Linfoma mantellare (MCL) è un difficile da trattare il disordine delle cellule di B ed è altrettanto difficile stabilire in un modello murino di xenotrapianto di MCL primario per studiare e sviluppare terapie. Qui, descriviamo la Costituzione ottimale degli xenotrapianti MCL in topi per aiutare a capire la sua biologia sottostante.
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Articolo metodologico
Attecchimento del tumore in un modello murino di xenotrapianto di umano linfoma a cellule mantellari
In questo articolo
Sommario
Abstract
I linfociti B sono attori chiave nella circolazione delle cellule immuni e hanno principalmente ospite e risiedono negli organi linfoidi. Mentre le cellule B normali proliferano solo quando sono stimolati da linfociti T, cellule di B oncogeniche sopravvivono ed espandono autonomamente in nicchie di organo non definito. Linfoma mantellare (MCL) è un tale disordine delle cellule B, dove il tasso di sopravvivenza mediana dei pazienti è di 4-5 anni. Ciò richiede la necessità di meccanismi efficaci per cui l'homing e l'attecchimento di queste cellule vengono bloccate al fine di aumentare la sopravvivenza e la longevità dei pazienti. Di conseguenza, lo sforzo di sviluppare un modello di xenotrapianto del topo per studiare l'efficacia di terapie MCL bloccando l'homing meccanismo in vivo è della massima importanza. Sviluppo di animali destinatari per lo xenotrapianto cellulare umana per testare farmaci fase precoce lungo sono state perseguite, come modelli di mouse preclinici rilevanti sono cruciali per nuovi agenti terapeutici dello schermo. Questo modello animale è sviluppato per evitare il rigetto dell'organo umano e per stabilire un modello per le malattie umane, e può essere uno strumento estremamente utile per studiare la progressione della malattia di tipi diversi di linfoma ed eseguire test preclinici di candidati farmaci per malignità ematologiche, come MCL. Abbiamo stabilito un modello di topo dello xenotrapianto che servirà come una risorsa eccellente per studiare e sviluppare nuovi approcci terapeutici per MCL.
Introduzione
I linfociti di natura svolgono un ruolo importante nella sorveglianza immunitaria, e traffico dei linfociti è un passo fondamentale nel montaggio dell'antigene specifico immunità1,2. Questo processo include la migrazione dei linfociti T naive al timo nel flusso sanguigno e da lì a organi linfoidi secondari, inclusi i linfonodi, placche di Peyer o milza, dove si incontrano gli antigeni cognati. I linfociti B differenziano nel midollo osseo e la migrazione di cellule naive nei follicoli di organi linfoidi secondari3. Alcune di queste cellule di B legano l'antigene con loro recettore e vengono attivati da specifiche cellule T. Proliferazione e la differenziazione di queste cellule B spinge le cellule di B ingenui non attivato, nella zona del manto del follicolo. Le cellule attivate quindi possono differenziarsi in memoria B cellule, che pattugliano il corpo, o maturano in immunoglobulina che secernono le cellule di plasma che migrano al midollo osseo4.
MCL si verifica quando i linfociti di B ingenui nella zona del mantello si trasformano in un tumore. Queste cellule di linfoma risiedono nel microambiente degli organi linfoidi e proliferano indipendentemente dal controllo specifico dei linfociti T. Tuttavia, in una determinata fase della densità di fuggire da questa nicchia e ricircolare nella circolazione sanguigna in cerca di nicchie in altri organi. Considerando la complessità delle molecole di adesione e la promiscuità di chemochine e loro recettori, il meccanismo di questo cellulare traffico in vivo è capito male e quindi ostacola la terapia. Nuovi metodi sono necessari per bloccare efficacemente questo processo di migrazione per impedire che le cellule di linfoma B raggiungendo nuovi microambienti.
MCL è uno dei più difficili per il trattamento di malignità delle cellule di B. Lo sviluppo di un fenotipo neoplastico di MCL è il risultato di una cascata multistep, caratterizzata dall'acquisizione delle proprietà biologiche uniche. Al momento della diagnosi, maggior parte dei pazienti (70%) già presente con una malattia diffusa, con una maggioranza dei casi che esibiscono la partecipazione extranodal in milza, midollo osseo e/o del tratto gastrointestinale5,6. Nei pazienti trattati, ricaduta di tumori resistenti in pochi anni è comune, anche se la chemioterapia convenzionale induce tassi della remissione alta a breve termine7,8. Qui vi presentiamo un nuovo modello di malattia che può aiutare a comprendere la diffusione di MCL e sua biologia sottostante: abbiamo stabilito un modello di mouse dello xenotrapianto MCL umano che ha avuto origine dalle cellule del tumore primario dei pazienti. Speriamo che questo modello aiuterà a sviluppare strategie terapeutiche contro la diffusione di MCL e possibilmente fornire nuove prospettive cliniche per la diagnosi ottima ed il trattamento di pazienti recidivati.
