Articolo metodologico

Screening delle nanoparticelle bioattive in cellule immunitarie fagocitiche per gli inibitori della segnalazione di ricetrasmettitori simili

DOI:

10.3791/56075

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26 luglio 2017

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1Department of Respiratory Medicine, Shanghai First People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 2Department of Pediatrics, BC Children's Hospital and University of British Columbia

In questo articolo

Sommario

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La segnalazione di TLR (Toll-like receptor) ha un ruolo importante nella fisiopatologia di molte malattie infiammatorie umane e la regolazione delle risposte TLR mediante nanoparticelle bioattive è prevista per essere vantaggiosa in molte condizioni infiammatorie. Le cellule reporter THP-1 forniscono una piattaforma di screening versatile e robusta per identificare nuovi inibitori della segnalazione TLR.

Abstract

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La regolazione farmacologica delle risposte Toll-like (TLR) risponde molto nel trattamento di molte malattie infiammatorie. Tuttavia, sono stati finora disponibili composti limitati per attenuare la segnaletica TLR e non sono stati utilizzati inibitori TLR clinicamente riconosciuti (ad eccezione dell'idrochlorochina anti-malaria droga) nell'uso clinico. Alla luce dei rapidi progressi nella nanotecnologia, la manipolazione della reattività immunitaria utilizzando dispositivi nano può fornire una nuova strategia per trattare queste malattie. In questo esempio, presentiamo un metodo di screening ad alta velocità per identificare rapidamente nuove nanoparticelle bioattive che inibiscono la segnalazione TLR nelle cellule immunitarie fagocitiche. Questa piattaforma di screening è stata costruita su cellule reporter THP-1 con test di colore e luciferasi. Le cellule reporter sono costruite dalla linea cellulare monocitica umana THP-1 mediante l'integrazione stabile di due costruttori reporter indotti. Uno esprime un gene secretato ematico alcalino fosfatasi (SEAP)Sotto il controllo di un promotore indotta dai fattori di trascrizione NF-κB e AP-1 e l'altra esprime un gene reporter del luciferasi secreto sotto il controllo di promotori indotti da fattori di regolazione dell'interferone (IRF). Su stimolazione TLR, le cellule reporter attivano Fattori di trascrizione e successivamente producono SEAP e / o luciferasi, che possono essere rilevati utilizzando i relativi reagenti del substrato. Utilizzando una biblioteca di ibridi peptidi-oro nanoparticelle (GNP) stabiliti nei nostri studi precedenti, abbiamo individuato un ibrido peptidico-GNP che potrebbe inibire efficacemente i due bracci della cascata di segnalazione TLR4 innescata dal suo ligando prototipo, lipopolisaccaride (LPS). I risultati sono stati convalidati da tecniche biochimiche standard incluso l'immunoblotting. Ulteriori analisi hanno stabilito che questo ibrido di piombo ha un ampio spettro inibitore, che agisce su più vie TLR, tra cui TLR2, 3, 4 e 5. Questo approccio sperimentale consente una rapida valutazione del whetheNanoparticle (o altri composti terapeutici) può modulare la segnalazione specifica di TLR nelle cellule immunitarie fagocitiche.

Introduzione

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Ricordi simili (TLR) sono uno degli elementi chiave del sistema immunitario innato che contribuisce alla prima linea di difesa contro le infezioni. I TLR sono responsabili del rilevamento di patogeni invasivi riconoscendo un repertorio di pattern molecolari associati ad agenti patogeni (o PAMP) e reazioni di difesa di montaggio attraverso una cascata di trasduzione del segnale 1 , 2 . Ci sono 10 identificatori TLR umani identificati; Tranne TLR10 per il quale il ligando non è ancora chiaro, ogni TLR può riconoscere un distinto, conservato gruppo di PAMP. Ad esempio, TLR2 e TLR4, localizzati principalmente sulla superficie cellulare, possono rilevare lipoproteine ​​e glicolipidi da batteri Gram-positivi e Gram-negativi rispettivamente; Mentre TLR3, TLR7 / 8 e TLR9, presenti principalmente nei compartimenti endosomali, possono rilevare prodotti RNA e DNA da virus e batteri 3 . Quando stimolato da PAMP, TLR innescano risposte immunitarie essenziali rilasciando pro-infMediatori lammatori, reclutare e attivare le cellule immunitarie effettive e coordinare i successivi eventi immunitari adattativi 4 .

