Articolo metodologico

Immunohistochemia Quantitativa del Microambiente Cellulare in Riapplicazioni del Glioblastoma Paziente

DOI:

10.3791/56025

⸱

31 luglio 2017

 , 
1Biomedical Engineering, University of Virginia

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo è stato sviluppato per identificare quantitativamente i componenti del microambiente del tumore nelle resezioni dei pazienti con glioblastoma utilizzando immunohistochemistry cromogene e ImageJ.

Abstract

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Con il crescente interesse per il microambiente del tumore, abbiamo deciso di sviluppare un metodo per determinare in modo specifico i componenti del microambiente nei campioni dei pazienti di glioblastoma, il cancro al cervello più letale e più invasivo. Non solo metodi quantitativi utili per descrivere in modo preciso i tessuti malati, possono anche contribuire alla prognosi, alla diagnosi e allo sviluppo di sistemi e sostituzioni sintetici. Nel glioblastoma, le cellule gliali, come microglia e astrociti, sono state correlate indipendentemente con una prognosi scadente basata sulla classificazione patologica. Tuttavia, lo stato di queste cellule e di altri componenti di cellule gliali non è stato ben descritto in modo quantitativo. Ciò può essere difficile a causa dei grandi processi che segnano queste cellule gliali. Inoltre, la maggior parte delle analisi istologiche si concentrano sul campione globale del tessuto o solo all'interno della maggior parte del tumore, al contrario di delineare quantificazioni basate sulle regioniIl tessuto molto eterogeneo. Qui descriviamo un metodo per identificare e analizzare quantitativamente le popolazioni delle cellule gliali all'interno della massa tumorale e delle regioni adiacenti di resezione tumorale da pazienti con glioblastoma. Abbiamo utilizzato immunohistochemistry cromogeno per identificare le popolazioni di cellule gliali nelle resections del tumore del paziente e ImageJ per analizzare la copertura percentuale di colorazione per ogni popolazione gliale. Con queste tecniche possiamo descrivere meglio le cellule gliali in tutte le regioni del microambiente tumorale degli amiomi.

Introduzione

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Il glioblastoma (GBM), il cancro al cervello più comune e maligno, è caratterizzato da un'invasione altamente diffusa dalla massa tumorale primaria nel cervello sano, parenchima 1 , 2 . Questa invasione diffusa rende particolarmente difficile il respiro del tumore, e le cellule tumorali invasive che rimangono post-terapia sono il motivo più comune per la ricorrenza inevitabile 2 , 3 , 4 . In precedenza, abbiamo trovato inibendo l'invasione di cellule diffuse degli gliomi per essere terapeuticamente vantaggios....

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Protocollo

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Questo protocollo identifica i componenti cellulari in campioni embedded (FFPE) fissati in formalina, come è tipico per i campioni pazienti clinici bancati. L'incorporazione di paraffina consente la migliore manutenzione della morfologia cellulare e del tessuto, nonché la migliore longevità delle sezioni. I campioni utilizzati per questa analisi sono stati raggiunti attraverso l'Università di Virginia Biorepository e Tissue Research Facility. I campioni pazienti sono stati selezionati da un neuropatologo basato su una diagnosi definitiva di glioblastoma (astrocitoma, grado IV dell'OMS) che aveva completato resezione tumorale presso l'Università di Vir....

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Risultati

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Per questa analisi sono state identificate due regioni di interessi all'interno delle nostre rese tumorali - la massa tumorale primaria e le regioni adiacenti, composta principalmente da tessuti sani con cellule tumorali invasive diffuse ( Figura 1A , 1B ) - sono stati identificati collaborando neuropatologi con pazienti affetti da ematossilina ed eosina campioni. All'interno di ogni campione di pazienti è stata identificata una colorazione .......

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Discussione

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Il nostro metodo proposto qui è un approccio quantitativo per l'analisi dei campioni istologici macchiati usando l'immunohistochemistry tradizionale cromogeno. La metodologia attuale per questo tipo di analisi comprende protocolli di colorazione similari seguiti da classificazione da patologi indipendenti. Questo metodo è stato affidabile, tuttavia per una serie di applicazioni è necessaria una comprensione più precisa del trucco cellulare, come una migliore comprensione dell'eterogeneità associata ai tumori.......

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Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano i dottori. Fahad Bafakih e Jim Mandell per l'acquisizione e l'identificazione di campioni di pazienti, Garrett F. Beeghly per l'assistenza con immunohistochemistry e il Biorepository and Tissue Research Facility, il Centro di Histologia del Centro Cardiovascolare e l'Analisi Biomolecolare presso l'Università di Virginia per assistenza L'acquisizione di campioni, l'immunohistochemistry e l'imaging.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
XyleneFisher ChemicalX3P
Etanolo
di smascheramento dell'antigene ad alto pHVector LabsH-3301
TBS
Triton-XAmresco9002-93-1
Siero
Anti-ALDH1L1 abcam ab56777
Anti-Iba1 abcam ab5076
Proteina specifica anti-oligodendrociti1 abcam ab53041
ImmPRESS anti-capraVector LabsMP-7405
ImmPRESS Universale (anti-topo/coniglio)Vector LabsMP-7500
Perossido di idrogenoSigma Aldrich216763
ImmPACT Substrato DABVector LabsSK-4105
Ematossilina controcoloranteThermoScientific72404
Histochoice Supporti di montaggioAmrescoH157-475
Aperio ScanscopeLeica Biosystems
Image ScanscopeLeica Biosystems
Super HT PAP PenResearch ProductsInternational 195506
Soluzione di cavallo

Riferimenti

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  1. Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. Diffuse glioma growth: a guerilla war. Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).
  2. Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
  3. Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., D....

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Glioblastoma Tumor MicroenvironmentChromogenic ImmunohistochemistryImageJ AnalysisGlial Cell QuantificationPatient Tumor ResectionsAntigen RetrievalPermeabilization SolutionPrimary AntibodiesDAB SubstrateHematoxylin Counterstain

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