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Articolo metodologico

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

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DOI:

10.3791/56041

⸱

27 luglio 2017

 ,  , 
1Department of Cell and Tissue Biology, Program in Craniofacial Biology and Institute for Human Genetics, University of California San Francisco, 2Laboratory of Transgenic Models Diseases, Czech Centre for Phenogenomics, Institute of Molecular Genetics of the Czech Academy of Sciences

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per l'imaging in diretta di fusione secondaria del palato del mouse usando la microscopia confocale. Questo protocollo può essere utilizzato in combinazione con una varietà di linee fluorescenti del mouse del reporter, e con inibitori del percorso per l'intuizione meccanica. Questo protocollo può essere adattato all'immagine dal vivo in altri sistemi di sviluppo.

Abstract

La fusione degli scaffali palatali secondari per formare il palato secondario intatto è un processo chiave nello sviluppo mammifero e la sua rottura può portare a palato secondario, una comune anomalia congenita negli esseri umani. La fusione secondaria del palato è stata ampiamente studiata portando a diversi meccanismi cellulari proposti che possono mediare questo processo. Tuttavia, questi studi sono stati eseguiti principalmente su tessuti embrionali fissi a tempi progressivi durante lo sviluppo o in colture fisse esplorate analizzate a tempi statici. L'analisi statica è limitata per l'analisi di processi morfogenetici dinamici come una fusione di palato e quali tipi di comportamenti cellulari dinamici mediare la fusione palatale è incompleta. Qui si descrive un protocollo per l'imaging dal vivo di ex vivo fusione palato secondario in embrioni di topo. Per esaminare i comportamenti cellulari della fusione del palato, la chirurgia Keratin14 specifica epiteliale è stata usata per etichettare le cellule epiteliali del palato in ROSEmbrioni A26-mTmG flox reporter. Per visualizzare l'actina filamentosa, sono stati utilizzati topi reattore Lifeact-mRFPruby . L'imaging in vivo di fusione secondaria del palato è stato eseguito dissezionando i ripiani secondari palatali recentemente aderiti di embrioni di fase di embrione (E) 14.5 e coltivando in supporti contenenti agarosio su un piatto di fondo in vetro per consentire l'imaging con un microscopio confocale invertito. Utilizzando questo metodo, abbiamo rilevato una varietà di nuovi comportamenti cellulari durante la fusione secondaria del palato. Un apprezzamento di come i comportamenti cellulari distinti sono coordinati nello spazio e nel tempo contribuiscono notevolmente alla nostra comprensione di questo processo morfogenetico dinamico. Questo protocollo può essere applicato alle linee del topo mutante o alle colture trattate con inibitori farmacologici per migliorare ulteriormente la comprensione di come viene controllata la fusione secondaria del palato.

Introduzione

La fusione tissutale è un passo importante nello sviluppo di organi multipli. I principali difetti della nascita umana, quali il labbro e il palato, la bifida delle spine e le malformazioni del cuore possono derivare da difetti nella fusione tissutale 1 . La fusione del palato secondario del mouse è stata ampiamente studiata per identificare i meccanismi cellulari e molecolari che controllano la fusione tissutale nello sviluppo 2 , 3 , 4 . Nel topo, lo sviluppo del palato secondario inizia a circa E11.5 con l'espansione di un ripiano secondario palatale da ognuno dei processi bilaterali maxillari. La crescita iniziale degli scaffali palatali si verifica verticalmente lungo la lingua, fino a circa l'E14.0, durante i quali gli scaffali palatari si elevano orizzontalmente sopra la lingua. La crescita medialmente diretta produce un contatto fisico tra l'epiteli apposita dei due ripiani palatari, formando l'epitelio della medianaAl seam (MES) a E14.5. Il MES interveniente deve essere rimosso tra gli scaffali palatali secondari per consentire la confluenza mesenchimale e lo sviluppo di un palato secondario intatto, completamente fuso, da E15.5 3 .

