Questo articolo descrive come eseguire il bypass cardiopolmonare in topi. Questo modello di romanzo faciliterà l'indagine dei meccanismi molecolari coinvolti nel danno dell'organo.
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Articolo metodologico
Esclusione cardiopolmonare in un modello murino: un nuovo approccio
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Come bypass cardiopolmonare prolungata diventa più essenziale durante gli interventi cardiaci, una crescente domanda clinica si pone per l'ottimizzazione della procedura e per minimizzare il danno d'organo derivanti da circolazione extracorporea prolungata. L'obiettivo di questa carta era di dimostrare un modello completamente funzionale e clinicamente rilevante dell'esclusione cardiopolmonare in un mouse. Segnaliamo il dispositivo progettazione, ottimizzazione del circuito di perfusione e le tecniche microsurgical. Questo modello è un modello acuto, che non è compatibile con la sopravvivenza a causa della necessità per più disegni di sangue. A causa della gamma di strumenti disponibili per i topi (ad es., marcatori, forature, ecc.), questo modello faciliterà la ricerca sui meccanismi molecolari del danno d'organo e l'effetto dell'esclusione cardiopolmonare in relazione agli altri comorbilità.
Introduzione
Fin dall'introduzione dell'esclusione cardiopolmonare (CPB) in clinica, esso ha svolto un ruolo essenziale in cardiochirurgia1. In cardiochirurgia moderna, prolungato tempo CPB è essenziale per eseguire vaste ricostruzioni aortiche e procedure unite. Anche se i progressi tecnologici sono stati enormi, l'uso della circolazione extracorporea è associato con intra - e postoperatorie sistemica e locale organo danni2,3.
Grandi modelli animali sono stati sviluppati per studiare il ruolo di CPB su processi fisiologici4,5. Anche se questi modelli hanno fornito alcune del CPB connesse complicazioni, sono estremamente costosi e strumenti molecolari (ad es., anticorpi) sono molto limitati. Un'alternativa più efficiente è stata sviluppata nei piccoli animali. Dal loro sviluppo, sono stati condotti diversi studi per ottimizzare un modello CPB in ratti e conigli5,6,7,8,9. Questi modelli costituiscono una buona base per le misurazioni dei processi patofisiologici malattia; Tuttavia, essi sono ancora insufficienti per indagare immunologia umorale e cellulare a causa della mancanza di anticorpi pertinenti e reagenti. Ciò altera il loro ruolo in questo campo di ricerca.
Recentemente abbiamo sviluppato un modello murino di CPB. A causa di una vasta gamma di reagenti specifici del mouse e topi modificati geneticamente, modelli murini sono in generale il modello di scelta per la ricerca fisiologica, molecolari ed immunologici10,11. Pertanto, il nostro modello faciliterà lo studio di CPB in relazione alle varie comorbidità come ci sono molti ceppi di topi disponibili con malattie clinicamente rilevante12,13. Di conseguenza, questo articolo descrive, in dettaglio, come eseguire CPB in topi. Ossigeno e i parametri emodinamici sono strettamente monitorati dopo l'arresto di profondità respiratoria e circolatoria.
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Protocollo
tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con la legge di protezione animale tedesco (TierSchG) e sono stati approvati dal comitato locale benessere degli animali (ufficio di stato della Sassonia inferiore per tutela del consumatore e sicurezza alimentare, protocollo TSA 14/1556). Il peso minimo del mouse è adatto per questo modello è di 25 g.
1. preoperative preparazioni
Nota: tutte le procedure vengono eseguite in condizioni di pulito, non sterile, con strumenti sterilizzati nell'autoclave.
- Posto 50-60 8 cm lungo propilene hollow fibre in parallelo in un tubo e collegare con un adattatore a T su entrambi i lati. Riempire lo spazio tra le fibre cave e il ramo esterno dell'adattatore a T con colla.