La trasduzione di segnalazione TLR può essere semplicemente classificata in due percorsi principali 5 , 6 . Uno dipende dal fattore di differenziazione mieloide della proteina dell'adattatore 88 (MyD88) - il percorso dipendente da MyD88. Tutti i TLR, ad eccezione di TLR3, utilizzano questo percorso per attivare il fattore nucleare kappa-light-chain-enhancer delle cellule B attivate (NF-κB) e mitogen-associate proteine ​​chinasi (MAPK), portando all'espressione di mediatori pro-infiammatori come TNF- Α, IL-6 e IL-8. Il secondo percorso utilizza l'interferone-β (TRIF) che induce l'adattatore che contiene il dominio TIR - il percorso indipendente dal TRIF o MyD88 - per attivare i fattori regolatori interferon (IFN) e NF-κB, con conseguente produzione di Tipo I IFN. Segnalazione TLR intattaÈ fondamentale per la nostra protezione quotidiana dalle infezioni microbiche e virali; I difetti nei percorsi di segnalazione TLR possono portare ad un'immunodeficienza e spesso sono dannosi per la salute umana. 7

Tuttavia, la segnalazione TLR è una "spada a doppio taglio" e un'eccessiva attivazione TLR non controllata è dannosa. Le risposte TLR overattive contribuiscono alla patogenesi in molte malattie infiammatorie acute e croniche 8 , 9 . Per esempio, la sepsi, caratterizzata da infiammazioni sistemiche e da lesioni multi-organi, è dovuta principalmente alle risposte immunitarie acute e superiori alle infezioni, con TLR2 e TLR4 che svolgono un ruolo cruciale nella patofisiologia delle sepsi 10 , 11 , 12 . Inoltre, TLR5 è stato trovato per contribuire all'infiammazione polmonare cronica dei pazienti con fibrosi cistica 13, 14 . Inoltre, la segnalazione TLR endosomale non corretta (es., TLR7 e TLR9) è fortemente associata allo sviluppo e alla progressione di diverse malattie autoimmuni, tra cui il sistema lupus eritematoso (SLE) e l'artrite reumatoide (RA) 15 , 16 . Queste linee di prova convergenti identificano la segnalazione TLR come un potenziale obiettivo terapeutico per molte malattie infiammatorie 17 .

Anche se la regolazione farmacologica delle risposte TLR è prevista per essere vantaggiosa in molte condizioni infiammatorie, purtroppo attualmente esistono pochissimi composti clinicamente disponibili per inibire la segnalazione TLR 9 , 17 , 18 . Ciò è dovuto in parte alla complessità e alla ridondanza dei percorsi TLR coinvolti nell'omeostasi immunitaria e nella patologia della malattia. Pertanto, alla ricerca di romanzo, potenGli agenti terapeutici che mirano ad individuare più percorsi di segnalazione TLR potrebbero colmare un divario fondamentale e superare la sfida di avanzare gli inibitori TLR nella clinica.

Alla luce dei rapidi progressi della nanoscienza e della nanotecnologia, le nanotecnologie emergono come modulatori TLR di nuova generazione a causa delle loro proprietà uniche 19 , 20 , 23 . La dimensione della nanoscala permette a queste nano-terapeutiche di avere una migliore distribuzione bio e una circolazione sostenibile 24 , 25 , 26 . Possono essere ulteriormente funzionalizzati per soddisfare i profili farmacodinamici e farmacocinetici desiderati 27 , 28 , 29 . Più emozionante, la bio-attività di queste novità nanodispositivi deriva dalle loro proprietà intrinseche, che possono essere personalizzate perSpecifiche applicazioni mediche, piuttosto che semplicemente agire come veicolo di consegna per un agente terapeutico. Ad esempio, una nanoparticella di tipo lipoproteina ad alta densità (HDL) è stata progettata per inibire la segnalazione TLR4 mediante scavenging del TLR4 ligando LPS 23 . Inoltre, abbiamo sviluppato un sistema ibrido a nanoparticelle peptide-oro, in cui i peptidi decorati possono alterare le proprietà superficiali delle nanoparticelle d'oro e consentire loro di avere varie attività bio-attività 30 , 31 , 32 , 33 . Questo li rende una classe speciale di droga (o "nano-droga") come la nano-terapeutica di nuova generazione.