Come uno strato di cellule MES epiteliale condiviso tra due mensole palatine separate e poi rimosso per ottenere confluenza mesenchimale, è stata una questione centrale nello sviluppo del palato. Sulla base di studi sul microscopio istologico e elettronico del microscopio (EM), sugli studi sulla cultura esplosiva e sugli esperimenti funzionali di genetica del mouse, sono stati implicati diversi comportamenti di cellule fondamentali in questo processo. Le proiezioni simili a filopodie dall'epitelio mediale del bordo MEE di ogni mensola palatina facilitano il contatto iniziale 5 , 6 , seguito da intercalazione di queste cellule epiteliali a un singolo MES 6 , 7 condiviso. Rimozione della conseguente MES condivisaÈ stato proposto di procedere con tre meccanismi non esclusivi. Gli studi iniziali che impiegavano osservazioni istologiche e tracciamento lineare ex vivo con coloranti vitali indicavano che la MES potrebbe essere rimossa dall'epitelio alla transizione mesenchimale (EMT) delle cellule MES 8 , 9 , anche se più recentemente il tracciamento genetico delle cellule epiteliali ha aumentato l'incertezza Il contributo a lungo termine delle cellule epiteliali al mesenchimico palatale 10 , 11 , 12 . Un numero significativo di cellule apoptotiche e una riduzione del loro numero in alcuni mutanti che non subiscono una corretta fusione di palato hanno portato all'idea che l'apoptosi può essere un fattore importante della dissoluzione MES 2 , 3 . Infine, basata inizialmente su studi che coinvolgono l'etichettatura epiteliale e l'osservazione statica a tempi progressivi, le cellule MESSono stati proposti di migrare nelle dimensioni oronasali e anteroposterior 11 , 13 , ma tali comportamenti dinamici di cellule sono stati inizialmente non confermati a causa di una incapacità di osservarli nel tessuto palatale vivo. Recentemente siamo stati in grado di osservare direttamente questi comportamenti sviluppando una nuova metodologia di imaging dal vivo che combina i metodi genetici del mouse con l'etichettatura fluorescente con l'imaging live in confocale di scaffali palatali esplorati.

In primo luogo, per visualizzare i comportamenti cellulari dinamici nelle cellule epiteliali del palato durante la fusione del palato, abbiamo generato un mouse reporter specifico epiteliale attraversando i topi flox ROSA26-mTmG con i topi Keratin 14 -cre 14 , 15 . L'imaging in diretta confocale della cultura esplante del palato degli embrioni risultanti ha confermato alcuni comportamenti cellulari proposti in precedenza e ha identificato nuovi eventi nel processo di fusione 6 . Le protuberanze della membrana delle cellule epiteliali hanno preceduto il contatto cellulare iniziale seguito da convergenza epiteliale mediante intercalazione delle cellule e spostamento delle cellule oronasali. Notevolmente, abbiamo anche scoperto che l'estrusione cellulare, un processo segnalato per svolgere ruoli importanti nell'omeostasi epiteliale, è stato un meccanismo importante che porta la fusione dei palati secondari del mouse 6 , 16 . Questo metodo di imaging può essere utilizzato con altre linee di reporter; Abbiamo utilizzato i topi transgenici Lifeact-mRFPruby 17 , 18 per esaminare le dinamiche citoscheletriche dell'atina durante il processo di fusione. Altri giornalisti possono anche essere impiegati per osservare altri aspetti specifici della fusione di palato e questo metodo può essere adattato sia alla microscopia confocale a scansione laser che alla microscopia confocale del disco di filatura, a seconda delle esigenze di imaging e della disponibilità del microscopio. L'imaging in diretta sta diventando sempre più un approccio fondamentale nella biologia dello sviluppo. PartiLa morfogenesi craniofacialica è complessa e le difese di nascita umane che colpiscono il viso sono comuni. Questo metodo di imaging live in confocale aiuterà a consentire una migliore comprensione dei meccanismi fondamentali di sviluppo fondamentali e delle origini delle anomalie craniofacciali umane.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti su animali sono stati eseguiti in conformità ai protocolli dell'Università della California a San Francisco, istituto di cura e uso degli animali.