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Protocollo
I campioni di sangue umano sono stati utilizzati secondo procedure approvate dalle commissioni di sperimentazione umana dell'ospedale dell'Università di Ginevra ed etica locali.
Procedure degli animali sono state effettuate in conformità con l'istituzionale etico Comitato di cura degli animali in Ginevra, Svizzera e l'ufficio del veterinario cantonale (numero di autorizzazione: 15/26/GE).
1. preparazione delle cellule mononucleari di anima periferica primaria (PBMCs) tramite la separazione di gradienti di densità
Nota: 3-5 mL di sangue periferico è stata ottenuta da pazienti con MCL in una fase leucemica. La diagnosi era stabilita secondo criteri diagnostici standard per citometria a flusso (CD5 +, CD23−, CD200 +, popolazione monoclonale delle cellule B) e successivamente confermata dalla presenza di t(11;14) la traslocazione cromosomica e la sovraespressione di ciclina D1. In tutti i casi, le cellule B monoclonali costituivano a > 90% della popolazione totale delle cellule di B. Le cellule restanti erano principalmente monociti e alcune cellule di T.
- Diluire 5 mL (1:1) di campione di sangue MCL con 5 mL di terreno di Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) (Figura 1A).
- Invertire i media del gradiente di densità (Tabella materiali) parecchie volte prima dell'uso per garantire la completa miscelazione.
- Aggiungere 5 mL di media pendenza di densità in una provetta da centrifuga da 15 mL utilizzando un aspiratore di pipetta.
- Strato delicatamente il campione di sangue diluito sopra i mezzi di gradienti di densità la provetta da centrifuga da 15 mL utilizzando un aspiratore (il sangue al rapporto di densità media pendenza dovrebbe essere 2:1, ad esempio, 10 mL di sangue a 5 mL di media pendenza di densità). Dovrebbe prestare attenzione a non mescolare i due strati (Figura 1B, C).
- Centrifugare il campione a 400 x g per 40 min a temperatura ambiente con i freni di centrifuga spenti.
- Utilizzando una pipetta Pasteur sterile, aspirare delicatamente lo strato intermedio (biancastro, sottile anello indicato con una freccia (Figura 1, E)) che contengono le cellule mononucleari e trasferirli in una provetta pulita.
- Lavaggio delle cellule mononucleari
- Stimare il volume della sospensione cellulare trasferiti e aggiungere ad esso 3 volumi di sterile 1x tamponato fosfato salino (PBS) con 1% albumina di siero bovino (BSA).
- Mescolare la sospensione pipettando su e giù più volte.
- Centrifugare la sospensione a 400-500 x g per 10-15 min a temperatura ambiente.
- Scartare il surnatante per ottenere il pellet cellulare e ripetere la fase di lavaggio.
- Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule nel volume desiderato, ad esempio, 1 o 2 mL di PBS.
- Contare il numero di cellule da un contatore di cellule automatizzato o manualmente utilizzando un emocitometro (camera di Neubauer).
2. arricchimento delle cellule di B di selezione negativa delle cellule di B
- Diluire le cellule in PBS a una concentrazione finale di 50 x 106 cellule/mL.
- Trasferire le cellule a un 5 mL provetta polistirolo. Aggiungere 100 µ l di anticorpo cocktail dal kit di arricchimento delle cellule di B a 2 mL di sospensione cellulare e mescolare delicatamente pipettando su e giù (Figura 2-1).
- Incubare le cellule a temperatura ambiente per 10 min.
- Brevemente vortice le particelle magnetiche fornite nel kit di arricchimento delle cellule di B per 30 s (Figura 2-2). Aggiungere 150 µ l delle particelle magnetiche a 2 mL del campione.
- Incubare il campione per un altro 5 min a temperatura ambiente.
- Portare il volume del campione a 2,5 mL con 1x PBS contenente 2% siero fetale di vitello (FCS) e 1 millimetro di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Collocare la provetta nel magnete e incubare la provetta per altri 3-5 min (Figura 2-3).