In questo protocollo, presentiamo un approccio per identificare una nuova classe di ibridi peptidi-nanoparticelle (peptide-GNP) che possano inibire potentemente in molti percorsi di segnalazione TLR nelle cellule immunitarie fagocitiche 32 , 33 . L'approccio si basa sulle linee cellulari reporter THP-1 commercialmente disponibili. Le cellule reporter sono costituite da due costrutti reporter stabili e innescati: uno porta un gene secretato di ematogenica alcalina fosfatasi (SEAP) sotto il controllo di un promotore indottabile dai fattori di trascrizione NF-κB e dalla proteina 1 dell'attivatore (AP-1); L'altro contiene un gene segreto del reporter del luciferasi sotto il controllo di promotori indotti da fattori di regolazione dell'interferone (IRF). Sulla stimolazione TLR, la trasduzione del segnale porta all'attivazione di NF-κB / AP-1 e / o IRFs, che accendono i geni del reporter in segreto SEAP e / o luciferasi; Tali eventi possono essere facilmente rilevati utilizzando i relativi reagenti del substrato con uno spettrofotometro o un luminometro. Utilizzando questo approccio per schermare la nostra biblioteca precedentemente stabilita di ibridi peptidici GNP, abbiamo individuato i candidati di piombo che possono inibire potentemente i percorsi di segnalazione TLR4. L'attività inibitoria del peptide-Ibridi GNP sono stati quindi convalidati utilizzando un altro approccio biochimico di immunoblotting e valutato su altri percorsi TLR. Questo approccio consente una rapida e efficace screening di nuovi agenti che mirano a percorsi di segnalazione TLR.

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Protocollo

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1. Preparazione dei mezzi di coltura cellulare e dei reagenti

  1. Preparare il mezzo completo di coltura cellulare R10 aggiungendo i supplementi del 10% di siero fetale bovino (FBS), 2mM L-glutammina e 1mM di piruvato di sodio nel mezzo RPMI-1640.
    1. Preparare il mezzo di coltura di selezione R10-Z aggiungendo gli antibiotici Zeocin (200 μg / mL) a R10 per mantenere l'espressione di SEAP sotto il controllo dell'attivazione NF-κB / AP-1. Per selezionare le cellule che esprimono entrambi i geni del reporter del SEAP e della luciferasi, aggiungere sia il Zeocin (100 μg / mL) e il blasticidina (10 μg / mL) a R10 (come R10-ZB).
  2. Preparare la soluzione di substrato SEAP sciogliendo una bustina di polvere substrato (es., Quanti-blu) in 100 mL ultrapura, acqua libera endotossina in un pallone di 125 mL pulito vetro.
    1. Versare la soluzione delicatamente e incubare a 37 ° C per 1 ora per assicurare la completa dissoluzione dei substrati.
    2. Filtrare la soluzione usando una membrana da 0,2 μm per assicurarne la sterilità (facoltativa) e conservarla a 4 ° C fino a 2 settimane prima dell'uso.
  3. Preparare la soluzione del substrato di luciferasi sciogliendo una sacca del polimero del substrato ( es . QUANTI-Luc) in 25 ml di ultrapure, acqua senza endotossina in un tubo centrifugo sterile da 50 ml.
    1. Dopo aver completamente sciolto la polvere, usa subito la soluzione. In alternativa, conservare la soluzione a 4 ° C (fino a una settimana) oa -20 ° C (fino a un mese) prima dell'uso.
      ATTENZIONE: entrambe le soluzioni del substrato sono sensibili alla luce e dovrebbero evitare l'esposizione della luce quando è possibile. I cicli di congelamento e disgelo multipli della soluzione possono causare instabilità del substrato e accorciare la durata.
  4. Preparare la soluzione di base di 12-myristate 13-acetato di forbol (PMA) in dimetilsolfossido di tipo molecolare (DMSO) per avere una concentrazione di 500 μg / mL. Fare aliquote della soluzione stock (10 μL in un tubo da 500 μl) e conservarli a -20 ° C.
  5. Preparare la soluzione di stock LPS (E-coli K12) in acqua sterile, endotossina libera a una concentrazione di 5 mg / ml, e preparare aliquote per una conservazione a lungo termine a -20 ° C. Preparare una soluzione LPS funzionante diluendo il LPS di riserva in soluzione salina fosfata (PBS) a una concentrazione di 100 μg / mL e conservare a -20 ° C prima dell'uso.
    ATTENZIONE: la preparazione del reagente per usi culturali deve essere effettuata in un armadio per la biosicurezza e tutti i contenitori devono essere sterilizzati prima dell'uso. Occorre evitare cicli di congelamento e disgelo ripetuti di soluzioni PMA e LPS.

