Articolo metodologico

Laser Doppler: Uno strumento per la misurazione dell'isolotto pancreatico Vasomotion microvascolare In Vivo

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DOI:

10.3791/56028

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8 marzo 2018

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1Institute of Microcirculation, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College

In questo articolo

Sommario

Isole pancreatiche microvascolare vasomotion regola la distribuzione di sangue dell'isolotto e mantiene la funzione fisiologica delle cellule β dell'isolotto. Questo protocollo descrive l'utilizzo di un monitor Doppler laser per determinare lo stato funzionale di isole pancreatiche vasomotion microvascolare in vivo e a valutare il contributo della microcircolazione di isole pancreatiche per malattie del pancreas.

Abstract

Come una condizione funzionale della microcircolazione, vasomotion microvascolare è importante per la consegna di ossigeno e nutrienti e la rimozione di anidride carbonica e prodotti di scarto. Il danno della vasomotion microvascolare potrebbe essere un passo cruciale nello sviluppo delle malattie collegate alla microcircolazione. Inoltre, l'isolotto pancreatico altamente vascularized e adattato per supportare la funzione endocrina. A questo proposito, sembra possibile inferire che la condizione funzionale del vasomotion microvascolare dell'isolotto pancreatico potrebbe colpire la funzione delle isole pancreatiche. Analizzare i cambiamenti patologici della condizione funzionale di isole pancreatiche vasomotion microvascolare può essere una strategia fattibile per determinare i contributi che microcircolazione dell'isolotto pancreatico rende alle malattie correlate, come il diabete mellito, pancreatite, ecc. Di conseguenza, questo protocollo viene descritto utilizzando un monitor di flusso di anima di Doppler laser per determinare lo stato funzionale di isole pancreatiche microvascolare vasomotion e di stabilire parametri (tra cui la perfusione sanguigna media, ampiezza, frequenza e relativa velocità di isole pancreatiche microvascolare vasomotion) per la valutazione della condizione funzionale microcircolatoria. In un modello del mouse diabetici streptozotocin-indotti, abbiamo osservato un'alterata condizione funzionale della vasomotion microvascolare dell'isolotto pancreatico. In conclusione, questo approccio per la valutazione dell'isolotto pancreatico vasomotion microvascolare in vivo può rivelare meccanismi relativi alle malattie pancreatiche.

Introduzione

Come parametro della condizione funzionale della microcircolazione, vasomotion microvascolare si assume la responsabilità per la consegna e lo scambio di ossigeno, sostanze nutritive e ormoni ed è fondamentale per la rimozione dei prodotti metabolici, quali anidride carbonica e rifiuti cella 1. microvascolare vasomotion regola anche la distribuzione del flusso di sangue e la perfusione tissutale, interessando così la pressione sanguigna microcircolatoria locale e risposte ad infiammazione, che può indurre l'edema in molte malattie. Di conseguenza, vasomotion microvascolare è estremamente importanti per mantenere la funzione fisiologica di organi2,3,4, tessuti e cellule di componente. Il danno della vasomotion microvascolare potrebbe essere uno dei passaggi chiavi nello sviluppo delle malattie relative microcircolazione5.

Laser Doppler è stato inizialmente sviluppato per l'osservazione e la quantificazione nel campo della microcircolazione ricerca6. Questa tecnica, insieme ad altri approcci tecnici (ad es., laser speckle7, ossigeno transcutanea, ecc.), è stata considerata come lo standard d'oro per valutare il flusso di sangue nel microcircolo. Il razionale che l'aspersione del sangue di microcircolazione locale (cioè, capillari, arteriole, venule, ecc.) può essere determinata da apparato dotato di laser Doppler, si basa sul principio dell'effetto Doppler. La lunghezza d'onda e la frequenza della luce di emissione stimolata cambia quando particelle di luce incontro commovente globuli nei microvessels, o rimangono invariati. Pertanto, nella microcircolazione, il numero e la velocità delle cellule del sangue sono i fattori chiavi per la grandezza e la distribuzione di frequenza della luce Doppler-spostato, mentre la direzione del flusso sanguigno microvascolare è irrilevante. Utilizzando diversi metodi, una varietà di tessuti sono stati utilizzati per studi microcircolatori, compreso i mesenteries e dorsale dello skinfold alloggiamenti di topi, ratti, criceti e anche gli esseri umani8. Tuttavia, nel protocollo attuale, ci concentriamo sull'aspetto funzionale status di vasomotion microvascolare dell'isolotto pancreatico, che viene valutato utilizzando laser Doppler e un sistema di parametri di valutazione fatti in casa.

