Protocolli per lo studio dell'aorta murino embrionale e perinatale, usando in vivo analisi clonale e destino mapping, espianti aortiche e muscolo liscio isolato cellule sono dettagliate qui. Questi diversi approcci l'espletamento dell'indagine della morfogenesi dell'aorta embrionale e perinatale nello sviluppo normale e la patogenesi in malattia.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Usando In Vivo e del tessuto e delle cellule Explant approcci per studiare la morfogenesi e la patogenesi dell'Aorta embrionale e perinatale
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'aorta è la più grande arteria del corpo. La parete aortica è composto da uno strato interno di cellule endoteliali, uno strato intermedio di alternanza di lamelle elastiche e cellule muscolari lisce (CML) e uno strato esterno di fibroblasti e la matrice extracellulare. In contrasto con lo studio diffuso di modelli patologici (ad es., aterosclerosi) nell'aorta adulto, molto meno è conosciuto circa l'aorta embrionale e perinatale. Qui, ci concentriamo su SMCs e fornire protocolli per l'analisi di morfogenesi e patogenesi di SMCs aortico embrionale e perinatale nello sviluppo normale e malattia. In particolare, sono i quattro protocolli inclusi: io) in vivo embrionali destino Mappatura e analisi clonale; II) espianto embrionale dell'aorta cultura; III) isolamento di SMC dall'aorta perinatale; e iv) posizionamento sottocutaneo mini pompa osmotica nei topi in gravidanza (o non gravide). Quindi, questi approcci facilitano l'indagine del finale, destino e architettura clonale di SMCs nel aorta in vivo. Essi consentono di modulazione morfogenesi embrionale dell'aorta in utero tramite l'esposizione continua agli agenti farmacologici. Inoltre, espianti di tessuto aortico isolato o SMCs aortico può essere utilizzato per approfondire il ruolo di specifici geni bersaglio durante processi fondamentali quali muscularization, la proliferazione e la migrazione. Questi esperimenti di generazione di ipotesi su SMCs isolato e l'aorta explanted quindi possono essere valutati nel contesto in vivo attraverso approcci farmacologici e genetici.
Introduzione
Il sistema circolatorio del funzione di organismi multicellulari a fornire sostanze nutritive e ossigeno alle cellule che sono non a contatto con l'ambiente esterno e per rimuovere i prodotti di scarto e biossido di carbonio da queste cellule. Nei vertebrati, il sistema circolatorio primario consiste del cuore, che pompa il sangue attraverso una serie di vasi sanguigni. Le pareti dei vasi sanguigni, come arterie e vene, sono costituiti da tre strati: i) la biancheria intima, o strato interno delle cellule endoteliali; II) la media, o strato intermedio della alternando circonferenzialmente allungata in cellule muscolari lisce CML e lamelle elastiche; e iii) il adventit....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
tutti i protocolli del mouse sono approvati dal comitato di uso alla Yale University e istituzionali Animal Care.
1. In Vivo embrionali destino Mappatura e analisi clonale
Nota: abbiamo usato ampiamente questi approcci per valutare le origini delle cellule e la loro architettura clonale in modelli di sviluppo e malattia 7 , 8 , 9 , 10.
- impostare accoppiamento fra i topi con un CreER e topi con un reporter di Cre.
Nota: Un CreER viene utilizzato per SMC m....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
In una rappresentativa analisi clonale di SMCs nel mutante di embrioni per Eln (il gene che codifica per l'elastina di proteine della matrice extracellulare), Eln(+ /-), Acta2-CreERT2 topi erano abbinati ad Eln(+ /-) topi anche portando il multi-colore ROSA26R(Rb/Rb) reporter. Come descritto nel passaggio 1, spine sono state controllate, incinte dighe sono state indotte con un'iniezione singola tamoxifen (1,5 mg) a 1.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
In contrasto con le vaste indagini di murino aorta ed i relativi rami principali in adulte condizioni patologiche, quali modelli di aterosclerosi, di meno è conosciuto per quanto riguarda la morfogenesi e la patogenesi dell'aorta embrionale e perinatale. Qui, ci concentriamo sull'aorta embrionale/perinatale, in particolare i paesi del Mediterraneo meridionale e fornire protocolli per studiare l'aorta attraverso in vivo, espianto di tessuto, e isolamento di SMC si avvicina. Questi approcci gratuiti forniscono l'i.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Dean Li per la condivisione di protocollo del suo laboratorio per aortica SMC isolamento. Sostegno finanziario è stato fornito dal National Institutes of Health (R21NS088854, R01HL125815 e R01HL133016 a D.M.G), l'American Heart Association (sovvenzione dai 14GRNT19990019 a D.M.G) e Yale University (Brown-Coxe Fellowship di A.M. e avvio fondi per D.M.G).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tamoxifene | Sigma | T5648 | |
| Olio di mais | Sigma | C-8267 | Veicolo per tamoxifene |
| 4-OH-tamoxifene | Sigma | H7904 | Metabolita attivo del tamoxifene |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Utilizzare a metà della concentrazione di tamoxifene |
| OCT composto | Sakura tessuto tek | 4583 | Per la produzione di crioblocchi |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | Colorazione IHC del nucleo, concentrazione finale 5 mg/mL |
| Cy3 anticorpo anti-SMA coniugato direttamente | Sigma | A2547 | Colorazione IHC della SMA, diluizione finale 1:500 |
| Anticorpo anti-CD31 | BD Pharmingen | 550274 | Colorazione IHC della GFP, concentrazione finale 0,006 mg/mL |
| Anticorpo anti-GFP | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | Colorazione IHC di CD31, concentrazione finale 0,0016 mg/mL |
| Anticorpo secondario capra anti-coniglio, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | Colorazione IHC, concentrazione finale 0,004 mg/mL |
| Anticorpo secondario capra anti-coniglio, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | Colorazione IHC, concentrazione finale 0,004 mg/mL |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | Per colture cellulari |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anticorpo bloccante la beta3 anti-integrina | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9. G2, concentrazione finale 0,02 mg/mL |
| Collagenasi | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | Per digerire l'aorta |
| Elastasi | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | Per digerire l'aorta |
| Antibiotico-antimicotico (100X) | Thermo Fisher Scientific 15240062 | ||
| Ricombinante umano FGF | Promega | G5071 | |
| Ricombinante umano EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillina/streptomicina (10.000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amfotericina B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Piastre per colture tissutali | Corning | CLS430165 | |
| Alzet minipompa osmotica | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Microscopio a fluorescenza | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 topi | Il laboratorio Jackson | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 | Ottenuti dal laboratorio del Dr. Pierre Chambon e Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 topi | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| topi ROSA26R(mTmG/mTmG) | Il laboratorio Jackson | ||
| ROSA26R topi (EYFP/EYFP) | Il laboratorio Jackson | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) topi | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R (Rb/Rb) topi | Laboratorio del Dr. Irv Weissman | Ottenuto dal laboratorio del Dr. Irv Weissman |
Riferimenti
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
- Rowe, V. L., et al. Vascular smoo....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
