Qui presentiamo un protocollo per l'imaging in diretta di fusione secondaria del palato del mouse usando la microscopia confocale. Questo protocollo può essere utilizzato in combinazione con una varietà di linee fluorescenti del mouse del reporter, e con inibitori del percorso per l'intuizione meccanica. Questo protocollo può essere adattato all'immagine dal vivo in altri sistemi di sviluppo.
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Articolo metodologico
Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion
In questo articolo
Sommario
Abstract
La fusione degli scaffali palatali secondari per formare il palato secondario intatto è un processo chiave nello sviluppo mammifero e la sua rottura può portare a palato secondario, una comune anomalia congenita negli esseri umani. La fusione secondaria del palato è stata ampiamente studiata portando a diversi meccanismi cellulari proposti che possono mediare questo processo. Tuttavia, questi studi sono stati eseguiti principalmente su tessuti embrionali fissi a tempi progressivi durante lo sviluppo o in colture fisse esplorate analizzate a tempi statici. L'analisi statica è limitata per l'analisi di processi morfogenetici dinamici come una fusione di palato e quali tipi di comportamenti cellulari dinamici mediare la fusione palatale è incompleta. Qui si descrive un protocollo per l'imaging dal vivo di ex vivo fusione palato secondario in embrioni di topo. Per esaminare i comportamenti cellulari della fusione del palato, la chirurgia Keratin14 specifica epiteliale è stata usata per etichettare le cellule epiteliali del palato in ROSEmbrioni A26-mTmG flox reporter. Per visualizzare l'actina filamentosa, sono stati utilizzati topi reattore Lifeact-mRFPruby . L'imaging in vivo di fusione secondaria del palato è stato eseguito dissezionando i ripiani secondari palatali recentemente aderiti di embrioni di fase di embrione (E) 14.5 e coltivando in supporti contenenti agarosio su un piatto di fondo in vetro per consentire l'imaging con un microscopio confocale invertito. Utilizzando questo metodo, abbiamo rilevato una varietà di nuovi comportamenti cellulari durante la fusione secondaria del palato. Un apprezzamento di come i comportamenti cellulari distinti sono coordinati nello spazio e nel tempo contribuiscono notevolmente alla nostra comprensione di questo processo morfogenetico dinamico. Questo protocollo può essere applicato alle linee del topo mutante o alle colture trattate con inibitori farmacologici per migliorare ulteriormente la comprensione di come viene controllata la fusione secondaria del palato.
Introduzione
La fusione tissutale è un passo importante nello sviluppo di organi multipli. I principali difetti della nascita umana, quali il labbro e il palato, la bifida delle spine e le malformazioni del cuore possono derivare da difetti nella fusione tissutale 1 . La fusione del palato secondario del mouse è stata ampiamente studiata per identificare i meccanismi cellulari e molecolari che controllano la fusione tissutale nello sviluppo 2 , 3 , 4 . Nel topo, lo sviluppo del palato secondario inizia a circa E11.5 con l'espansione di un ripiano secondario pa....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti su animali sono stati eseguiti in conformità ai protocolli dell'Università della California a San Francisco, istituto di cura e uso degli animali.
1. Preparazione di Media Live Imaging
- Preparazione di supporti di coltura liquida
- Aggiungere 20% di siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 U / mL penicillina, 100 μg / mL streptomicina, 200 μg / mL acido L-ascorbico, 15 mM HEPES a Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 media.
NOTA: Il supporto di imaging live è stato appena fatto prima dell'immagine. Questo supporto contiene fenolo-rosso che può porta....
- Aggiungere 20% di siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 U / mL penicillina, 100 μg / mL streptomicina, 200 μg / mL acido L-ascorbico, 15 mM HEPES a Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 media.
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Risultati
L'imaging in vivo della cultura esplante del palato ha rivelato molteplici processi cellulari che mediano la fusione dei palati 6 . I contatti iniziali tra due cellule epiteliali sono fatti da protuberanze a membrana ( Figura 2 B-2E ). Quando due strati epiteliali si incontrano, formano una MES stratificata a più cellule seguita da intercalazione per creare un unico MES a livello cellulare integrato attraverso la .......
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Discussione
L'imaging in tempo reale della morfogenesi tissutale con la cultura dell'esplosivo dell'organo 3D può fornire informazioni dettagliate sui processi cellulari che non possono essere mostrati in analisi convenzionali di colorazione delle sezioni dei tessuti fissi. Utilizzando la cultura esplante in vitro del palato secondario embrionale del mouse, abbiamo osservato diversi comportamenti cellulari interessanti che ci hanno portato a proporre un nuovo meccanismo di fusione di palato che coinvolge la con.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo M. Douglas Benson per le prime conversazioni riguardanti l'imaging secondario del palato. Riconosciamo anche David Castaneda-Castellanos (Leica) e Chris Rieken (Zeiss) per il loro aiuto per regolare le condizioni di imaging in microscopia confocale. Apprezziamo Lynsey Hamilton (Bitplane) per suggerimenti utili per l'analisi quantitativa di immagini utilizzando il software Imaris. Questo lavoro è stato finanziato da NIH / NIDCR R01 DE025887.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti | |||
| DMEM/F12 | Tecnologia di vita | 11330-032 | |
| Siero fetale bovino Tecnologia | di vita | 16000-044 | |
| L-glutammina | Tecnologia di vita | 25030-081 | |
| Acido L-ascorbico | Sigma | A4544-100G | |
| Penniccia/Streptomicina | Life technology | 15140-122 | |
| Basso punto di fusione agarosio | BioExpress | E-3111-125 | |
| Piatto con fondo in vetro da 35 mm | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Gelatina di Petrolieum (vaselina) | Sigma | 16415-1Kg | |
| Mice | |||
| Keratin14-cre | MGI: J:65294 | Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc< | |
| em>ROSA26mTmG | MGI: J:124702 | Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo | |
| Lifeact-mRFPruby | MGI: J:164274 | Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows | |
| Microscope | |||
| White Light SP5 microscopio confocale | Leica Microsystems | ||
| Cell Observer microscopio confocale a disco rotante | Zeiss Microscopy |
Riferimenti
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Dev. Camb. Engl. 139, 1701-1711 (2012).
- Dudas, M., Li, W. -Y., Kim, J., Yang, A., Kaartinen, V. Palatal fusion - where do the midline cells go? A review on cleft palate, a major human birt....
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Ristampe e permessi