2. Cultura dei macrofagi derivanti da cellule reporter THP-1

  1. Utilizzare due linee THP-1 reporter: THP-1-XBlue e THP-1-Doppie cellule. Il primo ha un gene del giornalista SEAP controllato da NF-κB / AP-1, e quest'ultimo ha un sistema duplice reporter, lo stesso gene reporter del SEAP e un gene luciferasi controllato da IRF. IlLe procedure di cultura ir sono identiche tranne il mezzo di coltura di selezione.
    1. Sciogliere uno stock di cellule di lavoro (~ 5 x 10 6 cellule) in 10 ml di mezzo R10, spin giù le cellule a 300 xg per 5 min. Riposizionare le cellule in 10 ml di mezzo R10 e trasferirle in un pallone di coltura T75. Scambiare il mezzo di coltura ogni 2-3 giorni fino a raggiungere una densità di 1 x 10 6 cellule / mL.
    2. Quando la crescita delle cellule raggiunge la sua capacità, le cellule di passaggio riducono la densità cellulare in un'intervallo di 2-5 x 10 5 cellule / ml, in modo che le cellule possano continuare a crescere.
    3. Dopo almeno un passaggio, iniziare a coltivare le cellule nel mezzo di selezione della selezione: R10-Z per THP-1-XBlue e R10-ZB per THP-1-Dual. Dopo aver coltivato le cellule con terreno di coltura di selezione per almeno un passaggio, le cellule sono pronte per l'esperimento.
      ATTENZIONE: il sovraccarico cellulare può portare a morte cellulare significativa; La vitalità delle cellule dovrebbe mantenere> 98%. Mantenere un record del numero di passaggio come celPuò comportarsi diversamente dopo molti passaggi (> 20 passaggi).
      NOTA: le fiale della coltura cellulare possono essere riutilizzate più volte per risparmiare i costi; Tuttavia, questa pratica può aumentare il rischio di contaminazione generale e di contaminazione incrociata tra diverse fiasche (se trattano diverse linee cellulari contemporaneamente). Durante lo scambio di mezzi e il passaggio cellulare, la centrifugazione viene impostata a 300 xg per 5 min.
  2. Per eseguire il test di cellule reporter, le cellule di seme in una piastra di coltura di cellule a fondo piano a 96 pozzetti e li differenziano in macrofagi. Le procedure sono descritte nel seguito.
    1. Trasferire le cellule dal pallone in un tubo di centrifuga, centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti e risospenderle nel mezzo R10 ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / mL. Aggiungere aliquote della soluzione PMA nelle sospensioni cellulare con una concentrazione finale di 50 ng / mL.
    2. Trasferire 100 μL delle sospensioni cellulari in ogni pozzetto del 96-weLl utilizzando una pipetta multicanale. Incubare la piastra a 37 ° C (in un incubatore di coltura cellulare) per 24 h.
    3. Dopo l'incubazione, rimuovere attentamente il mezzo di coltura usando un aspiratore di vuoto (o con una pipetta multicanale) e lavare delicatamente le cellule con PBS (100 μL / pozzetto) due volte; Aggiungere 100 μl di mezzo fresco R10 in ciascun pozzetto. Riposare le cellule per 2 giorni in un incubatore prima di condurre il test del reporter.
      ATTENZIONE: la fase di riposo è molto importante per consentire alle cellule di calmarsi dopo la stimolazione PMA al loro normale stato tranquillo. Ciò può ridurre significativamente i segnali di sfondo dei geni del reporter in condizioni non stimolate.
      NOTA: Dopo 24 anni di stimolazione con PMA, le cellule sono differenziate in fenotipo macrofagi, con una caratteristica di adesione cellulare nella parte inferiore del pozzetto e una caratteristica morfologica di pseudopodi.

3. Screening per potenziali inibitori nano TLR4 utilizzando le cellule Reporter

NOTA: poiché la segnalazione TLR4 utilizza sia percorsi dipendenti da MyD88 che dipendenti da TRIF, viene selezionata come obiettivo primario per comprendere una vasta gamma di percorsi di segnalazione TLR. Le cellule reporter THP-1-XBlue vengono utilizzate per esaminare principalmente l'attivazione NF-κB / AP-1 mentre le cellule THP-1-Dual sono per l'attivazione di IRF dalla trasduzione del segnale TRIF-dipendente.

