L'uso di un "chip olfattivo" adattato per l'imaging del calcio efficiente dei maschi di c. elegans è descritto qui. Sono indicati anche gli studi di esposizione maschio a glicerolo e ad un feromone.
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Articolo metodologico
Tramite un Chip olfattiva di microfluidica adattato per l'Imaging dell'attività neuronale in risposta ai feromoni in neuroni di testa maschio C. Elegans
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'uso di indicatori di calcio ha notevolmente migliorato la nostra comprensione delle dinamiche neurali e regolamento. Il nematode Caenorhabditis elegans, con il suo sistema nervoso completamente mappato e trasparente anatomia, presenta un modello ideale per comprendere dinamiche neurali in tempo reale utilizzando indicatori di calcio. In combinazione con tecnologie di microfluidica e disegni sperimentali, calcio-formazione immagine studia usando questi indicatori vengono eseguite in animali liberi di muoversi e intrappolati. Tuttavia, la maggior parte degli studi precedente che utilizzano dispositivi di cattura, come il chip olfattivo descritto in Chronis et al., hanno dispositivi progettati per l'uso nell'ermafrodita più comune, come l'uomo meno comuni si sia morfologicamente e strutturalmente dissimili. Un chip olfattivo adattato è stato progettato e fabbricato per una maggiore efficienza nella formazione immagine di un neurone maschile con l'utilizzo di animali adulti, giovani. Una svolta fu incorporata il worm carico porta a ruotare gli animali e per consentire la separazione dei singoli neuroni all'interno di una coppia bilaterale in imaging 2D. Vermi sono esposti ad un flusso controllato di odorizzante all'interno del dispositivo di microfluidica, come descritto in precedenti studi ermafroditi. Transitori di calcio vengono poi analizzati utilizzando il software open-source ImageJ. La procedura descritta nel presente documento dovrebbe consentire una maggiore quantità di uomo-base di c. elegans calcio formazione immagine studia, approfondire la nostra comprensione dei meccanismi di segnalazione di un neurone di sesso-specifici.
Introduzione
Dispositivi microfluidici consentono un maggiore accesso alle precisamente ambienti controllati, in cui animali, come il nematode c. elegans, può essere manipolato sperimentalmente1. Questi studi comprendono le analisi comportamentali, studi di formazione immagine del calcio o proiezioni anche per specifici fenotipi, conseguente misure più esatte di risultati sperimentali1,2,3,4, 5,6. Microfluidica fornisce condizioni liquide su scala rido....
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Protocollo
1. fabbricazione di dispositivi
Nota: Vedi riferimento 1.
Nota: stampi in silicone master furono fabbricati usando tecniche fotolitografiche standard per patterning photoresist SU-8 su un silicio Maestro 1 , 7. Maschere fotografiche per la modellatura del wafer sono stati stampati a 25.000 dpi. Le caratteristiche del dispositivo uomo-adattato un Chip olfattivo Chronis progettare 19 con un cambiamento nel verme orificio di caricamento, adattando un disegno ottenuto da M. Zimmer (corrispondenza personale,....
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Risultati
Un esempio dell'impostazione generale del dispositivo può essere visto in Figura 1A-B. Figura 1A raffigura il serbatoio corretta costruzione e installazione. Figura 1B Mostra le connessioni dei serbatoi al dispositivo microfluidico. Figura 1 raffigura un dispositivo microfluidico con singole porte etichettate per chiarezza.
