L'elettroforesi natale di poliacrilammide è uno strumento fondamentale per analizzare le interazioni tra proteine RNA. Tradizionalmente la maggior parte degli esperimenti hanno utilizzato gel verticale. Tuttavia, i gel orizzontali offrono diversi vantaggi, come l'opportunità di monitorare i complessi durante l'elettroforesi. Forniamo un protocollo dettagliato per la generazione e l'uso di elettroforesi geotermica orizzontale.
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Articolo metodologico
Elettroforesi gel orizzontale per la rilevazione avanzata dei complessi proteina-RNA
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'elettroforesi natale di poliacrilammide è uno strumento fondamentale della biologia molecolare che è stato usato ampiamente per l'analisi biochimica delle interazioni di proteine RNA. Queste interazioni sono state tradizionalmente analizzate con gel di poliacrilammide generati tra due lastre di vetro e campioni elettroforati verticalmente. Tuttavia, i gel di poliacrilamide gettati in vassoi e elettroforesi orizzontalmente offre diversi vantaggi. Ad esempio, i gel orizzontali utilizzati per analizzare complessi tra substrati di RNA fluorescenti e proteine specifiche possono essere riprese più volte come l'avanzamento dell'elettroforesi. Questo fornisce l'opportunità unica di monitorare complessi proteina RNA in diversi punti durante l'esperimento. Inoltre, l'elettroforesi orizzontale a gel permette di analizzare molti campioni in parallelo. Ciò può notevolmente facilitare esperimenti di tempo e analizzare più reazioni simultaneamente per confrontare componenti e condizioni differenti. Qui abbiamo prOvide un protocollo dettagliato per la generazione e l'utilizzo di elettroforesi geotermica orizzontale per l'analisi delle interazioni RNA-Protein.
Introduzione
I test di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSAs) hanno dimostrato di essere uno strumento prezioso biochimico per analizzare le interazioni specifiche dell'acido nucleico-proteico 1 , 2 , 3 . Questi test possono fornire informazioni importanti riguardo all'affinità di legame delle proteine all'RNA o al DNA 3 , la stechiometria del complesso 1 dei proteine nucleici e fornire importanti novità circa la specificità di legame delle proteine legate all'RNA tramite esperimenti di concorrenza del subs....
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Protocollo
1. Preparazione del Gel Naturale Orizzontale di Polyacrylamide 4 .
- Preparazione dei materiali necessari.
- Per l'apparecchio a gel orizzontale, utilizzare una scatola di gel (37 cm x 24 cm) con vassoio da 27 cm x 21 cm e una capacità per due pettini a 24 pozzetti. Questa impostazione fornisce un totale di 48 campioni che possono essere analizzati contemporaneamente.
- Preparare i reagenti seguenti: 40% Acrilammide-Bis 19: 1, 5x TBE (Tris-Borato-EDTA pH 8,0), TEMED e 10% APS (ammonio persolfato).
- Generazione di un gel nativo di acrilammide al 10%.
- In un....
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Risultati
Per dimostrare la potenza e la versatilità dell'elettroforesi gel geo orizzontale abbiamo analizzato il legame della proteina Xenopus Bicaudal-C (Bicc1) a un RNA a fluorescenza etichettato contenente un sito di legame Bicc1. Le proteine Bicc1 funzionano come repressori transazionali trasversali mRNA per controllare le decisioni del destino cellulare durante le fasi materne dello sviluppo animale 9 , 10 ,.......
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Discussione
I gel naturali di polyacrylamide sono uno strumento prezioso per indagare le interazioni proteina-RNA e tradizionalmente questi gel sono elettroforizzati verticalmente 2 , 3 . Abbiamo utilizzato una modifica del protocollo che sostituisce gel naturali di poliacrilammide creati ed elettroforesi orizzontalmente 1 , 4 , 6 , 7 ,.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Laura Vanderploeg per la preparazione di figure. Il lavoro nel laboratorio Sheets è supportato dalla sovvenzione NSF 1050395 e dalla concessione di NIH (R21HD076828). Il lavoro nel laboratorio di Ryder è supportato da NIH concede R01GM117237 e R01GM117008. Megan Dowdle è sostenuta da una Scienza GRS Advanced Opportunity Fellowship attraverso l'Università di Wisconsin-Madison Scuola di Laurea e Programma di Formazione Biotecnologia attraverso l'Istituto Nazionale delle Scienze Mediche Generali degli Istituti Nazionali di Salute (T32GM008349).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Scatola Gel Orizzontale | OWL | N/A | Prodotto non più realizzato. Scatole di gel simili possono essere trovate presso Thermo Scientific, scatole di gel della serie A. Numero di catalogo: A2-BP |
| Pettini per elettroforesi su gel orizzontali grandi a 24 pozzetti | OWL | N/A | Prodotto non più prodotto. Scatole di gel simili possono essere trovate presso Thermo Scientific, pettini per scatole di gel della serie A. Numero di catalogo: A2-24C |
| Powerpac 300 | Bio-Rad | 1655050 | |
| Cella per elettroforesi Mini-Protean II | Bio-Rad | 165-2940 | |
| InstaPAGE-19 40% 19:1 Acrilammide/Bis | IBI | IB70015 | |
| TEMED | IBI | IB70120 | |
| APS | IBI | IB70080 | |
| tRNA di lievito | Ambion | AM7119 | |
| IDT | N/A | marcato con fluoresceina L'ordine | può essere effettuato in base alla lunghezza e alla sequenza desiderata |
| EDTA sale tetrasodico idrato | Sigma-Aldrich | E5391-1KG | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Tris Base Acido | T8600 | statunitense | |
| Scientific | BP168-500 | ||
| Cloruro di potassio | Fisher Scientific | BP366-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | 1609-47-8 | |
| Ditiotreitolo (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483 12 3 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 |
Riferimenti
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. Electrophoretic characterization of bacteri....
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Ristampe e permessi