1. Preparazione di Media Live Imaging

  1. Preparazione di supporti di coltura liquida
    1. Aggiungere 20% di siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 U / mL penicillina, 100 μg / mL streptomicina, 200 μg / mL acido L-ascorbico, 15 mM HEPES a Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 media.
      NOTA: Il supporto di imaging live è stato appena fatto prima dell'immagine. Questo supporto contiene fenolo-rosso che può portare alla fototossicità lungo i corsi di imaging in tempo reale. Sostituendo per i media senza fenolo-rosso può migliorare l'imaging a lungo termine.
  2. Preparazione della soluzione di agarosio a bassa fusione
    1. Sciogliere 350 mg di agarosio a basso contenuto di fusione in 10 ml di acqua distillata autoclavata per ottenere una soluzione di riserva del 3,5%.
    2. Mescolare bene la soluzione agarosica e incubare a 70 ° C in un bagno d'acqua per sciogliere completamente l'agarosio.
    3. Riscaldare la soluzione agarosica in un bagno d'acqua di 37 ° C prima di aggiungerlo al supporto di imaging in diretta.
    4. Aggiungere 1 ml della soluzione di stock di agarosio a 5 ml del mezzo di imaging vivente liquido per ottenere una concentrazione finale (0,6%).
    5. Conservare i supporti con agarosio in un bagno d'acqua di 37 ° C per prevenire la solidificazione prematura.

2. Preparazione della cultura esplosiva del palato per l'imaging live

  1. Dissezione degli scaffali palatali secondari E14.5 recentemente aderiti
    NOTA: nella nostra esperienza la fusione di immagini richiede l'avvio con una coppia leggermente aderita di mensole palatine; Questa aderenza evita movimenti esplosivi che impediscono la fusione durante la formazione dell'immagine.
    1. Dissectare gli embrioni di stadio E14.5 in una soluzione salina con tampone fosfato (PBS) e scegliere la proteina fluorescente verde (GFP) - esprimere (daK14-cre; ROSA26-mTmG flox ) o (Red fluorescente proteina) RFP- express (da Lifeact-mRFPruby ) embrioni positivi usando un microscopio di dissezione dotato di lampade fluorescenti. Trasferire il tessuto in un materiale pre-riscaldato di coltura in vivo senza agarosio.
    2. Tagliare la testa dell'embrione e rimuovere l'area superiore del cervello usando due pinze fine n. 5 ( Figura 1 A-C ). Usare una pinza n. 5 per tenere l'embrione mentre l'altro n. 5 pende per tagliare i tessuti extra fuori dagli scaffali palatari.
      NOTA: Le forbici raffinate possono essere usate per tagliare la testa dell'embrione (il primo passo) anziché una pinza No. 5. Tuttavia, due pinze fine No. 5 daranno un migliore controllo per eseguire tagli precisi.
    3. Rimuovere la mandibola attentamente senza danneggiare mensole palatali come mostrato in Figura 1 D e 1E . Per ridurre la possibilità di danneggiare i palati, mantenere la lingua attraverso la dissezione della mandibola, fDopo aver attentamente rimosso la lingua.
    4. Dopo aver rimosso la mandibola e la lingua, esaminare il lato orale del palato secondario con uno stereomicroscopio con fluorescenza per confermare il forte segnale reporter nel MES ( Figura 1 M ).
    5. Disseccare le parti posteriori, tra cui l'indice e lo stelo del cervello dopo aver rimosso la mandibola e la lingua ( Figura 1 F ).
    6. Rimuovere entrambi i maxilla con mensole palatine aderenti ( Figura 1 G ).
    7. Tagliare il tessuto anteriore superiore della ganascia mantenendo intatte sia il palato primario che quello secondario ( Figura 1 H e I ).
    8. Rimuovere il setto nasale sul lato nasale dell'esplosione esponendo la MES.
      NOTA: Queste ultime fasi di dissezione richiedono un'attenta attenzione per non disturbare i contatti tra due ripiani secondari palatali. La rimozione del setto nasale aiutaRidurre il segnale di sfondo da altre aree e ridurre anche il movimento verticale dei tessuti, consentendo immagini stabili ( Figura 1 J-L ).
    9. Dopo aver disseccato gli scaffali palatali, esaminare nuovamente il segnale del reporter della linea mediana per assicurarsi che non vi siano danni allo strato epiteliale tra i tessuti.
  2. Impostazione di esplanti del palato nel piatto di coltura con supporti di imaging live
    1. Mettete i supporti di imaging in diretta in un piatto di fondo in vetro da 35 mm.
    2. Mettete le mensole palatali scoperte rivolte verso il basso come vicino al fondo del vetro, per quanto possibile per l'imaging con un microscopio confocale invertito ( Figura 1 N ).
    3. Posizionare i pellets di ghiaccio secco su una superficie conduttiva vicina al piatto di coltura per accelerare la solidificazione agarosa diminuendo rapidamente la temperatura o mettere il piatto di coltura a 4 ° C. Una piastra fredda, come quella utilizzata per l'inserimento di paraffina, potrebbe anche essere utilizzata a questo stage.
      NOTA: quando si utilizza ghiaccio secco, il cambiamento di agarosio deve essere monitorato con attenzione per evitare il congelamento.