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Discussione
Il chip olfattivo uomo-adattato incorpora una girata in un orificio di caricamento più stretto, che permette per un maggiore controllo dell'orientamento e per il trapping efficiente del maschio c. elegans. Ciò consente la visualizzazione di entrambi i membri sinistro e destro di un neurone coppie bilaterale, senza la necessità per l'impilamento di z. Questa curva conduce ad un orientamento da verticale 100% del tempo a worms dove soltanto un accoppiamento bilaterale si rivolge con un marcatore fluorescente, come.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Manuel Zimmer per averci fornito il file di progetto iniziale che è stato adattato per l'uso con i maschi; Frank Schroeder per la sintesi e la fornitura di ascr n. 3; Ross Lagoy per l'intuizione e l'assistenza con imaging e l'analisi; e Laura Aurilio per la realizzazione di master e che, insieme a Christopher Chute, ha contribuito alla revisione del manoscritto. Finanziamento di quest'opera fu fornito sotto il National Institutes of Health grant 1R01DC016058-01 (J.S.), il National Science Foundation grant CBET 1605679 (D.R.A.) e il premio alla carriera Burroughs Wellcome all'interfaccia scientifica (D.R.A.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Wafer di silicio | University Wafer | 452 | |
| SU-8 2035 | MicroChem | Y111070-0500L1GL | |
| Sviluppatore | MicroChem | Y020100-4000L1PE | |
| Wafer Mask | Cad/Art | Services-Ordine | personalizzato. Stampato a 25.000 dpi. |
| Sylgard-184 | Ellsworth Adesivi | 184 SIL ELAST KIT 0,5 KG | |
| 1,0 mm Punzoni dermici | Acuderm Inc. | P150 | |
| Tubi morbidi | Cole-Palmer | EW-06419-01 | |
| Tubi rigidi | IDEX Salute & Scienza | 1622 | |
| Pins | New England Small Tube | NE-1027-12 | |
| Perni di bloccaggio | New England Small Tube | 0.415/0.425" OD x .500 Long | Batch PB07027 |
| siringhe da 3 mL | 309657 | ||
| siringhe BD 30 mL | Vitality Medical | 302832 | Utilizzato come serbatoi tampone. |
| Acciaio inossidabile Aghi smussati calibro 23, poliprolinene Luer | Component Supply Company | NE-231PL-50 | |
| Rubinetti con connessioni Luer; 3 vie; blocco maschio; 5 modelli di flusso; non sterile | Cole-Palmer | EW-30600-07 | |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| Sistema di controllo Mercator LF-5 Sistema al plasma | Mercator | LF-5 | |
| Scotch | Scotch | ||
| 20 camere | Warner Instruments | P-2 | |
| Desicator sottovuoto | Bel-Art Scienceware | 420250000 | Diametro interno 24 cm. |
| Pesare Barche | Cole-Palmer | EW-01017-27 | |
| Classic Plus Balance | Mettler Toledo | PB1501-S / FACT | |
| Pipette Pasteur in vetro | Cole-Palmer | EW-25554-06 | |
| Pipette di trasferimento | Genesee Scientific | 30-202 | |
| Forno | Sheldon Manufacturing Inc | 9120993 | Numero di modello: 1500E. |
| Piastre Petri da 60 mm, non ventilate, con bordi affilati | TriTech Research | T3308 | |
| Zeiss Axio Observer.A1 | Zeiss-Hammamatsu | ||
| Orca Flash 4.0 CMOS digitale | Hammamatsu | C11440-22CU | |
| Luce fluorescente blu | Lumencor | SOLA SM6-LCR-SA | 24-30V/7.9A DC. |
| Adattatore di illuminazione | Zeiss | 423302-0000 | |
| Serie 1 e 2 Valvola di isolamento in PTFE inerte miniaturizzato Parker | 001-0017-900 | Valvola a 3 vie per il controllo del flusso. | |
| Collegamento a valvola8.2® | AutoMate Scientific | 01-18 | Regolatore di flusso |
| Micro Manager | Software Micro-Manager-Free | , scaricabile all'indirizzo: https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release | |
| ImageJ | Software ImageJ-Free | , scaricabile all'indirizzo: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Agar, Grado batteriologico | Apex | 9012-36-6 | |
| Peptone | Apex | 20-260 | |
| CaCl2 | VWR | BDH0224-1KG | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391-1kg | |
| Colesterolo | Alfa Aesar | A11470 | |
| Etanolo | Sigma-Aldrich | 270741-4L | |
| Tetramisole | Sigma-Aldrich | L9756-10(G) | Conservare a 4 °C. |
| Fluoresceina | Sigma-Aldrich | FD2000S-250mg | Sensibile alla luce. Conservare in fiale fotoprotettive. |
| Glicerolo | Sigma-Aldrich | G6279-1L | |
| Ascaroside #3 | - | Sintetizzato nel laboratorio Schroeder (Cornell University). | |
| NaCl | Genesee Scientific | 18-215 | |
| KH2PO4 | BDH | BDH9268.25 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3252-025 | |
| ASH GCaMP3 line | - | - | CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]). Sviluppato nel laboratorio Bargmann. Fornito dalla biblioteca Albrecht Lab. |
| Linea CEM GCaMP6 | - | - | JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::d sRED + pBX-1]; pha-1(e2123ts); him-5(e1490); lite-1(ce314)). Sviluppato da Robyn Lints. Fornito dalla libreria Srinivasan Lab. |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| "Reservoir" | - | - | Per creare un serbatoio: una "siringa da 30 mL", è collegata a un "rubinetto con connessioni Luer; a 3 vie; blocco maschio; modello a 5 flussi; non sterile", che è collegato a una "siringa da 3 mL" e a un "ago smussato in acciaio inossidabile calibro 23, Poliprolilene Luer". L'"Stainless Steel Blunt Needle 23 Gauge, Polyprolylene Luer" viene quindi inserito nel "Soft Tubing" a circa 1/3 del percorso lungo l'ago. |
Riferimenti
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).
- Ben-Yakar, A., Chronis, N., Lu, H.
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Ristampe e permessi
