Descriviamo un metodo basato su HPLC per la determinazione dell'acido N-acetilneuraminico e dell'acido N-glicolilenraminico nel fegato e nel latte del topo.
Articolo metodologico
Descriviamo un metodo basato su HPLC per la determinazione dell'acido N-acetilneuraminico e dell'acido N-glicolilenraminico nel fegato e nel latte del topo.
CMAH (idrossilasi di citidina monofosfato-N-acetilneuraminico idrossilasi) è responsabile dell'ossidazione degli acidi citidina monofosfato-N-acetilneuraminico nei mammiferi. Tuttavia, l'uomo non può ossidare l'acido di citidina monofosfato-N-acetilneuraminico a acido citidico monofosfato-N-glicolico-neuraminico a causa di una delezione primaria di esone del gene CMAH . Per comprendere in modo più approfondito gli effetti e le implicazioni della mancanza di attività CMAH , il modello Cmah in topi è di grande interesse per la ricerca di base e applicata. Il metodo di analisi per determinare il fenotipo di questo modello di topo è qui descritto in dettaglio e si basa sulla rilevazione dell'acido N-acetilneuraminico e dell'acido N-glicolenuraminico nel fegato e nel latte di topi di tipo selvatico e Cmah . Gli acidi sialici endogeni vengono liberati e derivatizzati con o-fenilendiammina per generare derivati fluorogenici, che possono essere successivamente analizzati mediante HPLC. Il protocollo presentato può essereAnche applicato per l'analisi di campioni di latte e tessuti provenienti da varie altre origini e può essere utile per indagare gli effetti nutrizionali e sanitari dell'acido N-glycolylneuraminic.
L'acido N-acetilneuraminico (Neu5Ac) e l'acido N-glycolylneuraminic (Neu5Gc) sono gli acidi sialici più comuni nella maggior parte dei mammiferi 1 . Sebbene in grado di sintetizzare Neu5Ac in modo endogeno, gli esseri umani non sono in grado di produrre Neu5Gc a causa di una delezione primaria dell'esone sul gene CMAH che codifica per una CMP-Neu5Ac idrossilasi 2 , 3 . Tuttavia, i prodotti alimentari a base di animali possono essere fonti dietetiche di Neu5Gc 4 , 5 , 6 , c....
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Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal comitato etico del Centro sperimentale animale dell'Università agricola di Nanjing in conformità alle linee guida nazionali per il benessere degli animali sperimentali (Ministero della scienza e della tecnologia, PR della Cina, 2006) con gli animali alloggiati in un SPF (ID di autorizzazione: SYXK-J-2011-0037).
1. Modello del mouse di Knock-out Cmah
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Una panoramica schematica del metodo di analisi descritto è mostrato nella figura 1 e comprende l'isolamento di acidi sialici da campioni di fegato di latte e fegato di topi mutanti topi di tipo selvatico e Cmah , e la derivatizzazione fluorescente e l'analisi HPLC di questi componenti. Le figure 2 e 3 illustrano cromatogrammi HPLC rappresentativi di ac.......
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Il protocollo qui presentato consente di valutare fenotipicamente i topi omotigmatici di Cmah knock-out analizzando e quantificando le quantità relative di Neu5Gc di campioni di latte e fegato. L'analisi è stata eseguita utilizzando una configurazione standard HPLC con rilevazione di fluorescenza. La fase più critica di questa procedura è la preparazione delle colonne di scambio anionico e l'esecuzione della cromatografia per l'anione; Per sistemare correttamente la resina e per raccogliere.......
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Fondazione della Scienza Naturale della Cina (numeri di sovvenzione 31471703, A0201300537 e 31671854 per JV e LL) e 100 piani di talenti stranieri (numero di sovvenzione JSB2014012 a JV).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sostanze chimiche: | |||
| N-acetilneuraminico | Sigma | A0812 | |
| Acido N-glicolilneuraminico | Sigma | 50644 | 1 mg aliquota dovrebbe essere sufficiente |
| o-Fenilendiammina | Sigma | 694975 | |
| Idrogeno solfito di sodio | J& K Scientific Ltd | 75234 | |
| Strumenti/Materiali: | |||
| 3 mL Provette SPE | Supelco | Sigma 57024 | colonne di estrazione in fase solida vuote |
| Rubinetto Luer | Sigma | S7396 | per fermare il flusso del tubo SPE |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200 - 400 mesh |
| Macinatore di tessuti Dounce | Sigma | D8938 | aderente |
| HPLC Analisi: | |||
| Fiala HPLC ad alto recupero | Tecnologie Agilent | #5188-2788 | |
| Sistema HPLC | Shimadzu | Nexera | |
| per HPLC | Colonna Shimadzu | RF-20Axs | |
| Phenomenex | Hyperclone ODS | 250 x 4,6 mm | |
| LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| Acetonitrile LCMS-grade | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
| Soluzione di idrossido di ammonio | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |
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