Microcircolazione dell'isolotto pancreatico è principalmente composto di isole pancreatiche microvasi e presenta caratteristiche peculiari. Una rete capillare di isole pancreatiche mostra una densità cinque volte più alto rispetto alla rete capillare della sua controparte esocrina9. Un condotto che prevede la consegna di ingresso del glucosio e di insulina divulgazione, le cellule endoteliali dell'isolotto forniscono ossigeno ai cellule metabolicamente attive nell'isolotto cellule β. Inoltre, la prova emergente dimostra inoltre che l'isolotto microvasi sono coinvolti non solo nella regolazione dell'espressione genica dell'insulina e sopravvivenza della β-cellula, ma anche nell'influenzare la funzione β-cellulare; promuovere la proliferazione delle cellule β; e producendo un numero di sostanze e fattori di crescita angiogenici vasoattivi,10. Pertanto, a questo proposito, si deduce che la condizione funzionale del vasomotion microvascolare dell'isolotto pancreatico può influenzare la funzione della β-cellula dell'isolotto ed essere coinvolta nella patogenesi di malattie come la pancreatite acuta/cronica, diabete e altri malattie del pancreas-relative.

Analizzare i cambiamenti patologici dello stato funzionale delle insule pancreatiche microvascolare vasomotion potrebbe essere una strategia fattibile per determinare i contributi della microcircolazione dell'isolotto pancreatico per le malattie di cui sopra. Fornire una descrizione dettagliata della procedura che descrive l'approccio per determinare isole pancreatiche vasomotion microvascolare in vivo . Misure tipiche vengono visualizzate nei Risultati di rappresentante. Infine, i vantaggi e le limitazioni del metodo sono evidenziate nella discussione, insieme a ulteriori applicazioni.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti nel rispetto di tutte le pertinenti linee guida, regolamenti e agenzie di regolamentazione. Il presente protocollo in questione è stato effettuato sotto la guida e l'approvazione dell'Istituto della microcircolazione animale etica Comitato (IMAEC) al Peking Union Medical College (PUMC).

1. gli animali

  1. Prima dell'inizio dell'esperimento, è necessario tenere tre topi BALB/c per gabbia, con temperatura controllata (24 ± 1 ° C) e umidità (55 ± 5%), sotto un ciclo luce-buio di 12 h. I topi consentire il libero accesso al cibo normale e acqua.
  2. Dividere in modo casuale i topi in un gruppo di controllo non-diabetico ed un gruppo diabetico. Pesare ogni singolo mouse e calcolare il volume di iniezione utilizzando la massa corporea di ogni mouse preciso.
  3. Veloce i topi per 4 h prima iniezione di streptozotocin (STZ) e fornire acqua normale come di consueto il giorno sperimentale 1.
  4. Preparare il tampone di citrato di sodio 0,1 M a pH 4,3. Mettere 1 mL di soluzione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e avvolgere il tubo del microcentrifuge nella carta stagnola per evitare l'esposizione alla luce.
  5. Sciogliere il STZ in tampone citrato di sodio (pH 4.3) ad una concentrazione finale di lavoro di 5 mg/mL prima dell'uso.
  6. Dare i topi delle iniezioni intraperitoneali gruppo diabetico di STZ alla dose di 40 mg/kg, utilizzando una siringa da 1 mL e un ago 25-G. Iniettare i topi del controllo non-diabetico con lo stesso volume di tampone citrato di sodio (pH 4,3).
  7. Rimettere i topi nelle gabbie e fornire loro cibo normale e 10% di acqua di saccarosio.
  8. Ripetere i passaggi da 1.3-1.7 sperimentale giorni 2-5 (cioè, i prossimi 4 giorni consecutivi).
  9. Sostituire l'acqua di 10% di saccarosio con acqua normale dopo l'ultima iniezione di STZ.
  10. Velocemente i topi per 6 h, ma dare loro libero accesso all'acqua e misurare i livelli di glucosio del sangue nove giorni più tardi (14 giorno sperimentale). Raccogliere un campione di sangue dalla vena caudale per confermare l'iperglicemia utilizzando un sistema di monitoraggio del glucosio nel sangue.
    Nota: I topi con sangue glucosio livelli > 200 mg / dL sono considerati diabetici.

