Questo protocollo è stato sviluppato per identificare quantitativamente i componenti del microambiente del tumore nelle resezioni dei pazienti con glioblastoma utilizzando immunohistochemistry cromogene e ImageJ.
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Articolo metodologico
Immunohistochemia Quantitativa del Microambiente Cellulare in Riapplicazioni del Glioblastoma Paziente
In questo articolo
Sommario
Abstract
Con il crescente interesse per il microambiente del tumore, abbiamo deciso di sviluppare un metodo per determinare in modo specifico i componenti del microambiente nei campioni dei pazienti di glioblastoma, il cancro al cervello più letale e più invasivo. Non solo metodi quantitativi utili per descrivere in modo preciso i tessuti malati, possono anche contribuire alla prognosi, alla diagnosi e allo sviluppo di sistemi e sostituzioni sintetici. Nel glioblastoma, le cellule gliali, come microglia e astrociti, sono state correlate indipendentemente con una prognosi scadente basata sulla classificazione patologica. Tuttavia, lo stato di queste cellule e di altri componenti di cellule gliali non è stato ben descritto in modo quantitativo. Ciò può essere difficile a causa dei grandi processi che segnano queste cellule gliali. Inoltre, la maggior parte delle analisi istologiche si concentrano sul campione globale del tessuto o solo all'interno della maggior parte del tumore, al contrario di delineare quantificazioni basate sulle regioniIl tessuto molto eterogeneo. Qui descriviamo un metodo per identificare e analizzare quantitativamente le popolazioni delle cellule gliali all'interno della massa tumorale e delle regioni adiacenti di resezione tumorale da pazienti con glioblastoma. Abbiamo utilizzato immunohistochemistry cromogeno per identificare le popolazioni di cellule gliali nelle resections del tumore del paziente e ImageJ per analizzare la copertura percentuale di colorazione per ogni popolazione gliale. Con queste tecniche possiamo descrivere meglio le cellule gliali in tutte le regioni del microambiente tumorale degli amiomi.
Introduzione
Il glioblastoma (GBM), il cancro al cervello più comune e maligno, è caratterizzato da un'invasione altamente diffusa dalla massa tumorale primaria nel cervello sano, parenchima 1 , 2 . Questa invasione diffusa rende particolarmente difficile il respiro del tumore, e le cellule tumorali invasive che rimangono post-terapia sono il motivo più comune per la ricorrenza inevitabile 2 , 3 , 4 . In precedenza, abbiamo trovato inibendo l'invasione di cellule diffuse degli gliomi per essere terapeuticamente vantaggios....
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Protocollo
Questo protocollo identifica i componenti cellulari in campioni embedded (FFPE) fissati in formalina, come è tipico per i campioni pazienti clinici bancati. L'incorporazione di paraffina consente la migliore manutenzione della morfologia cellulare e del tessuto, nonché la migliore longevità delle sezioni. I campioni utilizzati per questa analisi sono stati raggiunti attraverso l'Università di Virginia Biorepository e Tissue Research Facility. I campioni pazienti sono stati selezionati da un neuropatologo basato su una diagnosi definitiva di glioblastoma (astrocitoma, grado IV dell'OMS) che aveva completato resezione tumorale presso l'Università di Vir....
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Risultati
Per questa analisi sono state identificate due regioni di interessi all'interno delle nostre rese tumorali - la massa tumorale primaria e le regioni adiacenti, composta principalmente da tessuti sani con cellule tumorali invasive diffuse ( Figura 1A , 1B ) - sono stati identificati collaborando neuropatologi con pazienti affetti da ematossilina ed eosina campioni. All'interno di ogni campione di pazienti è stata identificata una colo.......
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Discussione
Il nostro metodo proposto qui è un approccio quantitativo per l'analisi dei campioni istologici macchiati usando l'immunohistochemistry tradizionale cromogeno. La metodologia attuale per questo tipo di analisi comprende protocolli di colorazione similari seguiti da classificazione da patologi indipendenti. Questo metodo è stato affidabile, tuttavia per una serie di applicazioni è necessaria una comprensione più precisa del trucco cellulare, come una migliore comprensione dell'eterogeneità associata ai tumori.......
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Ringraziamenti
Gli autori ringraziano i dottori. Fahad Bafakih e Jim Mandell per l'acquisizione e l'identificazione di campioni di pazienti, Garrett F. Beeghly per l'assistenza con immunohistochemistry e il Biorepository and Tissue Research Facility, il Centro di Histologia del Centro Cardiovascolare e l'Analisi Biomolecolare presso l'Università di Virginia per assistenza L'acquisizione di campioni, l'immunohistochemistry e l'imaging.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Xylene | Fisher Chemical | X3P | |
| Etanolo | |||
| di smascheramento dell'antigene ad alto pH | Vector Labs | H-3301 | |
| TBS | |||
| Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
| Siero | |||
| Anti-ALDH1L1 | abcam | ab56777 | |
| Anti-Iba1 | abcam | ab5076 | |
| Proteina specifica anti-oligodendrociti1 | abcam | ab53041 | |
| ImmPRESS anti-capra | Vector Labs | MP-7405 | |
| ImmPRESS Universale (anti-topo/coniglio) | Vector Labs | MP-7500 | |
| Perossido di idrogeno | Sigma Aldrich | 216763 | |
| ImmPACT Substrato DAB | Vector Labs | SK-4105 | |
| Ematossilina controcolorante | ThermoScientific | 72404 | |
| Histochoice Supporti di montaggio | Amresco | H157-475 | |
| Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Image Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Super HT PAP Pen | Research Products | International 195506 |
Riferimenti
- Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. Diffuse glioma growth: a guerilla war. Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., D....
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Ristampe e permessi