  1. Identificare la dose ottimale di LPS generando una curva dose-risposta prima dello screening.
    1. Diluire la soluzione LPS di lavoro a una concentrazione finale di 0,01-100 ng / mL nel mezzo R10 (fare la diluizione nella scala log10). Disporre il disegno della piastra e fare la diluizione in una piastra di coltura a tondo da 96 pozzetti. Assicurarsi che ogni pozzetto abbia almeno 110 μL di soluzione dopo diluizione.
    2. Rimuovere delicatamente il mezzo di coltura dalla piastra a cellule (da 2.2.3) usando un aspirapolvere a vuoto.
    3. Trasferire il mezzo di R10 contenente LPS preparato nella piastra di diluizione (3.1.1) iNella piastra di coltura secondo la disposizione dei campioni. Incubare la piastra a 37 ° C (in un incubatore di coltura cellulare) per 24 h.
    4. A 24 h, trasferire con attenzione i supernatanti (80 μL / pozzetto) in una nuova piastra a tondino a 96 pozzetti. Eseguire immediatamente il dosaggio della luminescenza colorimetrica e / o luciferasi su queste soluzioni o conservarle a 4 ° C (diverse ore) oa -20 ° C (giorni) prima dello sviluppo del dosaggio.
      NOTA: la progettazione del layout delle piastre dovrebbe essere semplice e chiara per l'esperimento e l'analisi dei dati. Per ogni condizione, occorre considerare 2-4 repliche. Includere sempre un gruppo di controllo negativo (LPS null). Si raccomanda di utilizzare le cellule THP-1-XBlue per l'attivazione di NF-κB / AP-1, poiché le doppie cellule hanno un background relativamente elevato di attivazione NF-κB / AP-1 dopo essere stati differenziati in macrofagi. Tuttavia, è possibile utilizzare le celle doppie per segnalare sia l'attivazione NF-κB / AP-1 e IRF.
  2. Sviluppare il coloreEsame imetrico per l'attivazione di NF-κB / AP-1 e il test di luminescenza luciferasi per l'attivazione di IRF.
    1. Per valutare l'attivazione di NF-κB / AP-1, trasferire 20 μL di supernatante di ogni campione in una nuova piastra di coltura piatta a 96 pozzetti; E aggiungere 180 μL di soluzione di substrato pre-riscaldata in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C per 1 - 2 h per consentire lo sviluppo del colore (rosa al blu scuro). Raccogliere l'assorbimento a 655 nm su un lettore di piastre.
      ATTENZIONE: il tempo di incubazione può essere variato in base allo sviluppo del colore (da 30 minuti fino all'incubazione di notte). Si consiglia di attendere che la densità ottica (OD) del colore più scuro raggiunga il livello di 1, evitando la saturazione dello sviluppo del colore (OD> 3).
    2. Per l'analisi dell'attivazione IRF, trasferire 10 μL di supernatante di ciascun campione in una piastra bianca piatta piano a 96 pozzetti. Aggiungere la soluzione luciferasi (50 μL) e raccogliere immediatamente la luminescenza wEll per bene.
      NOTA: Si raccomanda di utilizzare un lettore di luminescenza con una funzione di auto-iniezione per garantire la consistenza della luminescenza di lettura da pozzo a pozzo e da piastra a piastra. Se le soluzioni del substrato vengono iniettate manualmente, assicurati un tempo di incubazione costante e una lettura di ogni pozzetto.
  3. Eseguire il test di screening su vari ibridi peptidici GNP con 10 ng / mL stimolazione LPS (basata su 3.1). Seguire la stessa procedura di 3.2 per lo sviluppo del test del reporter.
    1. Concentrare i peptidi-GNP ibridi a 200 nM nel mezzo R10 utilizzando il metodo di centrifugazione. Centrifugare 20 volumi della soluzione ibrida (10 nM) a 18.000 xg per 30 minuti e scartare con attenzione i supernatanti. Raccogliere gli ibridi (nella parte inferiore del tubo) in un tubo, lavare con PBS due volte e ri-sospendere gli ibridi in un unico volume del mezzo R10.
    2. Mescolare i volumi uguali degli ibridi concentrati e delLPS (20 ng / mL) contenente il mezzo R10 per avere una concentrazione finale di ibridi e LPS rispettivamente pari a 100 nM e 10 ng / mL.
    3. Rimuovere il mezzo di coltura dalla piastra colta (2.2.3) e aggiungere 100 μL della soluzione mista in ciascun pozzetto (3 repliche per ogni condizione); Includere un controllo negativo (solo medio) e un controllo LPS (10 ng / mL LPS senza ibridi).
    4. Dopo 24 ore di incubazione a 37 ° C, trasferire il mezzo di ciascun pozzetto in un tubo e centrifugare i tubi a 18.000 xg, 4 ° C per 30 minuti. Raccogliere i supernatanti (50-80 μL / tubo) in una piastra a tondo a 96 pozzetti e eseguire il test del reporter come descritto al punto 3.2.
      ATTENZIONE: quando si scartano i supernatanti dopo la centrifugazione, non agitare gli ibridi nella parte inferiore del tubo.
      NOTA: La centrifugazione nel passaggio 3.3.4 è molto importante per rimuovere ibridi di nanoparticelle non internati dal mezzo di coltura e possono evitare l'interferenza degli ibridi con il coLetture lorimetriche / luminescenza. Questo perché le nanoparticelle d'oro possono assorbire larghe lunghezze d'onda di luce a seconda delle loro dimensioni e agglomerazione.