2. preparazione dello strumento

  1. Pulire le superfici ottiche della punta della sonda e il connettore della sonda dell'apparato Doppler laser con un panno morbido e non abrasivo per rimuovere polvere o particelle. Collegare il cavo alla porta dello strumento (Figura 1A).
  2. Montare il supporto di calibrazione permettendo il flusso standard per essere in equilibrio termico con un ambiente sperimentale (temperatura ambiente, solitamente per 30 min). Agitare il flusso standard delicatamente per 10 s e lasciate riposare per 2 min.
  3. Posizionare il contenitore standard di flusso al centro della base di calibrazione. Sistemare il morsetto per l'altezza massima e fissare la sonda nel morsetto tale che punti verso il basso al contenitore. Assicurarsi che lo standard di flusso sia correttamente posizionato sotto la sonda.
  4. Spostare lentamente la sonda verso il basso fino a quando la punta è sommerso correttamente nello standard flusso. Selezionare e premere "taratura" sul laser Doppler apparato e scegliere il canale di lavoro che la sonda è collegata al. Eseguire il programma di calibrazione fino a quando un avviso di "Calibrazione riuscita" viene visualizzato sullo schermo del laser Doppler apparato.
  5. Fissare la sonda utilizzando supporti di sonda. Proteggere manualmente la sonda per evitare movimenti.
  6. Mantenere la stanza sperimentale a temperatura costante (24 ± 1 ° C) e umidità (~ 50-60%).
  7. Disattivare qualsiasi luce esterna (come lampade fluorescenti e spot) prima di eseguire l'esperimento per evitare il cambiamento indotto dalla luce esterna.

3. preparazione degli animali

  1. Autoclave la chirurgico strumenti e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente prima dell'uso.
  2. Dare i topi 10 min per acclimatarsi all'ambiente sperimentale prima rilevazione dell'isolotto pancreatico microvascolare vasomotion dal laser Doppler.
  3. Riempire una siringa da 1 mL con 1 mL di sodio pentobarbital 3%. Iniettare la soluzione di sodio pentobarbital (75 mg/kg i.p.) per anestetizzare i topi.
  4. Coprire gli occhi del mouse con garza medica pre-umidificata per prevenire la secchezza.
  5. Assicurarsi che il mouse perde completamente la coscienza e non risponde più alla coda o retropiede pizzica con il forcipe. Monitorare l'anestesia durante tutto l'evento di anestetico e intra-operatoria ogni 15 min. mantenere l'anestesia, completandola con il 10% del volume iniziale iniezione della soluzione pentobarbital quando necessario.
  6. Posizionare un rilievo di riscaldamento con uno strato semi-isolante sotto l'animale e metti l'animale in posizione supina e trasferimento per la stazione di lavoro del laser Doppler apparato. Difficoltà il mouse per la piattaforma di funzionamento con nastro chirurgico.
  7. Tampone pelle addominale del mouse con betadine e poi 75% etanolo viene utilizzato a tampone pulito la zona addominale.
  8. Iniettare per via sottocutanea 2% lidocaine/0.5% bupivacaine miscela (50/50).  Tagliare un cm ~ 3-foro di diametro al centro di una garza-spugna. Coprire la regione addominale con la spugna di garza.
  9. Sollevare la pelle addominale con il forcipe e praticare un'incisione verticale iniziale lungo la linea mediana dell'addome utilizzando un paio di forbici bisturi o pelle.
  10. Afferrare il muscolo sottostante con la pinzetta e incise per entrare nella cavità addominale. Non ferire qualsiasi altro organo. Piegare la pelle e il muscolo di fondo sopra la cassa per rivelare la cavità addominale. Delicatamente esporre il corpo del pancreas e la milza usando un paio di pinze dal naso smussato.

