMR. Può essere utile testare i frammenti di PCR previsti che contengono il SNP di interesse con il software uMELT 35 per valutare la validità del saggio. Infine, HMR-PCR è un metodo analogico, il che significa che la somiglianza delle curve di fusione scommetteUn riferimento e un modello non implicano necessariamente che la sequenza di modelli sia identica al riferimento, in quanto la sequenza di modelli può essere diversa dal riferimento ma equivalente termodinamicamente. Tuttavia, queste limitazioni non si applicano al metodo descritto qui, basato sulla fusione di un mix di ampliconi che si differenziano in termini di 5 sequenze di nucleotidi.

Inoltre, la tecnica descritta qui, basata sull'analisi della HRM, ha molti vantaggi. In primo luogo, i polimorfismi della lunghezza CR1 sono determinati più rapidamente, poiché i risultati sono ottenuti in circa 2 h una volta estratto l'estrazione del materiale genetico. Al contrario, le tecniche biochimiche tradizionali basate sull'analisi della proteina WB richiedono passi relativamente lunghi: l'elettroforesi degli estratti della membrana cellulare attraverso un gel di acrilamide, un passaggio per trasferire le proteine ​​a una membrana nitrocellulosa o fluoruro di polivinilidene (PVDF) e un passaggio per identificare Isoforme delMolecola CR1 mediante immunochemiluminescenza. In secondo luogo, la tecnica HRM-PCR ha anche il vantaggio di non essere troppo costoso, particolarmente importante per un metodo che potrebbe essere applicato a molti individui ( cioè largescale) per determinare la loro suscettibilità allo sviluppo di patologie come la malattia di Alzheimer, Lupus o malaria.

Recentemente, noi e altri abbiamo dimostrato che l'isoforma CR1 * 2, che contiene un ulteriore sito di legame C3b / C4b, è stata associata con AD 36 , 37 , 38 . Nel nostro studio precedentemente pubblicato, i polimorfismi di lunghezza CR1 a livello del gene e della proteina erano coerenti nel 98,9% dei soggetti 38 . I risultati discordanti ottenuti quando si confrontano i polimorfismi di lunghezza ottenuti da HRM-PCR con quelli ottenuti da WB corrispondevano a soggetti con un profilo genotipico (CR1 * 1, CR1 * 2) determinato da HRM (gene) ma exPremendo solo la isoform CR1 * 1 alla superficie dell'eritromicina secondo WB (proteina). Nel nostro studio, la mancanza di espressione isoformica CR1 * 2 (individui con un allele silenzioso) è stata riproducibile quando il WB è stato eseguito con un tempo di esposizione più lungo e potrebbe essere spiegato dall'esistenza di un silente CR1 allele (CR1 * 2), descritto In letteratura da Helgeson 39 . Tuttavia, ulteriori studi su popolazioni più grandi sono necessarie per sostenere questa ipotesi.

Va notato che SNP privati ​​(SNPs che si verificano solo in un piccolo gruppo familiare o persino in un singolo individuo) hanno portato a profili distinti di curva che devono essere decifrati usando la determinazione del fenotipo di riferimento (WB) ma che non può essere confuso con il profilo canonico per evitare Qualsiasi errata interpretazione del genotipo del polimorfismo di lunghezza CR1.

Dichiarazioni

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Gli autori sono gli inventori di un brevetto di proprietà dell'Università di Reims Champagne-Ardenne (URCA) (brevetto WO 2015166194)

Ringraziamenti

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Ringraziamo tutti i membri della Plateforme Régionale de Biologie Innovante, il personale del Dipartimento di Immunologia e il personale del Dipartimento di Medicina Interna e Geriatria, che ha contribuito all'ottimizzazione e alla validazione del protocollo. Questo lavoro è stato finanziato dagli ospedali universitari di Reims (numero di sovvenzione AOL11UF9156). Ringraziamo anche Fiona Ecarnot (EA3920, University Hospital Besancon, Francia) per l'assistenza editoriale.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Protezioneper camice
SensiCareIce Guanti da esame in nitrile senza polvereMedline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USAProtezione delcampione
Pipetta Eppendorf Reference 2, 0,5-10µ LEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francia4920000024pipettaggio di campioni
Eppendorf Reference 2 pipetta, 20-100µ LEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francia4920000059pipettaggio di campioni
Eppendorf Reference 2 pipetta, 100-1000µ LEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francia4920000083pipettaggio di campioni
TipOne 10µ L Graduato, puntale con filtroStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermaniaS1121-3810pipettaggio per campioni
TipOne 1-100µ L smussato, puntale filtranteStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, GermaniaS1120-1840pipettaggio dei campioni
ART 1000E Puntale barrieraThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francia2079Epipettaggio dei campioni
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1,5 mL, Eppendorf QualityEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francia0030120086mix
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USASI-0236mix
QIAamp DNA Mini Kit (250)Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, Francia51306Tampone per estrazione del DNA
ALQiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, Francia19075Tampone per lisi
QIAamp Mini Spin ColumnQiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, Francia1011706Tampone per legare il DNA
AW1Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, Francia19081Tampone di lavaggio
Buffer AW2Qiagen SA, F-91974 Courtaboeuf, Francia19072Tampone di lavaggio
Spettrofotometro DNA a bioondeBiochrom Ltd, Cambridge CB4 OFJ, Inghilterra80-3004-70Concentrazione di DNA 
Centrifuga Mikro 200Hettich Zentrifugen, D-78532, Germania0002020-02-00centrifugazione
Multipette  E3Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francia4987000010distribuzione
Light Cycler 480 piastra multipozzetto 96, biancoRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germania04729692001luogo di reazione
Light Cycler 480 foglio sigillanteRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germania04429757001copertura
Heraeus Megafuge 11R centrifugaThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francia75004412centrifugazione
LightCycler 480 Instrument II, 96-wellRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germania05015278001reazione a catena della polimerasi di fusione ad alta risoluzione
LightCycler 480 High Resolution Melting MasterRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germania04909631001reagenti
di reazionelight cycler 480 SW 1.5.1 softwareRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Germaniasoftware utilizzato per l'analisi dei dati sul polimorfismo HRM PCR CR1
Primer CN3: 5'ggccttagacttctcctgc 3'EurogentecBiologics Division, B- 4102 Seraing, Belgioreagente di reazione
CN3re primer: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3'EurogentecBiologics Division, B- 4102 Reazione di Seraing, Belgio Reagente
da laboratorio486802

Riferimenti

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