I cheratinociti epidermici formano una barriera cutanea funzionale e sono posizionati nella prima linea di difesa dell'ospite contro gli insulti ambientali esterni. Qui descriviamo i metodi per l'isolamento e la coltura primaria di cheratinociti epidermici dalla cute del neonato e dell'adulto, e l'induzione della differenziazione dei terminali e la risposta infiammatoria innescata da UVB da cheratinociti.
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Articolo metodologico
Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il keratinocyte (KC) è il tipo di cellula predominante nell'epidermide, lo strato più esterno della pelle. I KC epidermici svolgono un ruolo fondamentale nel fornire la difesa della pelle, formando una barriera cutanea intatta contro gli insulti ambientali, come l'irradiazione UVB o gli agenti patogeni e anche avviando una risposta infiammatoria su tali insulti. Qui descriviamo metodi per isolare i KC dalla cute del neonato e dalla pelle adulta di coda del mouse. Descriviamo anche le condizioni di coltura usando gli integratori di crescita definiti (dGS) in confronto al siero bovino fetale chelexed (cFBS). Funzionalmente, dimostriamo che sia KC neonatali che adulti sono altamente reattivi per l'alta calcio-indotta della differenziazione dei terminali, alla stretta formazione di giunzione e stratificazione. Inoltre, i KC adulti coltivati sono suscettibili di morte cellulare causata da UVB e possono rilasciare grandi quantità di TNF dopo l'irraggiamento UVB. Insieme, i metodi qui descritti saranno utili ai ricercatori per la messa a punto del modello in vitroS per studiare la biologia epidermica nel mouse neonatale e / o nel mouse adulto.
Introduzione
La pelle è l'organo più grande del corpo con l'epidermide come lo strato più esterno. L'epidermide svolge un ruolo fondamentale nella formazione di una barriera epidermica intatta per separare il corpo dall'ambiente, impedendo così la perdita di acqua e protegge dagli insulti ambientali, come gli allergeni, gli agenti patogeni e l'esposizione UVB. L'epidermide si sviluppa da un unico strato di cheratinociti basali (KCs) indifferenziati in un epitelio stratificato multistrato costituito da uno strato basale seguito da uno strato spinoso, uno strato granulare e uno strato corneo. I KC basali, costituiti da cellule staminali epidermiche e cellule....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono approvati dal comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali UCSD.
1. Isolamento e coltura primaria del KC del mouse dalla pelle neonatale
- Sacrifica il giorno dopo-natalizio 0-2 neonati del ceppo C57B / 6 del mouse selvatico da decapitazione con forbici. Tagliare gli arti appena sopra le articolazioni del polso e della caviglia, poi tagliare completamente la coda, lasciando un piccolo foro.
- Per sbucciare tutta la pelle, prima inserire forbici affilate attraverso il foro alla coda e tagliare la pelle lungo la linea mediana dorsale del corpo fino all'ape....
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Risultati
Elevata differenziazione terminale indotta da calcio di KC neonatali e adulti. Epidermico principale del mouse KC placcato e mantenuta a 0,06 mM CaCl 2 cresciuto come un monostrato, e singole celle aveva una forma poligonale con spazio intercellulare distinto, che mostra un aspetto di ciottoli quando confluenti (Figura 1A e Figura 2A). Aumento del CaCl 2 a 0,2 mM ha indotto un rapido cambia.......
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Discussione
L'epidermide della pelle funziona come una barriera critica per separare e proteggere il corpo dall'ambiente esterno e danneggiare la perdita di acqua, gli agenti patogeni, il calore e l'irradiazione UV. I KC sono la linea di cellule predominante dell'epidermide e la coltura primaria dei KC epidermici è uno strumento utile per studiare e comprendere i processi biologici della formazione delle barriere e la risposta di KC a insulti ambientali in vitro .
Qui descriviam.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dall'UNITATIVO NAZIONALE DI ARTHRITIS e MUSCULOSKELETAL AND SKIN DISEASES (R01AR069653 a Zhang LJ) e presso gli Istituti Nazionali di Sostegno alla Salute (5T32AR062496-03 a CA).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| C57BL/6 neonati o topi adulti wildtype | Laboratory | 000664 | I topi Wildtype (originariamente acquistati da Jackson Laboratory) sono allevati e mantenuti in un vivaio di animali presso l'UCSD. |
| Terreno basale KC (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | terreno basale per coltura di cheratinociti con 0,06 mM di CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | Defined Growth Supplements for Culture |
| Medium Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzima per dissociare l'epidermide dal derma |
| Fattore di attacco | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | materiale di rivestimento a base di gelatina |
| Matrice di rivestimento | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Materiale di rivestimento a base di collagene |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | Un delicato enzima simile alla tripsina per dissociare i cheratinociti dal foglio epidermico |
| 100 μ m Cell Strainer Rete di nylon | Corning | 352360 | |
| CCK-8 Kit di vitalità cellulare | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Lampade UV portatili con cavo | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| Tubi UV da 8 watt | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Microscopio invertito a luce per colture cellulari | ZEISS, Jena, Germania | Microscopio fluorescente Axio Observer | |
| Olympus | BX41 |
Riferimenti
- Mauro, T., et al. Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE. J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).
- Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M.
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Ristampe e permessi