4. dati acquisizione per l'analisi

  1. Eseguire il software dell'apparato Doppler laser facendo clic su "File" → "Nuovo" per creare un nuovo file di misurazione. Per configurare il monitor connessi, nella scheda "Generale", impostare la durata del monitoraggio su "Free run". Utilizzare le impostazioni predefinite per la scheda "Monitor LDF" fare clic su "Avanti".
  2. Impostare la visualizzazione del grafico in the "display setup dialog box." Selezionare i canali di "Velocità di flusso, Conc," selezionando le rispettive caselle. Selezionare i seguenti parametri: "Origine dati per il canale" e "etichetta, unità e colore." Fare clic su "Avanti".
  3. Immettere le informazioni utente il soggetto e la misurazione (cioè, nome e numero di soggetto, operatore, monitoraggio tempo, commenti, ecc.) in "file informazioni nella finestra di dialogo" e fare clic su "Next" per terminare la configurazione di misura.
    Nota: Una finestra di misurazione viene creata automaticamente dal software (Figura 1B).
  4. Manualmente è possibile avanzare l'elettrodo al pancreas. Assicurarsi che la distanza tra la sonda e pancreas tessuti sia all'interno di 1mm. Una distanza inappropriata dà una lettura del flusso di sangue artificialmente aumentata o diminuita.
  5. Fare clic sull'icona della barra degli strumenti "Start" per iniziare a registrare i dati di unità (PU) aspersione sanguigno microvascolare. Raccogliere i dati di PU continuamente per 1 minuto ogni run. Fare clic su "Stop" per interrompere la misurazione. Selezionare "File" → "Salva come" per nome e salvare il file finito misura.
  6. Riposizionare manualmente la sonda dopo ogni corsa per evitare effetti additivi e l'esaurimento localizzata di contrattile e la capacità di rilassamento. Ripetere i passaggi 4.1-4.4 per raccogliere dati di PU microvascolari multi-punto (cioè, tre punti scelti a caso dal tessuto pancreatico) per ogni mouse. Misurare i dati dell'unità di elaborazione di un piatto antiriflesso come controllo della linea di base.
  7. Chiudere lo strato del muscolo addominale e lo strato della pelle con una sutura. Sistemare gli animali in gabbie pulite dopo gli esperimenti.
  8. Mantenere l'animale caldo inserendo la gabbia di recupero mezzo-il termoforo.
    Nota: Prestare attenzione al calore, igiene, fluido e l'ingestione di cibo e infezione. Amministrare i topi con 2 mg/kg Carprofen per 48 h come trattamento del dolore postoperatorio.  Eseguire l'eutanasia iniettando 150 mg/kg i.p. di sodio pentobarbital quando topi sono osservati per essere in uno stato di grave dolore o disagio che non può essere alleviato.