3. Confocal Time-lapse Imaging di Palate Explant

  1. Imaging e acquisizione dati
    1. Dopo che l'agarosio è stato semi-solidificato, montare il piatto di coltura in un microscopio confocale invertito dotato di camera di incubazione a 37 ° C. Utilizzare un microscopio confocale a luce bianca e un microscopio confocale a spinning del disco di osservazione delle cellule.
      NOTA: Abbiamo utilizzato un supporto modificato contenente 15 mM HEPES senza gas CO 2 .
    2. Mettere la gelatina di petrolio tra il piatto di coltura e la copertura usando una siringa per evitare l'evaporazione dei supporti ( Figura 1 N ).
      NOTA: Alcune condensazioni in cima alla copertura del piatto di coltura dopo la coltura durante la notte (O / N) si verificano ma il volume dei supporti non cambia, suggerendo che la gelatina di petrolio evita che i media si evaporino.
    3. Individuare la regione di interesse con obiettivi di ingrandimento ridotti (10x) e utilizzare obiettivi di ingrandimento più elevati (obiettivo 20x con zoom digitale 3x o obiettivo 40x con Immersol W) per l'imaging in tempo reale.
      NOTA: I ripiani secondari secchi secondari non sono piatti. Il palato secondario è una struttura curva e questo rende difficile l'immagine dell'intera MES nello stesso piano. L'imaging a basso ingrandimento (10x) può consentire l'imaging completo del palato, ma gli obiettivi 40x forniranno una migliore risoluzione delle immagini per esaminare movimenti cellulari dettagliati in posizioni più profonde Z. La curvatura è alta nella regione del palato medio. Il palato anteriore e posteriore sono relativamente piatti rispetto al palato medio. Spesso immaginiamo verso la metà anteriore del palato secondario per evitare regioni di massima curvatura.
    4. Scansiona più stack Z con 5 μm ogni passo per 16-24 ore usando una giusta eccitazione laser (488 nm per GFP e 532/561 nm per RFP) ( Figura 2 ).
      NOTA: Per ridurre la fototossicità potenziale, utilizzare il minimo potere laser e il tempo di esposizione. Ciò è importante soprattutto in caso di imaging multicolore. Utilizza il 22% del 552 nm di potenza laser per la membranaTomato (mT), il 30% della potenza laser di 495 nm per la membranaGFP (mG) e il 25% della potenza laser 561 nm per la membranaRFP. Il tempo medio di esposizione era di 550 ms.
    5. Utilizzare il software di analisi delle immagini per eseguire il monitoraggio delle celle e l'analisi quantitativa.

4. Analisi delle immagini dei dati

NOTA: qui, è stato usato Imaris. Analisi analoghe di dati possono anche essere eseguite con pacchetti software ImageJ o Volocity.