- Consenti almeno 24 ore per la colla per indurire. Tagliare le fibre cave che si estende dal T-adattatore tramite un microtomo standard e accostare il tubo di silicone per i siti di collegamento.
- Inserire un ago di metallo 27 G (da un branule di 26G) in una cannula di poliuretano Fr 2. Utilizzare una lama chirurgica e micro-forbici al microscopio (ingrandimento X 8-12) per rendere le finestrature di tre o quattro di circa 0,15 cm entro il terzo distale della cannula per assicurare ottimale venoso flusso di ritorno.
- Rimuovi il filo quando completato. Utilizzare tamponi di cotone per dissezione smussa e retrazione delle strutture. Utilizzare tamponi di garza (5 x 5 cm 2) per assorbire il liquido in eccesso per prevenire la disidratazione del tessuto.
- Preparare il volume di riempimento. Per il completamento, aggiungere 30 UI eparina / mL soluzione e 2,5% v/v di una soluzione di 8,4% di NaHCO 3 per il buffer di adescamento. Conservare questa soluzione a 4 ° C fino a quando non usato.
- Riempire il circuito CPB (cioè, pompa, trapper aria, tubi e due cannule) con 850 µ l di soluzione di adescamento tramite cannula venosa. Una volta riempito, tenere il CPB in circolazione fino a quando l'animale è pronto per l'inserimento di una canula.
2. Anestesia degli animali
- per amministrare l'anestesia, metti l'animale in una camera di induzione inferiore 2,5% miscela di ossigeno/isoflurano v/v. Confermare la corretta anestesia valutando pedale ritiro reflex, reflex pizzico di coda e riflesso batter occhio. Applicare l'unguento veterinario degli occhi per evitare secchezza degli occhi.
- Metti l'animale su un tappetino riscaldante con funzione di regolazione di temperatura. Misurare la temperatura corporea con una sonda inserita per via rettale e collegato al sistema di acquisizione dati.
- Dopo anestesia completa è realizzata, intubare il orotracheally animale utilizzando una braunule di plastica di 20G, inserendolo oralmente e spingendolo nella trachea sotto controllo visivo. Iniziare la ventilazione meccanica utilizzando un vaporizzatore di isoflurane collegato ad un ventilatore del mouse. A seconda del peso dell'animale, regolare la ventilazione in modo che si ottiene un volume corrente di 250-350 µ l.
- Per assicurare la completa analgesia, iniettare 5 mg/kg peso corporeo degli animali carprofen per via sottocutanea. Si raccomanda che la concentrazione di isoflurane siano tenuti fra 1.3-2.5% in ossigeno. Isoflurano concentrazione può essere regolata manualmente a seconda della fase della procedura.
3. Procedure chirurgiche
- dopo l'anestesia completa e l'intubazione è raggiunto, eseguire un'incisione della pelle del midline al collo con forbici bene affilate, separare i muscoli in modo schietto ed esporre la vena giugulare di destra e sinistra dell'arteria carotica. Durante la preparazione, coagulare piccoli vasi con un veterinario coagulatore collegato alla pinza bipolare per garantire la perdita di anima minima.
- Dopo la preparazione dei vasi giugulari, cranialmente legare il segmento distale dell'arteria carotide comune sinistra alla sua biforcazione con punti di sutura seta 8-0.
- Collegare l'estremità distale di una cannula di 27 G alla tubazione di affluenza arteriosa utilizzando un connettore in silicone (ID di 0,5 mm, 1 mm di diametro), posto 8-0 sutura seta slip nodi a segmento prossimale dell'arteria e inserire la punta della cannula nell'arteria carotica.
- Dopo il corretto posizionamento della punta della cannula, avanzare la punta della cannula in modo che depone 3-4 mm prossimalmente al arco aortico. Difficoltà la punta della cannula fissando con nodi di seta 8-0.