- Prendi il magnete con il tubo in luogo e in un unico movimento continuo, decantare il tubo in modo che la sospensione cellulare arricchiti è raccolti in una nuova provetta (Figura 2-4). Contare le celle di un contatore di cellule automatizzato o manualmente utilizzando un emocitometro per ottenere la resa totale delle cellule B.
Nota: In genere, la resa è ~ 105 B cellule/mL per le cellule B normali e 5-50 x 106 cellule/mL per MCL. - Confermando la purezza dell'arricchimento delle cellule di B
- Prendere ~ 50.000 cellule e incubare le cellule con anticorpi anti-CD19/CD20 (01:20 diluizione) e l'anticorpo anti-CD45 accoppiato a diversi fluorocromi (01:10 diluizione) a temperatura ambiente per 15-30 min.
- Lavare con 1 mL di 1X PBS + 1% BSA, centrifugare le cellule a 400-500 x g per 5 min e risospendere le cellule in ~ 200 µ l di PBS.
- Acquisire i campioni delle cellule tramite flusso cytometry e analizzare per la purezza delle cellule B. La purezza è principalmente > 90% di questo metodo (Figura 3).
3. sviluppo del modello del topo di xenotrapianto
- Sospendere ~ 40-60 x 106 cellule in 150-200 µ l di PBS 1X (volume richiesto per iniettare per topo).
- Iniettare 150 µ l di sospensione cellulare per via endovenosa (i.v.) in ogni vena della coda di 6-7 settimana vecchio immunodeficienti scid NOD (NSG) topi gamma indipendentemente dal genere (Figura 4A).
- Consentire i topi di sviluppare linfoma umano per ~ 10 settimane.
Nota: Le cellule di linfoma umano primario richiedono molto più tempo per sviluppare tumore rispetto alle linee cellulari di linfoma umano (~ 3 settimane). - Quando gli animali cominciano a mostrare sintomi di malattia mortale come perdita di peso, capelli arruffati, diminuzione dell'attività, paralisi dell'arto, ecc., sacrificare i topi di CO2 asfissia seguita da puntura cardiaci cuore per ottenere sangue.
- Raccogli diversi organi come fegato, milza e midollo osseo dissezionando i topi e raccogliere il sangue periferico mediante prelievo di sangue dal cuore al momento del sacrificio per analisi di engraftment di tumore (Figura 4B -F).
4. chimerism analisi della cellula del tumore Engrafted nei diversi organi
- Dopo aver raccolto i diversi organi, elaborarli da rottura meccanica per generare sospensioni singola cella dopo lisi di globuli rossi (RBC) utilizzando 200 µ l di tampone di potassio cloruro di ammonio 1x per sangue e midollo osseo, 500 µ l per la milza e 2 mL per fegato .
- Contare e macchia le celle utilizzando anticorpi specifici umana delle cellule di B, cioè, anti-CD19, anti-CD20 e anti-CD45.
Nota: NSG topi privi di cellule di B e quindi per l'analisi, le cellule sono colorate con marcatori umana specifica delle cellule B. - Analizzare le cellule derivate da ogni organo tramite flusso cytometry di gating sui linfociti B (CD19 +, CD20 +, CD45 +).
- Quantificare le cellule del tumore engrafted negli organi differenti derivate da topi MCL iniettato basati sulle cellule con cancello come indicato al punto 4.3 (Figura 4).
Nota: Vedi Tabella materiali particolari.
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Risultati
Il manoscritto descrive un protocollo ottimizzato per il corretto sviluppo di un modello murino di xenotrapianto per engraftment delle cellule MCL. Preparazione di una popolazione di puro delle cellule (in questo caso cellule MCL), è molto critica per sviluppare il successo degli xenotrapianti MCL. Figura 1 rappresenta la procedura preparativa per l'isolamento di cellule mononucleate da sangue di MCL paziente tramite la separazione di gradienti di densità. Le...