4. Validazione dell'effetto inibitorio dei candidati potenziali

NOTA: Per confermare l'effetto inibitorio dei candidati potenziali dalla screening, vengono utilizzati due approcci. Uno è quello di esaminare le risposte di dosaggio degli stimolanti (LPS) ad una concentrazione ibrida fissa (o viceversa); L'altro è guardare direttamente l'inibizione dei segnali NF-κB / AP-1 e IRF3 tramite immunoblotting.

  1. Nell'approccio uno, eseguire il test del reporter con 100 nM degli ibridi di piombo e due concentrazioni di LPS a 1 ng / mL e 10 ng / mL seguendo le stesse procedure descritte in 3.3. Includere un ibrido inattivo (basato sui risultati dello screening) come un controllo ibrido per il confronto.
  2. Per l'approccio immunoblotting, seguite le norme eProcedure xperimentali.
    1. Coltivano le cellule THP-1 nel mezzo di R10, seminano le cellule in una piastra di coltura a 12 pozzetti (2 x 10 6 cellule / pozzetto) e li differenziano in macrofagi trattando le cellule con 50 ng / mL di PMA per 24 h seguito da riposo Per 2 giorni.
    2. Dopo la differenziazione cellulare, stimolare le cellule con 10 ng / mL di LPS con / senza ibridi (100 nM) nel tempo (fino a 4 ore). A diversi punti temporali (0, 5, 15, 30, 60, 120 e 240 min) preparare i lisati delle cellule per l'immunoblotting. Includere un ibrido inattivo come controllo.
    3. Sonda i segnali di IκBα, fosforilati p65 e IRF3 fosforilati per esaminare l'effetto inibitorio degli ibridi a piombo sull'attivazione di NF-κB e IRF3. Prova i segnali β-actina e totale IRF3 come controlli interni.
      NOTA: La trasduzione del segnale si verifica spesso molto più velocemente (in poche ore) poi l'espressione degli enzimi del reporter SEAP e luciferasi (24 h). E 'altamente raccomandato anche perforMa il test di viabilità degli ibridi esaminati a 24 h come un altro metodo di convalida.

5. Valutazione della specificità TLR

NOTA: Per esaminare la specificità TLR del peptide piombo-GNP, vengono testati altri percorsi di segnalazione TLR, compresi TLR2, TLR3 e TLR5. TLR7, 8 e 9 sono esclusi perché i macrofagi derivati ​​da THP-1 non rispondono bene alla stimolazione di questi TLR a causa della mancanza di TLR7, 8 e 9 espressione nei macrofagi 34 .

  1. Esaminare diverse concentrazioni (1 ng / mL a 25 μg / mL) dei ligandi specifici per TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (poli I: C) e TLR5 (flagellina) su entrambi i macrofagi derivati ​​da cellule reporter per ottenere la concentrazione ottimale seguendo le stesse Procedura di cui ai punti 3.1 e 3.2.
  2. Trattare le cellule con le miscele dell'ibrido di piombo (100 nM) e ogni ligando TLR alla concentrazione ottenuta da 5.1 per valutare la specificità inibitoria del cavo hYbrid secondo la procedura sperimentale descritta in 3.3. Includere l'ibrido inattivo come un controllo per il confronto.