- Uso microsurgical pinze e le forbici, eseguire la dissezione smussata e forte, esporre la vena giugulare di destra da smussato preparazione del tessuto lateralmente al muscolo sternocleidomastoideo, vicino alla clavicola e mettere un 8-0 seta nodo all'estremità distale e un 8-0 ciclo all'estremità prossimale.
- Dopo la legatura dell'estremità distale della vena giugulare, posizionare la punta della cannula venosa nella vena giugulare di destra e progressi verso l'atrio destro e fissarla con il nodo di seta. Per ottimo ritorno venoso, può essere necessario per far avanzare la punta venosa nel ventricolo destro.
- Una volta ottenuta la posizione corretta della cannula, svolgere eparinizzazione sistemica con l'aggiunta di 2,5 IU dell'eparina per grammo del peso corporeo degli animali tramite iniezione endovenosa diretta nella vena giugulare.
- Per il monitoraggio in tempo reale pressione invasiva, incannulare l'arteria femorale di sinistra. Esporre la zona inguinale e separare delicatamente l'arteria femorale comune dalla vena femorale e del nervo femorale sotto ingrandimento X 25.
- Legano la parte distale dell'arteria femorale. Temporaneamente occludere la parte prossimale con un cappio e praticare una piccola incisione sulla parete anteriore utilizzando micro-forcipe.
- In seguito, inserire una cannula di poliuretano Fr 1 nell'arteria femorale e fissarlo con una seta 10-0 suturare. Questa cannula viene utilizzata per estrarre i campioni di sangue per analisi di gas del sangue.
- Dopo posizionamento di successo delle cannule arteriose e venose, avviare l'esclusione cardiopolmonare di accendere la pompa. Il tempo da intubazione a partire del CPB è circa 45 min. iniziare ad usare una portata di 0,5 mL/min, a seconda delle misurazioni della pressione sistemica e aumentare il flusso sanguigno all'interno di 2 min a flusso pieno (4-6 mL/min) aumentando la velocità della pompa.
- Sotto monitoraggio completo, eseguire un sternotomy superiore utilizzando delle forbici affilate, a partire da manubrio e andando 5 mm in direzione caudale. Coagulare i bordi sternali immediatamente per evitare il sanguinamento. Esporre l'arco aortico tirando l'arteria carotica di destra in direzione craniale.
- Per un controllo ottimale, circonferenzialmente gratis arco aortico da timo e nel tessuto circostante per facilitare il bloccaggio. Luogo un ciclo di 8-0 seta intorno all'aorta ascendente. Per inserire il morsetto a croce per cardioplegia, tirare l'ansa seta in direzione craniale per esporre meglio l'aorta ascendente.
4. Esclusione cardiopolmonare e l'emogasanalisi
- per analisi di gas del sangue (BGA), utilizzare tubi capillari di vetro per raccogliere 60-90 µ l di sangue arterioso tramite catetere dell'arteria femorale.
- Utilizzare un piccolo morsetto del tubo di silicone e staccare il tubo dal catetere. Rilasciare la pressione lentamente sul morsetto per consentire il riempimento controllato del tubo capillare.
- Ricollegare il tubo di silicone al catetere. Inserire i tubi capillari nel sangue analizzatore di gas per misure presso i seguenti punti di tempo:
10 min dopo l'inizio di CPB con ventilazione (BGA1)
dopo 25 min di CPB e 15 min di arresto respiratorio (BGA2)
dopo 40 min di CPB e 30 min di arresto respiratorio (BGA3)
dopo 55 min di CPB, 45 min di respiratori e 20 min di arresto cardiaco (BGA4)
- sotto flusso stabile di CPB, initia arresto respiratorio te arrestando ventilazione.
- Dopo il termine della ventilazione, impostare il riscaldamento pad a 28 º c e iniziare il raffreddamento topicamente l'animale alla temperatura corporea di 28 ° c entro i primi 20 min di arresto respiratorio utilizzando una garza imbevuta di soluzione salina fredda.