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Discussione
Studi clinici sono possibili per i farmaci che sono in fase avanzata di sviluppo, ma non possono essere utilizzati per la scoperta di nuovi farmaci. Gli sforzi per sviluppare degli animali destinatari per lo xenotrapianto umano delle cellule al fine di testare farmaci fase precoce lungo sono stati perseguiti. Qui vi presentiamo un modello animale che evita il rigetto del trapianto umano e può stabilire un modello per le malattie umane, quali MCL. Questo è attualmente un modello di xenotrapianto d'avanguardia per studiare...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla Ligue Genevoise contre le Cancer, Fondation Dr. Dubois Ferriere Dinu-Lipatti, Oncosuisse KPS-OCS, OCS-02260-08-2008 e 2914-02-2012 e Swiss National Science Foundation Grant 31003A_156760 e 310030-153456.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Terreni ficoll-paque | GE Healthcare | 17-1440-02 | per la separazione di cellule mononucleate |
| RPMI Medium 1640 | Tecnologie Gibco-Life | 61870-010 | per la diluizione di campioni di sangue |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | lavaggio di cellule |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A8412 | per la preparazione di PBS con l'1% di BSA utilizzato nel lavaggio delle cellule durante l'isolamento |
| CD19-APC700 | Beckman Coulter | B49212 | marcatore di cellule pan-B umane |
| CD20-APC | Beckman Coulter | A21693 | marcatore di cellule pan-B umane |
| CD20-ECD | Beckman Coulter | IM3607 | marcatore di cellule pan-B umane |
| CD5-PC 5.5 | Beckman Coulter | PN A70203 | marcatore |
| CD23-PE | Pharmingen | 555711 | Proteina di superficie cellulare tipicamente assente in MCL |
| CD45 KO | Beckman Coulter | B36294 | Marker pan-leucocitario |
| CD200-PE | Pharmingen | 552475 | Proteina di superficie cellulare tipicamente assente nei |
| topi MCL NOD scid gamma (NSG) | River Laboratories | 5557 | utilizzato per sviluppare xenotrapianti di MCL in questo studio |
| Kit per l'arricchimento delle cellule B umane Easy sep | Tecnologie delle cellule staminali | 19054 | utilizzato per arricchire le cellule B per ottenere cellule pure da iniettare nei topi |
| FACS | Beckman Coulter | Navios | utilizzato per caratterizzare il campione di MCL e per studiare gli organi per l'attecchimento di MCL |
| 1X tampone | tampone di lisi del sangue rosso (NH4Cl 8.024 mg/l; KHCO3 1.001 mg/l; EDTA. Na2· 2H2O 3,722 mg/l ) |
Riferimenti
- Baggiolini, M., Dewald, B., Moser, B. Human chemokines: an update. Annu Rev Immunol. 15, 675-705 (1997).
- Baggiolini, M. Chemokines and leukocyte traffic. Nature. 392, 565-568 (1998).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , 5th edition, (2001).
- De Silva, N. S., Klein, U. Dynamics of B cells in germinal centres. Nat Rev Immunol. 15 (3), 137-148 (2015).
- Cohen, P. L., Kurtin, P. J., Donovan, K. A., Hanson, C. A. Bone marrow and peripheral blood involvement in mantle cell lymphoma. Br. J. Haematol. 101, 302-310 (1998).
- Meusers, P., Hense, J., Brittinger, G. Mantle cell lymphoma: diagnostic criteria, clinical aspects and therapeutic problems. Leukemia (Baltimore). 11 (Suppl 2), S60-S64 (1997).
- Herrmann, A., et al. Improvement of overall survival in advanced stage mantle cell lymphoma. J Clin Oncol. 27 (4), 511-518 (2008).
- Martin, P., et al. Intensive treatment strategies may not provide superior outcomes in mantle cell lymphoma: overall survival exceeding 7 years with standard therapies. Ann Oncol. 19 (7), 1327-1330 (2008).
- Iyengar, S., et al. Characteristics of human primary mantle cell lymphoma engraftment in NSG mice. Br J Haematol. 173 (1), 165-169 (2016).
- Klco, J. M., et al. Functional heterogeneity of genetically defined subclones in acute myeloid leukemia. Cancer cell. 25 (3), 379-392 (2014).
- Kerbel, R. S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved. Cancer Biol Ther. 2 (4 Suppl 1), S134-S139 (2003).
- Johnson, J. I., et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br. J. Cancer. 84, 1424-1431 (2001).
- Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. Correlation of drug response in patients and in the clonogenic assay with solid human tumour xenografts. Eur. J. Cancer. 26, 901-905 (1990).
- Doñate, C., Vijaya Kumar, A., Imhof, B. A., Matthes, T. Frontline Science: Anti-JAM-C therapy eliminates tumor engraftment in a xenograft model of mantle cell lymphoma. J Leukoc Biol. 100 (5), 843-853 (2016).
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