  1. Rendering di superfici tridimensionali (3D) dalle sequenze di immagini.
    NOTA: Questa sezione consente di generare una superficie da un filmato generato con un segnale GFP a membrana.
    1. Fai clic su Modifica | Mostra la regolazione del display e utilizzare il cursore di istogramma per regolare l'intensità del segnale in modo che il segnale della membrana sia chiaroFuori la lunghezza del film ( Figura 3 A ).
    2. Correggere il segnale sbiancato utilizzando l'immagine Lavorazione | Correzione di attenuazione . Regolare i valori di Intensità anteriore e Intensità in modo che il segnale della membrana sia chiaro per tutta la lunghezza del filmato. Alcuni tentativi ed errori potrebbero essere necessari per l'impostazione di questi valori.
      NOTA: Il valore di Intensità Indietro (profondità Z) sarà inferiore al valore dell'intensità del fronte (valore della superficie Z) a causa della limitata penetrazione del laser. Questi valori possono quindi essere modificati anche per normalizzare l'intensità del segnale nella serie Z. Entrambi i valori possono essere regolati per ottenere la correzione della candeggina. La correzione dell'attenuazione è anche chiamata correzione dell'attenuazione delle emissioni 19 .
    3. Per generare una superficie dal segnale della membrana, selezionare Surpass | Superfici , scegli un canale di origine e un tipo di soglia (intensità assoluta) e sotto le impostazioni di algoritmolect Segmentare solo una Regione di Interesse E infine il processo dell'intera immagine , seguito dalla scorrimento della freccia in avanti; Continuare a spingere la freccia in avanti (utilizzare le impostazioni predefinite o specificare i livelli di dettaglio della superficie di superficie e il metodo di soglia di soglia per prova ed errore), verificando se la superficie generata rifletta il segnale di fluorescenza. Per specificare una regione di interesse, selezionare la regione e le ore da rendere tratteggiando le posizioni X, Y, Z.
      NOTA: selezionare Processo dell'intera immagine finalmente in modo che le regolazioni e le soglie saranno applicate in tutto il filmato.
    4. Creare una superficie facendo clic nuovamente sul pulsante freccia in avanti. Quindi regolare la soglia cambiando l'istogramma in Filtri per corrispondere al segnale della membrana.
    5. Dopo la generazione della superficie, scegliere la superficie in Superfici / Impostazioni per visualizzare il segnale di superficie e completare il processo di generazione della superficie spingendo il doppio forwPulsante freccia ARD ( Figura 3 B ).
    6. Vai a Surface | Modificare e fare clic su Maschera tutte le Proprietà maschera per generare un'immagine di canale mascherata.
    7. Dopo aver fatto clic su OK, la finestra Maschera si apre automaticamente; Selezionare il canale GFP, impostare voxels al di fuori della superficie al valore massimo di intensità del segnale (trovato nella regolazione Edit | Display ) e voxels all'interno della superficie al valore minimo di intensità GFP Modifica | Regolazione della visualizzazione ), in Impostazioni maschera per generare una maschera del segnale a membrana.
    8. Poiché la maschera del segnale della membrana verrà visualizzata in visualizzazione Volume , generare immagini invertite usando Image Processing | Contrasto cambiamento Inverti ( Figura 3 C ).
  2. Individuazione di macchie da immagini in superficie invertita.
    NOTA: questa sezione consente di avere il centro di ciascuna cellaContrassegnato da un punto unico e tracciato nello spazio e nel tempo.
    1. Seleziona Scena superamento. | Spots | Crea ; In Impostazioni di algoritmo selezionare il segmento solo una regione di interesse , il processo dell'intera immagine in ultima analisi e le tracce di punti (nel tempo) .
    2. Fare clic sulla freccia in avanti e specificare una Regione di interesse; Selezionare la regione e le ore per la traccia delle macchie; Continuare a spingere la freccia in avanti, scegliere il canale mascherato come canale di origine e determinare il diametro stimato di punti XY.
    3. Facendo clic sul pulsante freccia in avanti si apre automaticamente una finestra del filtro; Regolare la soglia di rilevamento del puntatore modificando i valori nell'istogramma per generare punti singoli al centro di ciascuna cella ( Figura 3 D ).
    4. Facendo clic sul pulsante freccia in avanti si apre la finestra Algoritmo , scegliete il modello di monitoraggio del movimento autoregressivo 20 e specificate il massimo tracking diPosizione e la dimensione massima del gap per collegare tracce che divengono discontinue per un breve periodo di tempo.
    5. Facendo nuovamente clic sul pulsante freccia in avanti si apre la finestra Filtri, imposta la soglia di durata della traccia regolando l'istogramma in modo che ogni cella venga tracciata. Facendo clic sul pulsante a doppia freccia avanti, verrà finalizzato il rilevamento del punto.
    6. Per correggere la deriva del tessuto, fare clic su Spots | Track Editor e selezionare Corretto Drift . Una finestra di algoritmo si apre automaticamente; Selezionare la deriva di transizione selezionata , Includi intero risultato e Correggere le posizioni degli oggetti .
  3. Generazione di diagrammi per analisi quantitativa.
    NOTA: Lo Scatterplot del programma è uno strumento per generare grafici multidimensionali (X, Y, Z, Color e Scala) con più oggetti. Queste trame sono utili per visualizzare le tendenze di molti movimenti di cellule nel tempo.
    1. Rendere 2D o 3D le tracce dei dati di tracciamento delle celle usando il comandoVantage-Aggiungi nuovo menu di trama Vantage ( Figura 3 E e 3F ).
    2. Seleziona Volume o Spots e scegli Crea / Categoria e Plot Type
    3. Regolare i valori di trama per generare diversi grafici Vantage.
    4. Esportare i grafici utilizzando la funzione Snapshot .
      NOTA: i dati statistici possono anche essere esportati come fogli di calcolo per ulteriori analisi quantitativa facendo clic su Plot Numbers Area | Salva .