- Una volta ottenuta una temperatura corporea di 28 ° c e dopo un totale di 30 min di arresto respiratorio, amministrare 0,3 mL di soluzione di KCl 7,45% nel circuito del CPB per avviare cardioplegia.
- Per attraversare la pressione dell'aorta, tirare l'ansa di seta precedentemente posizionata (punto 3.10) in direzione craniale per una migliore esposizione e posizionare un morsetto di micro-serrefine sulla parte ascendente dell'aorta.
- Eseguire un totale di 60 min arresto respiratorio e 30 min di arresto cardiaco. Rimuovere il morsetto di micro-serrefine dall'aorta ascendente di avviare riperfusione del cuore. Contemporaneamente, ri-ventilare e caldo l'animale a 37 ° C.
- Dopo riperfusione è completato e l'animale ha raggiunto normothermia, terminare il CPB spegnendo la pompa e continuare a monitorare le misurazioni fisiologiche (ad es. temperatura corporea, ECG e pressione sanguigna invasiva) per 20 min.
- Alla fine dell'esperimento, prosciugare l'animale in anestesia completo (5% isoflurano) e raccogliere il sangue e gli organi per ulteriore analisi 14.
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Risultati
Questo protocollo descrive il circuito di perfusione, interventi chirurgici e il monitoraggio dei parametri fisiologici durante CPB di un mouse. Quando eseguita da un Microchirurgo adeguatamente qualificato, i risultati si ottengono costantemente e riproducibile.
Per mantenere la perfusione tissutale adeguata, la pressione arteriosa media è sempre tra 40 e 60 mmHg regolando il flusso di sangue CPB e aggiunta di volume supplement...
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Discussione
Abbiamo sviluppato un modello clinicamente rilevante perfettamente funzionante di CPB in un mouse. Con più di trenta ceppi di topi con malattie cardiovascolari, il nostro modello potrebbe essere un punto di partenza per lo sviluppo di nuovi protocolli prospettici correlati a CPB. Inoltre, a causa della pletora di reagenti specifici del mouse e topi knockout, questo modello non può solo sostituire l'attuale modello di ratto di CPB ma faciliterà la dissezione dei meccanismi molecolari coinvolti nel danno dell'organo CPB-co...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori non hanno nessun ringraziamenti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sterofundin | B.Braun Petzold GmbH | PZN:8609189 | volume di primering, 1:1 con Tetraspan |
| Tetraspan 6% HES Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 05565416 | volume di priming, 1:1 con Sterofundin |
| Heparin Natrium 25.000 | Ratiopharm GmbH | PZN: 3029843 | 2,5 UI per ml di soluzione di primer |
| NaHCO3 8,4% Solution | B. Braun Melsungen AG | PZN: 1579775 | 3% in soluzione di priming |
| KCL 7,45 % Soluzione | B. Braun Melsungen AG | PZN: 2418577 | 0,1 mL per cardioplegia |
| Carprofen | Zoetis Inc., USA | PZN:00289615 08859153 | 5 mg/kg/BW |
| 1 Fr Catetere PU | Instechlabs INC., USA | C10PU-MCA1301 | arteria carotide |
| 2 Fr Catetere PU | Instechlabs INC., USA | C20PU-MJV1302 | vena giugulare |
| Vasofix Catetere di sicurezza 20G | B.Braun Medical | 4268113S-01 | intubazione orotracheale |
| 8-0 Sutura di seta intrecciata | Ashaway Line & Twine Mfg. Co., USA | 75290 | legatura |
| Isoflurane | Piramal Critical Care Deutschland GmbH | PZN:9714675 | narcosi |
| CLINITUBES capillari sanguigni | Radiomed GmbH | 51750132 | prelievo di sangue 60 - 95 microlitri |
| Forbici a molla - Lame da 6 mm Fine | Science Tools GmbH | 15020-15 | strumenti |