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Risultati

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L'approccio sperimentale complessivo è illustrato in Figura 1 . Le due linee di reporter THP-1, THP-1-XBlue e THP-1-Dual, vengono utilizzate per velocizzare le risposte TLR analizzando rispettivamente l'attivazione di NF-κB / AP-1 e IRF. L'attivazione di NF-κB / AP-1 può essere rilevata con il saggio colorimetrico SEAP, mentre l'attivazione di IRF viene monitorata mediante luminescenza di luciferasi. Le cellule THP-1 monocitiche possono essere facilmente der...

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Discussione

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Dal momento che i TLR sono coinvolti nella patogenesi di molte malattie infiammatorie, sono emerse come obiettivi terapeutici per la modulazione delle risposte immunitarie e delle condizioni infiammatorie. Tuttavia, lo sviluppo clinico delle terapie per inibire i percorsi di segnalazione TLR ha avuto un successo limitato fino ad oggi. L'idrossiclorochina della droga antimalarica che inibisce TLR7 e TLR9 è in uso clinico 35 , 36 . Analogamente, solo un numero...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno del Programma per il Professore di Appuntamento Speciale (Scholar Orientale) presso le istituzioni di istruzione superiore di Shanghai (HY), il fondo di partenza del primo ospedale popolare di Shanghai (HY), il supporto per la medicina clinica di Gaofeng da Shanghai Jiaotong Università di medicina (HY), e il finanziamento della Fondazione Crohn e Colitis del Canada (CCFC) (SET e HY).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
THP-1-XBlue cellula reporterInvivoGenthpx-spmantiene il passaggio della coltura cellulare sotto i 20
THP-1-Dual repoter cellInvivoGenthpd-nfis mantiene ilpassaggio della coltura cellulare sotto i 20
RPMI-1640 (senza L-glutammina)GE Health CareSH30096.02Riscalda fino a 37 gradi; C prima dell'uso; aggiungere integratori per creare un terreno completo R10
Siero fetale bovino (qualificato)Thermo Fisher Scientific12484028Calore inattivato; 10% in RPMI-1640
L-glutamminaThermo Fisher ScientificSH30034.022 mM nel terreno completo R10
Piruvato di sodioThermo Fisher Scientific11360-0701 mM nel terreno completo R10
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco, 1X, senza calcio, magnesioGE Health CareSH30028.02Utilizzare per il lavaggio cellulare e la preparazione dei reagenti
QUANTI-BlueInvivoGenrep-qb1Substrato SEAP
QUANTI-LucInvivoGenrep-qlc2Substrato della luciferasi
ZeocinInvivoGenant-zn-1Antibiotici di selezione per cellule
BlasticidinaInvivoGenanti-bl-1Antibiotici di selezione per cellule reporter
Dimetilsolfossido (DMSO) per biologia molecolareSigmal-AldrichD8418-100MLUtilizzare per la preparazione dei reagenti
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) per la biologia molecolareSigmal-AldrichP1585-1MGUtilizzare per la differenziazione cellulare
Lipopolisaccaride (LPS) da E. coli K12InvivoGenligando tlrl-eklpsTLR4
Pam3CSK4InvivoGentlrl-pmsligando TLR2/1
Poly (I:C) HMWInvivoGentlrl-picligando TLR3
Flagellina da S. Typhimurium (FLA-ST), ligandoultrapuro InvivoGentlrl-epstflaTLR5
SpectraMax Plus 384 lettore di micropiastreMolecular DevicesN/ALeggi saggio colorimetrico
Lettore di micropiastre multimodale Infinite M200 Pro con iniettoriTecanN/ACentrifuga a lettura luminiscience
Microfuge 22RBeckman CoulterN/AMicrocentrifugatore a temperatura controllata (fino a 18.000 g)
Centrifuga Allegra X-15R BeckmanCoulterN/A Centrifugatorea temperatura controllata per uso generale (per uso su colture cellulari)
Piastra per saggio Costar, bianca a 96 pozzetti con fondo piatto trasparente, trattata con coltura tissutaleCorning Costar3903Utilizzato per il saggio della luminiscenza
reporter

Riferimenti

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