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Risultati

L'imaging in vivo della cultura esplante del palato ha rivelato molteplici processi cellulari che mediano la fusione dei palati 6 . I contatti iniziali tra due cellule epiteliali sono fatti da protuberanze a membrana ( Figura 2 B-2E ). Quando due strati epiteliali si incontrano, formano una MES stratificata a più cellule seguita da intercalazione per creare un unico MES a livello cellulare integrato attraverso la ...

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Discussione

L'imaging in tempo reale della morfogenesi tissutale con la cultura dell'esplosivo dell'organo 3D può fornire informazioni dettagliate sui processi cellulari che non possono essere mostrati in analisi convenzionali di colorazione delle sezioni dei tessuti fissi. Utilizzando la cultura esplante in vitro del palato secondario embrionale del mouse, abbiamo osservato diversi comportamenti cellulari interessanti che ci hanno portato a proporre un nuovo meccanismo di fusione di palato che coinvolge la con...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo M. Douglas Benson per le prime conversazioni riguardanti l'imaging secondario del palato. Riconosciamo anche David Castaneda-Castellanos (Leica) e Chris Rieken (Zeiss) per il loro aiuto per regolare le condizioni di imaging in microscopia confocale. Apprezziamo Lynsey Hamilton (Bitplane) per suggerimenti utili per l'analisi quantitativa di immagini utilizzando il software Imaris. Questo lavoro è stato finanziato da NIH / NIDCR R01 DE025887.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti
DMEM/F12Tecnologia di vita11330-032
Siero fetale bovino Tecnologiadi vita16000-044
L-glutamminaTecnologia di vita25030-081
Acido L-ascorbicoSigmaA4544-100G
Penniccia/StreptomicinaLife technology15140-122
Basso punto di fusione agarosioBioExpressE-3111-125
Piatto con fondo in vetro da 35 mmMatTekP35G-1.5-10-C
Gelatina di Petrolieum (vaselina)Sigma16415-1Kg
Mice
Keratin14-creMGI: J:65294Allele = Tg(KRT14-cre)1Amc<
em>ROSA26mTmGMGI: J:124702Allele = Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo
Lifeact-mRFPrubyMGI: J:164274Allele = Tg(CAG-mRuby)#Rows
Microscope
White Light SP5 microscopio confocaleLeica Microsystems
Cell Observer microscopio confocale a disco rotanteZeiss Microscopy

Riferimenti

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