| Forbici a molla - Lame da 2 mm | Strumenti per la scienza fine GmbH | 15000-03 | strumenti |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools GmbH | 13009-12 | strumenti |
| Dumont #55 Pinza | Fine Science Tools GmbH | 11295-51 | strumenti |
| Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm | Fine Science Tools GmbH | 12060-02 | strumenti |
| Micro Serrefines | Fine Science Tools GmbH | 18555-01 | strumenti |
| Bulldog Serrefine | Fine Science Tools GmbH | 18050-28 | strumenti |
| Ventilatore MiniVent per topi (modello 845) | Harvard Apparatus | 73-0044 | ventilazione meccanica |
| Vaporizzatore isoflurano Dräger 19.1 | Drä gerwerk AG & Co. KGaA | anestesia 1,3 - 2,5% | |
| Dispositivo di acquisizione dati PowerLab 4/35 | ADInstruments Ltd, Nuova Zelanda | PL3504 | pressione invasiva, ECG, temperatura |
| ABL 800 Flex | Radiometer GmbH | analisi dei gas ematici | |
| NMRI | Charles River Laboratories | Crl:NMRI(Han) | maschio, 30 - 35 g, 12 settimane, alloggiato almeno 1 settimana prima dell'esperimento |
Riferimenti
- Edmunds, L. Cardiopulmonary Bypass after 50 Years. N. Engl. J. Med. 351 (16), 1601-1603 (2004).
- Goto, T., Maekawa, K. Cerebral dysfunction after coronary artery bypass surgery. J. Anesth. 28 (2), 242-248 (2014).
- Uysal, S., Reich, D. L. Neurocognitive outcomes of cardiac surgery. J. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 27 (5), 958-971 (2013).
- Ballaux, P. K., Gourlay, T., Ratnatunga, C. P., Taylor, K. M. A literature review of cardiopulmonary bypass models for rats. Perfusion. 14 (6), 411-417 (1999).
- Jungwirth, B., de Lange, F. Animal models of cardiopulmonary bypass: development, applications, and impact. Semin. Cardiothorac. Vasc. Anesth. 14 (2), 136-140 (2010).
- Günzinger, R., et al. A rat model of cardiopulmonary bypass with cardioplegic arrest and hemodynamic assessment by conductance catheter technique. Basic Res Cardiol. 102 (6), 508-517 (2007).
- Waterbury, T., Clark, T. J., Niles, S., Farivar, R. S. Rat model of cardiopulmonary bypass for deep hypothermic circulatory arrest. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 141 (6), 1549-1551 (2011).
- Schnoering, H., et al. A newly developed miniaturized heart-lung machine-expression of inflammation in a small animal model. Artif. Organs. 34 (11), 911-917 (2010).
- Kim, J., et al. The responses of tissues from the brain, heart, kidney, and liver to resuscitation following prolonged cardiac arrest by examining mitochondrial respiration in rats. Oxid. Med. Cell. Longev. 2016, (2016).
- Shappell, S. B., Gurpinar, T., Lechago, J., Suki, W. N., Truong, L. D. Chronic obstructive uropathy in severe combined immunodeficient (SCID) mice: lymphocyte infiltration is not required for progressive tubulointerstitial injury. J. Am. Soc. Nephrol. 9 (6), 1008-1017 (1998).
- Majzoub, J. A., Muglia, L. J. Knockout mice. N. Engl. J. Med. , 904-907 (1996).
- Houser, S. R., et al. Animal Models of Heart Failure A Scientific Statement From the American Heart Association. Circ. Res. 111 (1), 131-150 (2012).
- Russell, J. C., Proctor, S. D. Small animal models of cardiovascular disease: tools for the study of the roles of metabolic syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis. Cardiovasc. Pathol. 15 (6), 318-330 (2006).
- Iurascu-Gagea, M., Craig, S. Euthanasia and necropsy. The laboratory rabbit, guinea pig, hamster, and other rodents. Suckow, M. A., Stevens, K. A., Wilson, R. P. , Academic Press (Elsevier). 117-141 (2012).
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