5. calcolo dei parametri di Vasomotion microvascolare

  1. Utilizzare il comando "Esporta" del laser Doppler software per esportare il tempo e dati grezzi PU come file *. xlsx e aprire il file in un foglio di calcolo.
  2. Calcolare l'unità di perfusione basale medio (PUb) (Vedi punto 4.6).
  3. Calcolare l'aspersione di sangue medio (PUun) per 1 min di una misura come segue: media aspersione del sangue (PUun) = PU - PUb (equazione 1).
  4. Calcolare la frequenza (cicli/min) per ogni 1 min di misurazione.
    Nota: La frequenza di vasomotion microvascolare è definita come il numero di picchi che si è verificato in un'onda di vasomotion microvascolare al minuto.
  5. Calcolare l'ampiezza (ΔPU) per ogni 1 min di misurazione.
    1. Calcolare l'ampiezza del vasomotion microvascolare come differenza tra il minimo (PUmin) e massimo (PUmax): ampiezza (ΔPU) = PUmax - PUmin (equazione 2).
  6. Calcolare la velocità relativa (PU) per ogni 1 min di misurazione.

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Risultati

Una fotografia del laser di misurazione microvascolare vasomotion Doppler apparato dotato di un diodo laser a semiconduttore è mostrata in Figura 1A. Software di interfaccia utente è presentato in Figura 1B. Utilizzando il metodo di cui sopra, i parametri emodinamici di vasomotion microvascolare dell'isolotto pancreatico sono stati rilevati per controllo non-diabetico e topi diabetici. Una varietà di tecniche, tra cui flussometri...

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Discussione

Nei casi che coinvolgono la disfunzione microvascolare (ad es., diabete, pancreatite acuta, malattie microvascolari periferiche, ecc.), alcune malattie portare alla riduzione del flusso sanguigno. Diverso da cambiamenti nel flusso sanguigno, non ci sono indicatori importanti, quali microvascolare vasomotion, che rispecchiano la condizione funzionale del microcircolo. L'indicatore specifico, vasomotion microvascolare, è generalmente definito come l'oscillazione del tono microvascolare in letti microvasco...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Peking Union Medical College Youth Fund e i fondi di ricerca fondamentali per le Università centrale (Grant No. 3332015200).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
MoorVMS-LDF2Moor InstrumentsGI80PeriFlux 5000 (Perimed Inc.) può essere utilizzato come apparato alternativo per la raccolta dei dati
MoorVMS-PC SoftwareMoor InstrumentsGI80-1Software di MoorVMS-LDF2
Supporto di calibrazioneMoor InstrumentsStrumento di calibrazioneGI-cal
Base di calibrazioneMoor InstrumentsGI-cal
Flusso di calibrazione standardMoor InstrumentsStrumento di calibrazioneGI-cal
Glucometro One Touch UltraEasyJohnson and Johnson#1955685Conferma dell'iperglicemia
Strisce One Touch UltraEasyJohnson and Johnson#1297006 Conferma dell'iperglicemia
StreptozotocinaSigma-AldrichS0130Sciogliere in tampone citrato di sodio (pH 4,3)
Pentobarbital sodicoSigma-AldrichP3761Concentrazione di lavoro 3 %
EtanoloSinopharm Inc.200121Concentrazione di lavoro 75 %
SaccarosioAmresco335Concentrazione di lavoro 10 %
Garza medicaChina Health Materials Co.S-7112Pinza chirurgica
naso smussatoShang Hai Surgical Instruments Inc.N-551Nastri chirurgici
3M Company3664CUSpugna
garzaFu Kang Sen Dispositivo medico CO.BB5447Bisturi chirurgico
Yu Lin Surgical Instruments Inc.175CForbici chirurgiche
per la pelleCarent255-17Sutura chirurgica
Ning Bo Surgical Instruments Inc.3325-77
Siringa chirurgica e ago da 25 GMISAWA Inc.3731-2011Scala: 1 ml
Strumento di calibrazione a chirurgici chirurgica

Riferimenti

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